彭志鋒， 孟 健， 張繼紅

(1. 山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2. 人體解剖學(xué)教研室， 大同 037009)

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熱休克蛋白A5介導(dǎo)的自噬在小鼠腦缺血/再灌注損傷中的作用*

彭志鋒1△， 孟 健2， 張繼紅1

(1. 山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2. 人體解剖學(xué)教研室， 大同 037009)

目的：探討熱休克蛋白A5(HSPA5)誘導(dǎo)的自噬在小鼠腦缺血/再灌注損傷中的作用。方法：將36只BALB/c小鼠隨機(jī)分為sham、缺血再灌注(I/R)、vehicle+I/R、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+I/R、scramble siRNA+I/R和HSPA5 siRNA+I/R組(n=6)。Sham組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓。I/R采用大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Vehicle+I/R組和3-MA+I/R將5 μl 0.9% NaCl 或3-MA (30 mg/ml)在MCAO前30 min側(cè)腦室注射。scramble siRNA+I/R組和HSPA5 siRNA+I/R組將5 μl scramble siRNA或HSPA5 siRNA (2 μg/μl)在MCAO前24 h側(cè)腦室注射。檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)自噬體、缺血大腦皮層(LC3)-II/LC3-I表達(dá)、神經(jīng)元損傷程度及神經(jīng)功能缺損。結(jié)果：顯微鏡下sham組小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常；I/R組小鼠缺血大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)中細(xì)胞器減少，自噬體形成。與sham組比較，I/R組缺血大腦皮層LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05) ；與I/R組相比，3-MA+I/R組或HSPA5 siRNA+I/R 組缺血大腦皮層LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)；3-MA+I/R組及HSPA5 siRNA+I/R組I/R后腦缺血性損傷及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重(P<0.05)。結(jié)論：HSPA5誘導(dǎo)自噬可能在小鼠局灶性I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

熱休克蛋白A5；自噬；缺血/再灌注損傷；小鼠

腦缺血一定時(shí)間后恢復(fù)血液供應(yīng)，腦組織損傷

會(huì)加重，稱為腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion; I/R)損傷，神經(jīng)細(xì)胞死亡與I/R損傷有密切聯(lián)系[1]。但是I/R損傷機(jī)制仍未闡明，臨床上也缺乏相應(yīng)的治療措施。自噬是存在真核細(xì)胞生物細(xì)胞中的一種自我吞噬現(xiàn)象，在生理病理情況下，形成自噬溶酶體，對(duì)自身細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異物、損傷和衰老細(xì)胞器進(jìn)行吞噬降解的過程，自噬分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[2]。分子伴侶介導(dǎo)的自噬指通過一些分子伴侶如熱休克蛋白70 (heat shock protein 70; HSP70)幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體，參與自噬[3]。在正常生理情況下，細(xì)胞自噬的水平很低；當(dāng)組織器官發(fā)生I/R損傷時(shí)，細(xì)胞自噬水平上調(diào)[1]。近年來研究人員通過透射電子顯微鏡等方法，從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方面證實(shí)不同I/R模型中自噬水平增加[4, 5]。本課題組在小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion; MCAO)后再灌注損傷模型及氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation; OGD)誘導(dǎo)N2A細(xì)胞模型中證實(shí)miR-181b 通過直接調(diào)節(jié)熱休克蛋白A5 (heat shock protein A5; HSPA5)發(fā)揮作用，而且HSPA5在小鼠I/R損傷中表達(dá)增高[6, 7]。同時(shí)也證實(shí)沉默自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene -5; Atg5)會(huì)加重小鼠MCAO再灌注損傷[8]。然而HSPA5是否誘導(dǎo)自噬及其在小鼠 IR損傷模型中的作用仍不清楚。因此，本研究利用MCAO致小鼠腦缺血模型，探討HSPA5是否介導(dǎo)自噬及其在小鼠IR損傷中的作用，有助于明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬的關(guān)系，及其在小鼠局灶性I/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只健康成年雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，許可證號(hào)為SCXK-(軍)2007-004。將小鼠隨機(jī)分為6組(n=6)：假手術(shù)組(sham組)、缺血/再灌注組(I/R組)、溶劑(vehicle)+I/R組、自噬抑制劑(3-Methyladenine， 3-MA)+I/R組、雜亂(scramble) siRNA+I/R組和HSPA5 siRNA+I/R組。其中sham組是I/R組對(duì)照；vehicle+I/R組為3-MA+I/R組對(duì)照；scramble siRNA+I/R組是HSPA5 siRNA+I/R組對(duì)照。I/R采用大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Vehicle+I/R組和3-MA+I/R將5 μl 0.9% NaCl 或3-MA (30 mg/ml)在MCAO前30 min側(cè)腦室注射。scramble siRNA+I/R group組和HSPA5 siRNA+I/R組將5 μl scramble siRNA或HSPA5 siRNA (2 μg/μl)在MCAO前24 h側(cè)腦室注射。

