王瑛 李翠玉 張文潔

【摘 要】 目的：對異槲皮苷的多劑量給藥進行研究，初步確定其體內藥動學參數(shù)。方法：建立HPLC-UV法測定異槲皮苷在大鼠血漿中濃度的分析方法，以牡荊素作為內標物，考察異槲皮苷在大鼠體內的藥代動力學特征。色譜柱：Diamonsil C18（150 mm × 4 .6 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-0 .1%甲酸水（35∶[KG-*2]5∶[KG-*2]60，V/V/V）為流動相，檢測波長為360 nm，柱溫：30℃，流速：1 mL/min。大鼠分別給以5 mg/kg，10 mg/kg和20 mg/kg尾靜脈注射異槲皮苷溶液，并于靜脈注射2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、180min后采血，分別置于預先肝素化的EP管中，樣品經(jīng)處理后，注入液相色譜儀進行分析。對所得結果利用3p97藥代動力學軟件進行擬合處理，計算其藥代動力學參數(shù)。結果：三個劑量靜脈給藥后，異槲皮苷在0 .2～80 μg范圍內呈良好的線性關系，r2 > 0 .99。血漿檢測限（LOD，S/N = 3）及定量限（LOQ，S/N = 10）分別為0 .062和0 .203 μg/mL。日內和日間精密度（RSD）分別在2 .3%～7 .2%和2 .8%～7 .7%之間，準確度（RE）在-6 .3%～7 .0%和4 .0%～6 .2%之間。其提取回收率在91 .24%～94 .50%之間。三個劑量的藥代動力學行為均最符合三室開放模型。在給藥劑量5～10mg/kg范圍內，AUC的值成比例增加。此外，藥代動力學參數(shù)α half-life，β half-life，aCL，MRT0→t和MRT0→∞在20 mg/kg與其他劑量的比較中均表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異。結論：研究建立測定大鼠血漿中異槲皮苷含量的高效液相色譜法，該法靈敏度和專屬性較高，經(jīng)方法學驗證，精密度和準確度好、重復性高、專屬性強，符合生物樣品分析的要求，并將其成功的應用于多劑量靜注異槲皮苷后大鼠體內的血漿藥動學研究。

【關鍵詞】 山楂葉；異槲皮苷；大鼠；藥代動力學

【中圖分類號】 R284 .2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2017）09-0027-07

Study on the Pharmacokinetics of Isoquercitrin in Rats Plasma

WANG Ying1 LI Cuiyu2 ZHANG Wenjie2*

1.Maternal and child health care center of Qingyuan Manchu Autonomous County，Qingyuan 113300，China；

2.School of Pharmacy， Liaoning University of TCM， Dalian 116600，China

Abstract：Objective To investigate the pharmacokinetics of isoquercitrin in mice， and determine its preliminary pharmacokinetic parameters . Methods Established an HPLC-UV method using vitexin as internal standard for the determination of isoquercitrin in rat plasma to investigate its pharmacokinetic characters .The analyses were carried out on an analytical Diamonsil C18 column protected by a KR C18 guard column .The mobile phase was consisted of methanol-acetonitrile-0 .1% aqueous formic acid （35∶[KG-*2]5∶[KG-*2]60， v/v/v） .All chromatographic measurements were performed at 30℃ and a flow rate of 1 mL/min with the detection wavelength of 360 nm.The isoquercitrin solution was given to rats via tail vein injection at the dose of 5mg/kg， 10mg/kg and 20mg/kg . Blood samples （0.3 mL） were collected into heparinized tubes from the vena orbitalis at times of 2， 5， 10， 15， 20， 30， 45， 60， 90， 120 and 180 min after intravenous administration and then centrifuged.The pharmacokinetic parameters were calculated by 3p97 software .Results after three doses of intravenous administration， the linear range for plasma was within 0.2 ～ 80 μg/mL with r2 > 0.99 . The limit of detection （LOD， S/N = 3） and the limit of quantification （LOQ， S/N = 10） in plasma were 0 .062 and 0.203 μg/mL， respectively.The RSDs of precision were 2.3% to 7.2% for intra-day assay and 2.8% to 7.7 % for inter-day assay， and accuracy were within -6.3 % ～ 7.0 %， and 4.0% ～ 6.2%， respectively.Its extraction recoveries in plasma were 91.24% ～ 94.50%.The three-compartment open model gave the best fit to the plasma concentration-time curves obtained in rats.The values of AUC increased proportionally within the range of 5-10 mg/kg.Additionally， the pharmacokinetic results of α half-life， β half-life， aCL， MRT0→t and MRT0→∞ showed significant differences between 20 mg/kg and other doses.Conclusion Established an HPLC method for the determination of isoquercitrin in rat plasma.The analytical method after validated presented high sensitivity， specificity， good precision and accuracy with high reproducible， which conformed to the criteria for the analysis of biological sample according to guidance of USFDA， and was successfully applied to pharmacokinetic study of multi-dose intravenous administration of isoquercitrin in rats.

