曾志剛， 邱 紅， 朱梅菊， 朱洪竹， 蕭建華

(1. 井岡山大學體育學院， 2. 井岡山大學附屬醫(yī)院兒科， 江西吉安 343009)

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陽性神經(jīng)元面積百分比和染色灰度相對強度值的結(jié)合在大鼠腦組織免疫組化圖像定量分析中的應用*

曾志剛1△， 邱 紅1， 朱梅菊1， 朱洪竹1， 蕭建華2

(1. 井岡山大學體育學院， 2. 井岡山大學附屬醫(yī)院兒科， 江西吉安 343009)

目的：通過下丘腦弓狀核乙酰膽堿表達的檢測、圖像處理、圖像分析，應用陽性神經(jīng)元面積百分比(APPN)和染色灰度相對強度值(RISGL)相結(jié)合的方法，探討免疫組化(IHC)圖像定量分析的特點。方法：樣本來源于運動性免疫抑制過程中SD大鼠下丘腦弓狀核膽堿能陽性神經(jīng)元乙酰膽堿表達的免疫組化切片，包括第0、2、4、6周與每周Control、Immediately after exercise、3 hours after exercise三組共計12組(n=6)。采用免疫組化技術測定其乙酰膽堿(ACh)的表達，并根據(jù)ACh陽性神經(jīng)元總面積(TAPN)、陽性神經(jīng)元灰度平均強度值(AISGL)、APPN、RISGL、APPN/RISGL參數(shù)進行免疫組化圖像的定量分析, 從而比較APPN和RISGL在定量分析中與傳統(tǒng)參數(shù)的不同及其優(yōu)勢。結(jié)果：APPN與TAPN的變化呈現(xiàn)幾乎一致的變化特征，能發(fā)現(xiàn)相應差異的顯著性意義(P<0.05)，但APPN的敏感性和抗干擾性更強。RISGL與AISGL呈現(xiàn)的結(jié)果并不完全一致，而且APPN結(jié)合RISGL比單參數(shù)更能反映陽性表達情況。結(jié)論：APPN和RISGL免疫組化圖像分析參數(shù)能較可靠地、準確地進行圖像定量分析，APPN與RISGL的結(jié)合不僅可反映陽性表達的數(shù)量情況，還可以幫助分析其作用機理，優(yōu)于傳統(tǒng)分析參數(shù)。

免疫組化；圖像分析；面積；灰度；大鼠

由于計算機圖像采集和分析技術的迅速發(fā)展，一些能對圖像特征進行記錄并量化分析的軟件被開發(fā)出來，使應用計算機來代替人工對免疫組化圖像進行精確的量化分析成為可能[1-3]。隨著免疫組化圖像處理軟件的不斷發(fā)展更新，它為免疫組化圖像的定量分析提供了良好的計算機處理平臺。但是對免疫組化結(jié)果的定量分析在追求更加準確與精確方面仍然存在諸多問題。如陽性神經(jīng)元總面積(total area of positive neuron，TAPN)、陽性神經(jīng)元灰度平均強度值(average intensity of staining grey level，AISGL)是目前使用比較多的免疫組化半定量分析參數(shù)[4]，但是均存在一些不足和/或局限。本研究以下丘腦弓狀核(Arc)膽堿能陽性神經(jīng)元在運動性免疫抑制過程中乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)表達的適應性變化為研究對象，探討應用陽性神經(jīng)元面積百分比(area percent of positive neuron，APPN)和染色灰度相對強度值(relative intensity of staining grey level，RISGL)及其相結(jié)合的方法進行免疫組化圖像定量分析的特點和優(yōu)勢，為圖像定量分析方法的改進提出一些建議和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

來源于運動性免疫抑制過程中SD大鼠下丘腦弓狀核膽堿能陽性神經(jīng)元乙酰膽堿表達的免疫組化切片，包括持續(xù)6周的遞增負荷運動第0、2、4、6周(0 w、2 w、4 w、6 w)與每周安靜(control, C)、運動后即刻(immediately after exercise, I)、3h組(3 hours after exercise, 3H)共12組切片(n=6)。