1.1.2 儀器和試劑 透射電子顯微鏡(美國(guó)Delong Instruments公司；LVEM5)；超薄切片機(jī)(美國(guó)RMC公司)；小鼠腦立體定位儀(北京沙東生物有限公司)；3-MA(美國(guó)Sigma公司)；HSPA5 siRNA和scramble siRNA (廣州Ribobio公司) ;兔抗(LC3)-II/LC3-I和Beclin-1多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa公司)；山羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司); Nissl染料(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 側(cè)腦室給藥 小鼠在MCAO手術(shù)前先經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上，按Munoz[9]側(cè)腦室注射方法，以前囟為零點(diǎn)，在前囟后0.5 mm，左側(cè)1.0 mm和3.5 mm深度將5 μl HSPA5 siRNA(2 μg/μl) 、scramble siRNA或 2 μl 3-MA (30 mg/ml) 、0.9% NaCl 在MCAO手術(shù)前24 h或30 min分別注入小鼠左側(cè)腦室。

1.2.2 MCAO誘導(dǎo)缺血/再灌模型的建立 按照以往研究的方法[8]，自頸部行1 cm長(zhǎng)的正中縱切口，鈍性分離下頜下腺；手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)頸動(dòng)脈鞘并游離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，然后用5/0縫合絲線雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端；在頸總動(dòng)脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)并輕輕提起以阻斷血流，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端的動(dòng)脈壁上用針頭扎一個(gè)小口，將制備好的線栓從小孔插入頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈并進(jìn)而向上到達(dá)大腦中動(dòng)脈(直至遇到輕微阻力，深度約12.0 mm)，固定線栓，將下頜下腺歸位，60 min 后拔出線栓，縫合皮膚。模型成功的標(biāo)志是小鼠麻醉清醒后出現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，小鼠可存活1周。I/R手術(shù)成功率約為70%。Sham組小鼠僅分離頸部血管, 不進(jìn)行大腦中動(dòng)脈梗阻, 除不插入栓線外, 其他手術(shù)操作步驟同I/R組。

1.2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià) I/R 24 h，各組小鼠根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[10]，觀察性評(píng)價(jià)指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)減少、姿勢(shì)側(cè)傾、拖地步態(tài)、共濟(jì)失調(diào)等；操作性評(píng)分指標(biāo)包括低反應(yīng)性、前肢屈曲、肌肉強(qiáng)度降低、身體旋轉(zhuǎn)和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等。評(píng)分范圍在0～10分之間。輕度0～3分；中度4～7分；重度8～10分。

1.2.4 透射電子顯微鏡檢查缺血大腦皮層自噬體 I/R 24 h后，小鼠經(jīng)1%巴比妥鈉麻醉后，心臟PBS灌注，含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)固定。取出缺血大腦皮層額葉，置入上述相同固定液中后固定過夜。然后在1%四氧化鋨中浸泡2 h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包裹。組織被超薄切片機(jī)切成60～70 nm薄片，通過醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。隨后在透射電子顯微鏡隨機(jī)選擇10個(gè)視野，通過對(duì)自噬小體或自噬溶酶體計(jì)數(shù)來判斷自噬活化情況。

1.2.5 免疫印跡分析缺血大腦皮層自噬相關(guān)蛋白 提取缺血大腦皮層蛋白，取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶孵育1 h后，用兔抗(LC3)-II/LC3-I和 Beclin-1(1∶500)和鼠抗β-actin多克隆抗體(1∶5 000)室溫孵育3 h。隨后用山羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育1 h。最后用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one進(jìn)行吸光度分析。