Keywords： Hawthorn Leaves； Isoquercitrin； Rat； Pharmacokinetics

異槲皮苷（isoquercitrin，ISOQ），別名槲皮素-3-O-葡萄糖苷、羅布麻甲素，是一種黃酮類化合物，是山楂葉中的主要活性成分之一。具有豐富的生物學及藥理活性如抗炎[1]，體內外抗氧化活性[2]，對暴露于過氧化氫引起的RGC-5細胞凋亡有明顯的衰減作用，以及對青光眼有治療作用[3]，越來越受到國內外學者的關注。此外，異槲皮苷在多種中草藥中的許多研究方法諸如HPLC-UV[4]，LC-DAD和LC-MS[5]，CZE-UV[6]，SPE-HPLC[7]等均在文獻中有相關報道。異槲皮苷的體內外分析已見報道[8]，然而異槲皮苷的多劑量靜脈給藥分析并未見相關研究。筆者采用內標法的HPLC分析對異槲皮苷的多劑量給藥藥物動力學過程進行分析，為相關的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠，20只，體重（240±20）g，遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，試驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2003-008。實驗中所使用動物嚴格按照實驗室動物保護指導原則進行，所使用動物征得遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會同意。試驗期間自由飲水，大鼠給藥前禁食12～16h。

1.2 藥品 異槲皮苷，內標物牡荊素均為實驗室自制（純度>98%，HPLC）。

1.3 試劑 甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；甲酸（分析純，沈陽市試劑三廠）；冰醋酸（分析純，華北地區(qū)特種化學試劑開發(fā)中心）；磷酸（分析純，沈陽市試劑三廠）；純凈水（娃哈哈有限公司）。

1.4 儀器 Agilent l100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；HH-S水浴鍋（上海永光明儀器設備廠）；十萬分之一天平（瑞士METTLER）；XW-80A微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；XYJ80-2型離心機（金壇市金南儀器廠）；TGL-16C高速臺式離心機（江西醫(yī)療器械廠）；ZDHW電子調溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；微量取樣器（上海榮泰生化工程有限公司）；柱溫箱（大連日普利科技儀器有限公司）；TY10HSC-24A氮吹儀（南京科捷分析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠血漿樣品中異槲皮苷分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（150 mm × 4 .6 mm， 5μm）（迪馬公司，中國北京）；預柱：KR C18（35 mm × 8.0mm， i.d.， 5μm）（大連科技發(fā)展公司）；流動相：甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（35∶[KG-*2]5∶[KG-*2]60，V/V/V）；檢測波長：360 nm；流速：1 mL/min；內標物：牡荊素；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 標準溶液的制備 精密稱取異槲皮苷（圖1）對照品約1.60mg，置10mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，即得濃度160μg/mL對照品儲備液。采用倍數(shù)稀釋法分別配制成7個濃度的對照品溶液，即160.0、40.0、10.0、4.0、1.6、0.8和0.4μg/mL的系列標準溶液，于4℃冰箱保存，備用。

2.1.2.2 內標溶液的制備 取精密稱定的牡荊素（圖2）2.26 mg，置10mL量瓶中，加適量甲醇超聲使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為226μg/mL的內標儲備液。再精密吸取1.0mL內標儲備液置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為22 .6μg/mL的溶液，作為內標，于4℃冰箱保存，備用。