1.2 主要試劑和儀器

小鼠抗ACh單克隆抗體(CHEMICON，批號0603026247，工作濃度1∶400)，超敏聚合酶免疫組化檢測試劑盒(CHEMICON，批號0603025758)，顯色試劑盒(VECTOR，產(chǎn)品編號SK4800)；德國Leica全自動組織脫水機、石蠟包埋機、石蠟輪轉(zhuǎn)切片機、攤片機、自動玻片蓋片機、自動染色機、Leica QWin Plus V3.2.1高級圖像處理軟件，Motic B5光學顯微鏡、彩色數(shù)碼CCD攝像頭Moticam 1300。

1.3 取樣與石蠟組織切片

大鼠經(jīng)心臟灌注固定后，斷頭分離腦組織，4%多聚甲醛(pH 7.4，4℃)固定3 h后常規(guī)石蠟包埋[5]。對照文獻[6]，選取耳間線嘴側(cè)Interaural 6.72～6.96 mm間用Leica石蠟切片機進行連續(xù)冠狀切片，切片厚5 μm。

1.4 免疫組織化學染色

常規(guī)腦組織切片脫蠟至水；切片泡在用pH 6.0的0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液配的0.1%TritonX-100里10 min，TBST洗3次×3 min；Peroxidase Blocking Solution封閉過氧化氫酶10 min，TBST洗3次×5 min；用微波修復，高火煮沸3 min，再低火維持10 min；5%正常山羊血清, 37℃孵育30 min；不洗，直接加一抗，37℃孵育1.5 h，TBST洗3次×10 min；加二抗，37℃孵育30 min，TBST洗3次×10 min；加新鮮配制的DAB顯色劑，室溫5～20 min，鏡下控制，TBST洗3次×5 min；常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片[5]?？瞻讓φ眨河肨BST代替一抗進行同步免疫組織化學步驟，染色結(jié)果為陰性；陰性對照：用一抗同種屬動物正常血清代替一抗進行同步免疫組織化學步驟，染色結(jié)果為陰性；陽性對照：用同切片自身的大腦皮質(zhì)或海馬回部位進行陽性對照，同步免疫組織化學步驟，染色結(jié)果為陽性。

1.5 圖像采集與分析

1.5.1 圖像采集與處理 運用Motic B5光學顯微鏡進行免疫組化切片進行觀片和攝片。每次操作均嚴格遵守以下操作規(guī)程要點：開機預熱20 min，保證光源穩(wěn)定的前提下，400倍視野，設置Motic B5顯微鏡的光源為5.5～5.8之間，RGB設為1/0/14～15，所有設置一次性調(diào)整好后保持不變。為優(yōu)化感興趣區(qū)的陽性表達分析，圖像分割采用HIS(色度、亮度、飽和度)代替RGB(紅、綠、藍)進行分割[7-9]，并且在選區(qū)內(nèi)自動分割著色后進行多余部分的刪除和缺失部分的補足，以達到選區(qū)內(nèi)陽性表達的最佳選擇(圖1，見彩圖頁Ⅳ)：圖1B紅色實體箭頭和黃色虛線箭頭所示部位進行分割修正后達到圖1A相應部位的效果，紅色實體箭頭部位進行了刪除多余部分的處理，黃色虛線箭頭部位進行了補充缺失部分的處理。

1.5.2 圖像分析 運用Leica QWin Plus V3.2.1高級圖象分析軟件進行圖像信息分析，主要參數(shù)為陽性神經(jīng)元總面積、陽性神經(jīng)元灰度平均強度值、APPN、RISGL、APPN/RISGL。APPN反映待測部位陽性神經(jīng)元數(shù)量和細胞個體大小的綜合狀況，RISGL反映待測部位陽性神經(jīng)元染色強度相對待測部位總?cè)旧珡姸鹊膶Ρ葼顩r，RISGL結(jié)合APPN反映陽性神經(jīng)元分泌物質(zhì)表達的相對量。

APPN=選區(qū)內(nèi)陽性神經(jīng)元總面積(μm2)/選區(qū)總面積(μm2)×100%

陽性神經(jīng)元總面積(TAPN)為選區(qū)內(nèi)所有陽性神經(jīng)元面積總和；選區(qū)總面積固定為(29 272.10-29 387.85)μm2。

RISGL=選區(qū)內(nèi)陽性神經(jīng)元灰度平均強度值/選區(qū)總灰度平均強度值

陽性神經(jīng)元灰度平均強度值(AISGL)為選區(qū)內(nèi)每個陽性神經(jīng)元灰度平均強度值總和/選區(qū)內(nèi)陽性神經(jīng)元個數(shù)；選區(qū)總灰度平均強度值為選區(qū)內(nèi)總體(含陽性神經(jīng)元和背景染色)的灰度平均強度值。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 TAPN與APPN的比較