1.2.6 Nissl染色缺血大腦皮層神經(jīng)元 I/R 24 h后，將小鼠麻醉，并取出大腦皮層缺血區(qū)，含4%多聚甲醛的PB溶液固定，冰凍切片機(jī)將組織塊切成20 μm薄片，載玻片上貼片，按照Nissl染料方法進(jìn)行染色[11]，每組選取3張切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)神經(jīng)元的數(shù)量，然后取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3-MA或HSPA5 siRNA對(duì)I/R小鼠神經(jīng)功能影響

行為學(xué)方法檢測(cè)各組小鼠，可見sham組小鼠神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)正常，平均行為學(xué)評(píng)分是2.0。I/R損傷組小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)減少、側(cè)傾、轉(zhuǎn)圈、低反應(yīng)性、前肢屈曲和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等，行為學(xué)評(píng)分為8.4±0.3，與sham組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。I/R前側(cè)腦室注射3-MA組或HSPA5 siRNA組小鼠的行為學(xué)損傷進(jìn)一步加重，行為學(xué)評(píng)分別增加至12.3±0.5和11.9±0.4，與I/R組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05，圖1)。

2.2 I/R對(duì)小鼠自噬水平的影響

采用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，sham組小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常；I/R組小鼠缺血大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞萎縮、細(xì)胞器減少, 小鼠I/R后細(xì)胞質(zhì)中有自噬體、自噬溶酶體明顯增加，提示自噬發(fā)生(P<0.05，圖2)。

2.3 3-MA或HSPA5 siRNA對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響

蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示：sham組、I/R組、vehicle+I/R 組、3-MA+I/R組、scramble siRNA+I/R組和HSPA5 siRNA+I/R組LC3-II蛋白相對(duì)灰度值分別是100±0、200±15、210±20、140±17、203±25和135±12，而各組間LC3-I蛋白表達(dá)無顯著差異。與sham組相比較，I/R組小鼠自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與I/R組相比，3-MA+I/R組或HSPA5 siRNA+I/R group小鼠缺血大腦皮層LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05，圖3)。

2.4 3-MA或HSPA5 siRNA對(duì)I/R大腦額葉神經(jīng)元損傷的影響

Nissl染色結(jié)果顯示：sham組、I/R組、vehicle+I/R 組、3-MA+I/R組、scramble siRNA+I/R組和HSPA5 siRNA+I/R組大腦皮層平均神經(jīng)元數(shù)目/視野分別是210±9、125±10、120±16、70±7、128±15和65±11。與sham組比較，I/R組小鼠大腦缺血皮層有一定程度的神經(jīng)細(xì)胞缺失(P<0.05)；3-MA+I/R組或HSPA5 siRNA+I/R group小鼠缺血皮層的神經(jīng)細(xì)胞缺失進(jìn)一步增加，與I/R組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05, 圖4)。

3 討論

本研究表明，小鼠腦I/R損傷后自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著增高，而自噬抑制劑3-MA或HSPA5 siRNA可降低LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)。3-MA或HSPA5 siRNA使I/R缺血大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞缺失進(jìn)一步增加；與此同時(shí)，神經(jīng)行為學(xué)損傷進(jìn)一步加重。上述結(jié)果提示，HSPA5介導(dǎo)的自噬可能在小鼠腦I/R損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用。

