張慧蘋， 馬麗千， 呂 藝， 羅紅敏， 李雨夢， 劉 銳， 胡 森

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷研究所休克與多器官障礙實驗室， 全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室， 北京 100048)

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二甲亞砜對酵母多糖致腸道屏障損傷的保護作用*

張慧蘋， 馬麗千， 呂 藝， 羅紅敏， 李雨夢， 劉 銳， 胡 森△

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷研究所休克與多器官障礙實驗室， 全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室， 北京 100048)

目的：探討二甲亞砜(DMSO)對酵母多糖誘導的腸道炎性因子釋放及腸屏障功能損傷的影響。方法：SD大鼠隨機分為4組：生理鹽水組(SS組)，DMSO組(DS組)，酵母多糖+生理鹽水組(ZS組)和酵母多糖+DMSO組(ZD組)。每組又分為傷后4 h和24 h兩個亞組。檢測腸組織細胞因子TNF-α和IL-10含量和血中二胺氧化酶 (DAO)活性，并對腸損傷程度進行組織學評分。結(jié)果：與ZS組相應時間點相比，ZD組腸組織TNF-α含量減少、IL-10含量增加，血中DAO活性降低，腸絨毛損傷減輕、腸損傷評分降低。結(jié)論：DMSO可抑制酵母多糖引起的腸組織炎性因子釋放，減輕腸屏障損傷程度。

二甲亞砜；酵母多糖；炎性因子；腸屏障；大鼠

腸屏障由機械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學屏障組成，完整狀態(tài)下可有效阻擋腸腔內(nèi)的細菌、毒素和大分子進入體內(nèi)，從而維護機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當腸粘膜通透性增加時，細菌和毒素等大分子進入腸壁和循環(huán)中，刺激腸粘膜下和循環(huán)中免疫細胞釋放炎癥因子，使腸道不僅作為致炎介質(zhì)產(chǎn)生的源地，同時也成為引發(fā)全身性炎癥反應和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1，2]的啟動器官。因此，保護腸屏障功能、抑制腸道致炎細胞因子的產(chǎn)生對腸道炎癥和MODS的防治有重要意義[3]。

二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)具有抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)、清除氧自由基等多種生物學效應[4]，在膀胱炎和關節(jié)炎治療方面的研究已有報道[5]，美國FDA已批準將DMSO用于間質(zhì)性膀胱炎的治療[6，7]。本研究擬觀察DMSO對酵母多糖誘導的腸組織炎癥反應及腸粘膜損傷的保護作用，為DMSO用于抑制腸源性炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、保護腸屏障功能提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑：酵母多糖(Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)；二甲亞砜(DMSO試劑購于北京欣怡生物科技有限公司)；二胺氧化酶(DAO試劑盒購自南京建成生物工程公司)；TNF-α，IL-10(上海依科賽生物制品有限公司)；氯胺酮購自福建古田藥業(yè)有限公司；速眠新Ⅱ購自軍事醫(yī)學科學院獸醫(yī)研究所； 顯微鏡：OLYMPUS DP71 B-51酵母多糖懸液的制備：酵母多糖用無菌生理鹽水配制成懸液(60 mg/ml)，高頻磁力攪拌混勻，置100℃ 水浴中80 min，晾至室溫，使用前加熱至40°C、并進行高頻振動混勻。

1.2 動物模型及實驗分組

實驗動物：雄性SD大鼠8～10周齡，體重 (251.5±8.7)g購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證書：SCXK(京)2014-0013大鼠在25°C條件下標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h光照/12 h黑暗。大鼠實驗前禁食過夜，自由飲水至術(shù)前4 h。動物模型制作方法：腹部消毒，腹腔注入酵母多糖懸液(750 mg/kg)1 h后，皮下注射DMSO(3 ml/kg 體重，DMSO∶生理鹽水稀釋=1∶2)或生理鹽水(3 ml/kg體重)。

動物隨機分為4組：(1)生理鹽水+生理鹽水(SS組，生理鹽水對照組)(腹部消毒，腹腔注入生理鹽水(3 ml/kg體重)1 h后，皮下注射生理鹽水(3 ml/kg體重)；(2)生理鹽水+DMSO組(DS組，藥物對照組)(腹部消毒，腹腔注入DMSO(3 ml/kg 體重，DMSO∶生理鹽水稀釋=1∶2)1 h后，皮下注射生理鹽水(3 ml/kg體重)。)；(3)酵母多糖+生理鹽水組(ZS組)(腹部消毒，腹腔注入酵母多糖(750 mg/kg)1 h后，皮下注射生理鹽水(3 ml/kg體重)。)；(4)酵母多糖+DMSO組(ZD組)(腹部消毒，腹腔注入酵母多糖懸液(750 mg/kg)1 h后，皮下注射DMSO(3 ml/kg 體重，DMSO∶生理鹽水稀釋=1∶2)，每組又分成處理后4 h和24 h兩個亞組(n=8)。