TAPN與APPN具有相似的變化，均顯示I組中6 w比4 w非常明顯地升高(P<0.01)，而I組中4 w比0 w的TAPN明顯降低(P<0.05，圖2)。圖3E、H的箭頭顯示，與0 w比較，6 w的ACh表達范圍出現(xiàn)擴散趨勢(圖3，見彩圖頁Ⅳ)。

2.2 AISGL與RISGL的比較

圖2C、D顯示，AISGL與RISGL呈現(xiàn)的結(jié)果并不完全一致，如2 w的ACh表達變化顯示兩種參數(shù)正好相反，AISGL顯示在3H組中2 w與0 w、4 w、6 w比較ACh表達均明顯升高(P<0.05)，但是RISGL顯示ACh表達明顯降低(P<0.05)；而且，AISGL其他組的0 w、4 w、6 w之間有一些變化具有顯著性差異，而RISGL的其他組變化無顯著性差異(圖2)。由于背景染色的差異，上述兩種參數(shù)在2周組的差異也可以從圖3中可以直觀發(fā)現(xiàn)(圖3，見彩圖頁×)。

Fig. 2 Change of IHC parameters of ACh expression of hypothalamic arcuate nucleus cholinergic neurons in the process of exercise(n=6) IHC: immunohistochemistry; Ach: Acetylcholine*P<0.05,**P<0.01vs0 week;#P<0.05vs2 week

2.3 APPN與RISGL的結(jié)合

在APPN與RISGL單參數(shù)圖中，在I組中ACh表達的APPN值4 w比0 w明顯降低(P<0.05), 6 w比4 w明顯升高(P<0.01)；在3H組中ACh表達的RISGL值2 w比0 w明顯降低(P<0.05), 4 w比2 w明顯升高(P<0.01), 6 w比2 w明顯升高(P<0.01)。在APPN與RISGL結(jié)合的參數(shù)圖中， I組中ACh表達的APPN/RISGL值6 w比4 w明顯升高(P<0.01，圖4)。

Fig. 4 Adaptive change of the combination of APPN and RISGL in hypothalamic arcuate nucleus(n=6) A, C, E: Adaptive change of APPN or RISGL; B, D, F: Adaptive change of APPN/RISGL*P<0.05,**P<0.01vs0 week;##P<0.001vs2 week;△△P<0.01vs4 week

3 討論

APPN既可以反映待測部位陽性神經(jīng)元數(shù)量，又可以反映陽性細胞個體大小的綜合狀況。由于一個視野的選區(qū)總面積相對固定，所以從圖2A、B中可發(fā)現(xiàn)TAPN與APPN的變化呈現(xiàn)幾乎一致的變化特征。APPN與TAPN一樣，能發(fā)現(xiàn)相關差異的顯著性意義。然而，可能APPN具有更高的敏感性，能避免陽性神經(jīng)元面積百分比所受影響因素的干擾。而且，如果只考慮選區(qū)內(nèi)陽性神經(jīng)元的總面積，而沒有考慮選區(qū)總面積的因素，則容易造成有針對性的挑選部分染色較好的小區(qū)域作為測試部位，從而增加可控制的人為的選擇性誤差。另外，由于目前免疫組化的各個步驟未量化和標準化，如DAB顯色時間的長短、組織切片的厚度、拍攝圖像時的光源亮度等因素，都可以對結(jié)果造成不同程度的影響。姜洋等學者提出的平均陽性染色面積百分比(APSAP)法的理論基礎是陽性細胞的面積百分率，則上述因素不能對其結(jié)果造成顯著的影響[1，9，10]，所以APPN參數(shù)方法同樣也能很好的避免上述因素對結(jié)果的影響。但是，APPN對陽性表達出現(xiàn)面積增大和擴散(或面積減少和聚集)、陽性表達物新產(chǎn)生和被激活(或滅活和被抑制)等情況更具有實際意義。