自噬既能夠清除細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)，在維持神經(jīng)細(xì)胞穩(wěn)定中發(fā)揮作用；又可以引起細(xì)胞器過度損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙甚至死亡[12, 13]。近年來研究報(bào)道，新生大鼠缺氧缺血后Beclin-1蛋白水平顯著增高，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可加速神經(jīng)細(xì)胞壞死，而應(yīng)用自噬激活劑雷帕霉素可減少細(xì)胞壞死并減輕腦損傷，提示自噬具有神經(jīng)元保護(hù)作用[14]。Puyal等[15]利用出生后12 d大鼠制作I/R模型發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)自噬體指標(biāo)LC3-II水平在再灌注后2～6 h開始升高，24 h時(shí)達(dá)到峰值，利用透射電鏡下可見病灶周圍神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量自噬溶酶體形成；再灌注后3、6 h，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可顯著下調(diào)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II水平和縮小腦梗死體積、減輕腦損傷，提示自噬參與了I/R引起的缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的死亡。本研究中，BALB/c小鼠缺血前側(cè)腦室注射3-MA，自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I表達(dá)明顯降低，而且導(dǎo)致小鼠大腦缺血皮層神經(jīng)細(xì)胞缺失及神經(jīng)行為學(xué)損傷進(jìn)一步加重，提示自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用，這與Puyal等人的研究結(jié)果不一致。Puyal研究中使用的是剛出生SD大鼠，在MCAO手術(shù)后側(cè)腦室注射3-MA；本研究使用的是成年BALB/c小鼠，在MCAO手術(shù)前側(cè)腦室注射3-MA。結(jié)果的差異可能與Puyal研究中自噬先增高后降低，而本研究中MCAO手術(shù)后自噬未被激活有關(guān)。近年來，研究已經(jīng)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)自噬激活[16]。以往研究已證實(shí)在小鼠腦I/R模型中，HSPA5蛋白水平表達(dá)增高，且具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。在本研究中，小鼠MCAO前側(cè)腦室注射HSPA5 siRNA，LC3-II/LC3-I表達(dá)顯著降低，而且也會(huì)導(dǎo)致小鼠腦缺血皮層神經(jīng)細(xì)胞缺失及神經(jīng)行為學(xué)損傷加重，與自噬抑制劑3-MA作用相似。上述結(jié)果提示HSPA5介導(dǎo)的自噬可能在小鼠I/R中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但下一步仍需要利用HSPA5轉(zhuǎn)基因小鼠，通過透射電子顯微鏡明確I/R損傷后自噬的變化情況。

總之，本研究表明，干擾HSPA5后LC3-II/LC3-I表達(dá)降低，同時(shí)小鼠缺血性損傷加重，提示HSPA5誘導(dǎo)自噬可能在小鼠局灶性I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

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Effects of heat shock protein A5 induced autophagy on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice

PENG Zhi-feng1△, MENG Jian2, ZHANG Ji-hong1

(1. Department of Physiology, 2. Department of Anatomy, School of Medicine, Shanxi Datong University, Datong 037009, China)

Objective: To determine the role of heat shock protein A5 (HSPA5) induced autophagy on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Methods: Thirty-six BALB/c mice were randomly divided into sham group, ischcmia/reperfusion (I/R) group, vehicle+I/R group, 3-Methyladenine(3-MA)+I/R group, scramble siRNA group and HSPA5 siRNA+I/R group(n=6). In sham group, the operation was only performed, did not insert line switch. Focal cerebral ischemia was performed using the method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 60 min and 24 h reperfusion. In vehicle+I/R group and 3-MA+ I/R group, 2 μl 0.9% NaCl or 3-MA(30 mg/ml) was administered by intracerebroventricular injection 30 min before MCAO; In scramble siRNA+I/R group and HSPA5 siRNA+I/R group, 5 μl scramble siRNA or HSPA5 siRNA(2 μg/μl) was administered by intracerebroventricular injection 24 h before MCAO. Autophagosome in neuron, the expression of microtubule-associated protein light chain 3 (LC3)-II/LC3-I in ischemic cortex, the degree of cerebral ischemic injury and neurological function score were detected. Results: Initial electron microscopy showed that neuronal morphology appeared to be normal in the sham group. At 24 h after I/R, cell shrinkage, loss of cellular organelles and formation of autophagosomes were observed in the ischemic cerebral cortex of I/R group. In addition, autophagosomes were less frequently observed than that in I/R group. The expressions of LC3-II/LC3-I and Beclin-1 protein were increased significantly in I/R group compared with that in sham group(P<0.05). Compare with I/R group, the LC3-II/LC3-I protein levels induced by I/R in 3-MA+ I/R group or HSPA5 siRNA+ I/R group was decreased effectively (P<0.05). In addition, the cerebral ischemic injury and neurological symptoms after I/R in 3-MA+ I/R group or HSPA5 siRNA+ I/R group were exacerbated significantly (P<0.05). Conclusion: These results suggest that HSPA5 induced autophagy may play a protective role in focal I/R damage in mice.

HSPA5; autophagy; ischemia/reperfusion injury; mice

山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2015021178)；山西大同大學(xué)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(2014-B-01)

2016-07-12

2017-01-23

R363

A

1000-6834(2017)03-234-05

10.12047/j.cjap.5472.2017.058

△【通訊作者】Tel: 15910699956; E-mail: pzf181@126.com