2.1.2.3 空白血漿樣品的制備 取6只空白大鼠（大鼠于取樣前一晚禁食，自由飲水）血漿，充分混合，于-20℃冰箱保存，備用。

2.1.2.4 質控（QC）樣品的制備 精密吸取100μL空白血漿，分別各加入50μL工作溶液（1.2、12、120μg/mL）和10μL內標溶液照“血漿樣品的處理”項下方法處理，制備成低、中、高三種濃度的質控樣品。異槲皮苷血漿濃度分別為0.6、6、60μg/mL，于4℃冰箱保存，備用。

2.1.3 血漿樣品預處理條件的優(yōu)化

2.1.3.1 提取溶劑種類的選擇 取大鼠空白血漿樣品100μL共三組，每組3個，分別置2mL離心管中，依次加入QC標準溶液50μL、內標溶液10μL、乙酸10μL。各組分別加入甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（50：50）各500μL，渦旋1min，離心15min （3500r/min），取上清液，40℃氮氣流下吹干，100μL流動相溶解，渦旋1min，離心5min （10，000r/min），取20μL進樣。分別記錄峰面積，計算提取回收率，結果見表1。綜合考慮各待測組分和內標物回收率，選擇甲醇作為提取溶劑。

取大鼠空白血漿樣品100μL共三組，每組3個，分別置2mL離心管中，依次加入QC標準溶液50μL，內標溶液10μL，乙酸10μL。各組分別加入甲醇400μL，500μL和1000μL，渦旋1min，離心15min （3500r/min），取上清液，40℃氮氣流下吹干，100μL流動相溶解，渦旋1min，離心5min （10，000r/min），取20μL進樣。分別記錄峰面積，計算提取回收率，結果見表2。綜合考慮各待測組分和內標物回收率，選擇500μL甲醇為提取溶劑。

2.1.3.2 酸種類及用量的選擇 取空白血漿樣品，同“提取溶劑種類的選擇”項下操作，分別考察甲酸、乙酸和磷酸對各待測組分的提取回收率的影響，結果見表3。

綜合考慮樣品提取回收率及峰型，結果表明乙酸組效果最好。故繼續(xù)考察不同用量的乙酸對提取回收率的影響。

取空白血漿樣品，同“提取溶劑種類的選擇”項下操作，考察其用量分別為0、10、20μL時對血漿中各待測組分含量測定的影響情況，計算各待測組分的提取回收率。結果見表4。結果顯示乙酸10μL可較好抑制大鼠的血漿樣品中待測組分解離，并有利于改善色譜峰峰形，故選擇乙酸用量為10μL。

2.1.3.3 血漿樣品的處理 經(jīng)過對上述因素的考查，確定了血漿樣本的處理方法：取血漿100μL至預先肝素化的2mL離心管中，依次加入乙酸10μL，內標10μL，甲醇500μL，渦旋1min，離心15min （3500r/min），取上清液，40℃氮氣流下吹干，用100μL流動相溶解，渦旋1min，離心5min （10，000r/min），取20μL進樣。分別記錄峰面積，記錄色譜圖。

2.2 動物血漿樣品的采集與預處理 取雄性Wistar大鼠15只，隨機分成3組，每組5只。實驗前禁食12h，自由飲水。取定量異槲皮苷溶解到含20%丙二醇的生理鹽水溶液（v/v）中，制成異槲皮苷溶液。按5、10和20 mg/kg體重經(jīng)尾靜脈一次性給予異槲皮苷溶液，分別于注射后2，5，10，15，20，30，45，60，90，120和180 min采血，每個點采血0.3 mL，置于預先肝素化的離心管中，離心（3500r/min） 15min，得血漿樣本置-20℃冰箱中保存，待處理。取各采血時間點血漿100μL，按照“血漿樣品的處理”項下方法操作，進樣分析。

3 結果

3.1 析方法的確證

3.1.1 方法的專屬性 上述色譜條件下，通過將大鼠的空白血漿樣品色譜圖（圖2）空白血漿樣品中加對照品和內標物色譜圖（圖2b）以及異槲皮苷靜脈注射后血漿樣品中加內標色譜圖（圖2）進行比較。結果表明，異槲皮苷與內標物色譜峰分離良好，不受內源性物質的干擾。異槲皮苷和內標物的保留時間分別為6.8min和10.6min。