采用RISGL來反映陽性神經(jīng)元分泌的神經(jīng)遞質(zhì)的表達量，它是指在選定區(qū)域內(nèi)(同APPN一致)陽性神經(jīng)元AISGL與此區(qū)域總的灰度平均強度的比值，參數(shù)RISGL比AISGL更好地平衡了染色背景的影響。本研究中如果不考慮選區(qū)總灰度平均強度值(主要包括背景強度)，可能由于背景染色過深或非特異性染色等原因，使陽性表達變化出現(xiàn)相反方向的偏差，而且即使變化方向相同，也可能出現(xiàn)差異顯著性的不同。如結(jié)果2.2中，2 w的ACh表達顯示兩種參數(shù)正好相反的變化方向；如果考慮到RISGL能夠減少此誤差的影響，可以發(fā)現(xiàn)RISGL參數(shù)更能反映真實情況。而且，通過平衡一些干擾因素，可以減少因誤差導致的假陽性結(jié)果，如結(jié)果2.2中，C組與I組各周之間 AISGL與RISGL的變化也出現(xiàn)差異的顯著性意義不同的情況，RISGL則可能減少了一些假陽性的顯著性差異。許多研究也表明，由于顯微鏡光源強度的變化、圖像分析系統(tǒng)背景光強度分布的不均勻，特別是DAB顯色時間的長短、組織切片的厚度、非特異性染色等因素的影響，導致陽性表達物質(zhì)的灰度或光密度存在較大的不穩(wěn)定、差異性、誤差大等現(xiàn)象[11]。然而，通過與選區(qū)內(nèi)總灰度平均強度的對比，可以盡可能的減少實驗過程的系統(tǒng)誤差，使結(jié)果更具有可靠性和準確性。

從結(jié)果2.3中可以發(fā)現(xiàn)，ACh表達的總體變化主要是由APPN來反映，存在兩種情況：第一APPN與RISGL表現(xiàn)相反的變化方向，但ACh表達的總體變化仍然與APPN的變化方向一致，如圖4C-4 w與圖4D-4 w、圖4C-6 w與圖4D-6 w、圖4E-4 w與圖4F-4 w比較，由于RISGL的變化幅度較小，所以ACh表達的總體變化沒有單一受其作用而產(chǎn)生影響，仍然按照APPN的方向變化。但是，變化差異的顯著性會隨著APPN與RISGL的變化強弱而隨之變化，如圖4C-4 w與圖4D-4 w、圖4E-4 w與圖4F-4 w的比較發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)合削弱了陽性表達變化的顯著性差異，而圖4C-6 w與圖4D-6 w的比較發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)合仍呈現(xiàn)了陽性表達變化的顯著性差異。第二APPN與RISGL變化方向一致，協(xié)同作用決定ACh表達的共同變化方向，如圖4E-2 w與圖4F-2 w、圖4E-6 w與圖4F-6 w的比較，ACh表達的總體變化還是朝向相同方向。但是，可能由于其中一種參數(shù)變化的顯著性水平較低，而弱化兩參數(shù)結(jié)合后變化的顯著性水平，然而這種弱化可能提示參數(shù)代表物質(zhì)的變化過程或機理。

在本研究中，APPN可以反映待測部位陽性神經(jīng)元數(shù)量和細胞個體大小的綜合狀況，可根據(jù)面積百分比的變化，結(jié)合RISGL參數(shù)的變化，不僅反映陽性神經(jīng)元分泌物質(zhì)的量，而且還可反映陽性神經(jīng)元分泌神經(jīng)遞質(zhì)等生物活性物質(zhì)的分散與聚集情況。如本研究中ACh表達的增加可能是由于反應物染色深度增加(即RISGL升高)，如單個陽性神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)增多而產(chǎn)生的，也可能是由于陽性面積的增加(即APPN升高)，如神經(jīng)遞質(zhì)的向外運輸傳遞或新的神經(jīng)元被激活而產(chǎn)生的，通過APPN與RISGL的結(jié)合可以更清晰地發(fā)現(xiàn)或推斷陽性表達的產(chǎn)生機理。所以本研究采用APPN與RISGL之商，即APPN/RISGL(考慮灰度與陽性表達量呈負相關)來綜合反映陽性表達的相對數(shù)量，能更直觀的反映ACh在下丘腦弓狀核的表達。