3.1.2 檢測限（LOD）和定量限（LOQ） 將已知濃度的標準溶液稀釋，精密吸取50μL，至100μL的空白血漿中，按“血漿樣品的處理”項下方法進行處理，配制樣品溶液，進行測定，保證S/N均為10，重復分析五次，獲得該濃度的日內精密度RSD低于8.7%，準確度RE為3.8%，該結果表明HPLC測定異槲皮苷的LOQ為0.203μg/mL，LOD（S/N=3）為0.062μg/mL。

3.1.3 標準工作曲線 取空白血漿100μL，分別加入內標溶液10μL，加入異槲皮苷系列標準溶液（0.4、0.8、1.6、4.0、10.0、40.0和160.0μg/mL）各50μL，配制成相當于血漿濃度為0.2、0.4、0.8、2.0、5.0、20.0和80.0 μg/mL的待測樣品，按“血漿樣品的處理”項下方法操作，進樣20μL，記錄色譜圖。以異槲皮苷與內標物的峰面積比值為縱坐標（y），異槲皮苷濃度為橫坐標（x），用加權最小二乘法進行回歸運算[9]，權重系數(shù)為I/C2，求得直線的回歸方程為：y=0.2426x-0.0242 （r= 0.9961），本方法異槲皮苷在0.2～80μg/mL范圍內線性良好。

3.1.4 提取回收率 取空白血漿100μL，按上述“血漿樣品處理”項下方法分別制備低、中、高三個濃度（0.6、6、60μg/mL）的樣品。以提取后樣品的色譜峰面積與含有相同含量未經(jīng)提取溶液直接進樣所獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。每一濃度進行6樣本分析，待測組分的提取回收率均不低于（91.24±6.93）%，結果見表5。

3.1.5 精密度和準確度 取空白血漿100μL，按上述“血漿樣品的處理”項下方法分別制備低、中、高三個濃度（0.6、6、60μg/mL）的血漿樣品。日內精密度測定在同一天對每個濃度的QC樣品進行5樣本分析；日間精密度的計算，是對每個濃度的5樣品進行分析（每天一個分析批），連續(xù)測定3d，并與標準曲線同時進行，以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，求得該方法的精密度RSD%（QC樣品測得值的相對標準偏差）和準確度RE（QC樣品測量均值對真值的相對誤差），結果見表6。本方法的日內和日間精密度RSD≤7.7%，RE在-6.3～7.0%之間。結果表明該法重復性、準確性良好，均符合生物分析方法指導原則的要求[10]。

3.1.6 樣品穩(wěn)定性 取空白血漿100μL，按上述“血漿樣品的處理”項下方法分別制備低、中、高三個濃度（0.6、6、60μg/mL）的樣品，各個濃度QC樣品分別經(jīng)短期（室溫，4h）、長期（-20℃，1個月）和連續(xù)凍融3次（凍：-20℃/24h，-20℃/12h，-20℃/12h）-融（25℃/30min，3次）循環(huán)處理后帶入標準曲線中測定待測組分QC樣品的濃度，計算RE%，結果見表7。結果表明生物樣品在室溫，-20℃放置1個月及連續(xù)凍融3次均能保持穩(wěn)定。

3.2 異槲皮苷藥動學研究 將給藥后不同時間取血測得的血藥濃度和時間數(shù)據(jù)用3p97藥代動力學軟件擬合，通過進行一房室、二房室、三房室對各權重為1、l/C、1/C2的情況進行擬合，比較藥時曲線擬合圖及參數(shù)，平均藥時曲線見圖2-3，其主要藥物動力學參數(shù)見表8。

4 討論

4.1 助溶劑的選擇 異槲皮苷幾乎不溶于冷水，微溶于沸水。鑒于其欠佳的水溶性，本實驗曾嘗試用DMSO作為助溶劑。有文獻報道當DMSO加入量大于1%時，將會給動物造成中毒反應[11]，但當在生理鹽水中加入DMSO約為1%時，異槲皮苷未獲得較好的溶解。后嘗試使用丙二醇作為助溶劑，文獻報道當丙二醇用量小于60%時，是在安全范圍內[12]。分別嘗試使用5%、10%、20%的丙二醇，發(fā)現(xiàn)當生理鹽水中加入20%丙二醇時異槲皮苷能夠很好地溶解，故最終確定使用含20%丙二醇的生理鹽水溶液（v/v）來制備藥物溶液。