APPN與TAPN一樣能避免免疫組化各步驟未量化和標準化的因素對結(jié)果的影響，而且APPN通過考慮選區(qū)總面積的因素，能減少可控制的人為的選擇性誤差。RISGL通過考慮選區(qū)內(nèi)總灰度平均強度的因素，比AISGL能更好地平衡染色背景的影響，減少實驗系統(tǒng)誤差，并且更好地反映真實情況，減少因誤差導致的假陽性結(jié)果。通過APPN、RISGL和APPN/RISGL的對比，雖然陽性表達主要由APPN參數(shù)反映，有其優(yōu)勢，但還需和陽性神經(jīng)元的染色灰度信息RISGL結(jié)合進行綜合評價待檢物質(zhì)的量化變化，使判斷更可靠與準確，甚至能提示待檢物質(zhì)的變化過程或機理。隨著計算機圖像分析技術的發(fā)展[12]，如果利用有關的時間分割與空間疊加技術[13]、3D成像技術、虛擬現(xiàn)實或增強現(xiàn)實技術等，把大量的不同層面的高倍圖像合成一個三維立體圖像，合并計算單層面陽性物質(zhì)表達量或立體層面陽性物質(zhì)表達體積量，能為更準確地定量分析免疫組化結(jié)果提供可靠解決方法。

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本刊的宗旨、欄目和要求

本刊宗旨系面向應用基礎理論研究，以促進科研，加強我國的經(jīng)濟建設和國防建設。期刊內(nèi)設三個欄目：研究論文，報道與應用有關的生理學研究及對應用生理學有指導意義的基礎理論研究的論文；技術方法，登載有關的新技術、新方法；研究簡報，以短篇的形式報道最新的研究成果。

文稿應具有科學性、實用性、創(chuàng)新性，論點明確，數(shù)據(jù)可靠，簡明扼要。研究論文不超過8 000字(限4個印刷頁，含圖、表及參考文獻等)；技術方法不超過6 000字(限3個印刷頁)；研究簡報4 000字以內(nèi)(可省略英文摘要，但需附英文題目和關鍵詞，限2個印刷頁)。

來稿須附單位推薦信。信應注明不涉及保密，無一稿兩投，署名無爭議。

本刊編輯部

Application of area percent of positive neuron and relative intensity of staining grey level in the image quantitative analysis of rat brain tissues immunohistochemistry

ZENG Zhi-gang1△, QIU Hong1, ZHU Mei-ju1, ZHU Hong-zhu1, XIAO Jian-hua2

(1. School of Physical Education, 2. Department of Pediatrics of the Affiliated Hospital, Jinggangshan University, Jiangangshan 343009, China)

Objective: The acetylcholine expression in hypothalamus arcuate nucleus is detected and then the images are processed and analyzed. The features of the image quantitative analysis of immunohistochemistry (IHC) with the method combining two parameters of area percent of positive neuron (APPN) and relative intensity of staining grey level (RISGL) were investigated. Methods: Samples were the immunohistochemical slices of acetylcholine(ACh)expression of hypothalamic arcuate nucleus cholinergic neurons in the process of exercise induced immunosuppression, which included twelve groups of “0 w, 2 w, 4 w, 6 w” and three groups of “control, immediately after exercise, 3 hours after exercise” in every week. IHC technology was used to detect the ACh expression. The image quantitative analysis of IHC was conducted in accordance with the parameters of ACh total area of positive neuron (TAPN), average intensity of staining grey level (AISGL), APPN, RISGL, APPN/RISGL. Then the differences among APPN, RISGL and traditional parameters in the quantitative analysis were compared and the advantages were found. Results: The changes of TAPN and APPN showed almost the same variation. Namely the corresponding significant differences could be found through these two parameters(P<0.05), but the sensitivity and anti-interference of APPN was higher. The results of AISGL and RISGL were not coincident completely. Furthermore, with the combination of APPN and RISGL, the positive expression could be reflected better than any single parameter. Conclusion: The parameters of immunohistochemical image analysis, APPN and RISGL, can be reliable and accurate in image quantitative analysis of IHC. The combination of APPN and RISGL can not only reflect the expression of positive neurons, but also help analyze its mechanism, which is better than traditional analysis parameters.

immunohistochemistry; computer-assisted image processing; small-area analysis; grey level; rat

國家自然科學基金資助項目(31160217，31360255)；江西省教育廳科技項目(GJJ10545)

2017-06-06

2017-02-17

G804；R329

A

1000-6834(2017)03-282-05

10.12047/j.cjap.5460.2017.068

△【通訊作者】Tel: 0796-8100491； E-mail: agang5240@163.com