4.2 流動相的選擇 為了獲得合適的保留時間和良好的分離度，曾分別采用甲醇-水（40：60，45：55），結果被測物分離效果不佳。后流動相中加入了乙腈，分別嘗試采用甲醇-乙腈-水（30：5：65，35：5：60，25：10：65），后發(fā)現(xiàn)流動相為甲醇-乙腈-水（35：5：60）出峰時間比較理想，但峰形欠佳。為了改善峰形，嘗試了甲醇-乙腈-甲酸水系統(tǒng)，分別嘗試0.1%～0.5%的甲酸水，最后發(fā)現(xiàn)當流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（35：5：60）時分離效果良好，故最終確定為本實驗流動相。

4.3 檢測波長的選擇 異槲皮苷的吸收光譜顯示其具有兩個最大吸收波長，分別為256nm和358nm，而內標物牡荊素的兩個最大吸收波長為269nm和331nm。當選擇256nm作為檢測波長時，血漿中的內源性物質峰會對檢測造成干擾。綜上最終確定檢測波長為360nm。

4.4 內標物的選擇 為滿足測試需求，內標物應選擇與被測物結構相似，保留時間較為接近的化合物。本實驗對多種化合物進行了篩選，曾嘗試了牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、金絲桃苷和牡荊素等物質作為內標物。最終由于保留時間適宜，與待測物結構類似，不受內源性物質干擾，且與待測物質、血漿內源性物質之間無干擾、分離度良好，因此選擇牡荊素為本試驗的內標物。

4.5 藥代動力學研究 結果表明給藥后異槲皮苷在大鼠體內迅速消除，低劑量（5mg/kg）異槲皮苷的血藥濃度只能檢測到0.75h，高劑量的（20mg/kg）可以檢測到3h。通過擬合度比較5，10和20mg/kg給藥劑量下均選擇1/C2為權重系數(shù)。依據(jù)F檢驗，AIC和R2的比較，三個劑量的藥代動力學行為均最符合三室開放模型。在給藥劑量5～10mg/kg范圍內，AUC的值成比例增加。此外，藥代動力學參數(shù)αhalf-life，βhalf-life，aCL， MRT0→t 和MRT0→∞在20mg/kg與其他劑量的比較中均表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異。20mg/kg劑量的αhalf-life的值比另外兩個給藥劑量的值大，表明異槲皮苷在大鼠體內的分布過程在20mg/kg劑量下進行的更為緩慢。而20mg/kg劑量下較大的 βhalf-life，MRT0→t 和 MRT0→∞則表明異槲皮苷的消除過程相較于低劑量時也表現(xiàn)的更為緩慢?；谝陨辖Y果，異槲皮苷在5～10mg/kg表現(xiàn)出非劑量依賴性而在更高劑量（20mg/kg）時則呈現(xiàn)出非線性過程。這主要是由于藥物的代謝酶和可透過膜的載體在高劑量給藥狀態(tài)下存在飽和現(xiàn)象，即代謝酶或載體的輸送能力在體內的劑量和濃度超過某一限度時會達到飽和，從而表現(xiàn)出不同給藥劑量下藥動學過程的差異[13]。

綜上所述，實驗建立了HPLC法對異槲皮苷多劑量給藥體內藥動學的研究方法，確定了異槲皮苷在血漿樣品中的含量測定方法，并進行了方法學驗證。該法專屬性強，分離度較好，其檢測限、提取回收率、精密度、穩(wěn)定性均符合生物樣品分析要求。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過藥動學軟件處理，擬合出不同劑量異槲皮苷的大鼠體內房室模型，并計算出相關藥動學參數(shù)。其在5～10mg/kg給藥劑量范圍內表現(xiàn)出非劑量依賴性，而在更高劑量20mg/kg時則呈非線性過程。本實驗為異槲皮苷的進一步研究提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-03-02 編輯：陶希睿）