1.3 樣本采集

在相應的時間點，大鼠經(jīng)3%異氟烷吸入麻醉后，從腹主動脈取血，4℃、3 500×g 離心10 min，留取血漿用于測定二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性。處死動物，取遠端小腸組織，液氮速凍后存于-40℃，用于檢測組織TNF-α 和 IL-10含量。另留取部分遠端小腸組織，置10%中性甲醛中固定48 h，石蠟包埋、切片，用于組織學評分。

1.4 小腸組織TNF-α和IL-10含量的測定

小腸組織100 mg，加入1 ml PBS中，冰浴條件下電動勻漿；組織勻漿經(jīng)4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，用ELISA方法檢測TNF-α濃度；上清液蛋白濃度用BCA法測定。組織TNF-α含量以“pg/mg pro ”表示。

1.5 血漿DAO活性檢測

采用酶反應動力學法測定DAO活性，按說明書操作。

1.6 小腸組織學評分

小腸組織石蠟切片經(jīng)HE染色后，光鏡下觀測，每張切片隨機選擇3個視野，按Chiu’s評分標準(0-4 級)[8]對腸損傷程度進行評分。

1.7 統(tǒng)計學處理

結(jié)果以“均值±標準差”表示，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行處理分析，采用單因素方差分析，組間比較用SNK檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DMSO對腸組織細胞因子水平的影響

SS 組和DS組大鼠腸組織TNF-α水平和 IL-10水平(表1)相近。與SS 組和DS組相比，ZS組和ZD組大鼠小腸組織TNF-α和IL-10含量在4 h和24 h時均增加(P<0.05)，其變化有兩個特點：(1)ZD組TNF-α含量增加幅度小于ZS組(P<0.05，4 h組)，而IL-10含量增加幅度ZS組大于ZD組(P<0.05，4 h和24 h組)；(2)TNF-α含量的增加幅度在傷后24 h減少，而IL-10含量在傷后24 h進一步增加。

GroupTNF-α4h24hIL-104h24hSS4.7±0.835.1±0.4712.3±1.5611.7±1.32DS4.8±0.574.9±0.3511.9±0.7512.8±0.97ZS26.1±1.74*9.4±0.71*23.6±1.83*34.8±1.94*ZD22.7±0.85*9.1±0.83*#27.6±1.58*42.7±2.85*#

SS: Sham group of saline; DS: Sham group of DMSO; ZS: Zymosan+ saline group; ZD: Zymosan + DMSO group

*P<0.05vsSS group;#P<0.05vsZS group

2.2 DMSO對 DAO活性的影響

表2結(jié)果顯示，SS組和DS組大鼠血漿DAO活性沒有差異。ZS組和ZD組血漿DAO活性增加，傷后24 h時遠高于傷后4 h時間點，ZS組和ZD組分別增加了73.58%和67.08%。但傷后24 h時，ZD組血漿DAO活性低于ZS組(P<0.05)，提示DMSO可減輕腸粘膜上皮細胞的損傷，使腸粘膜上皮細胞中的DAO進入血漿減少。

Group4h24hSS21.5±2.121.4±3.1DS20.2±2.921.1±2.9ZS41.3±4.5*81.1±5.0*ZD37.8±6.8*65.1±4.7*#

SS: Sham group of saline; DS: Sham group of DMSO; ZS: Zymosan+ saline group; ZD: Zymosan + DMSO group

*P<0.05vsSS group;#P<0.05vsZS group

2.3 DMSO減輕腸組織損傷

光鏡觀察(圖1，見彩圖頁Ⅰ)看到，SS組和DS組顯示正常的粘膜形態(tài)：密集、較長、完整。與此相比，酵母多糖組顯示出明顯的粘膜受損。腸絨毛糜爛、充血、水腫、萎縮、絨毛間質(zhì)炎癥細胞浸潤，上皮細胞微絨毛壞死、脫落。這些改變隨時間而加重，但傷后24 h 時DMSO 治療組粘膜損傷有明顯改善(P<0.05)。采用Chiu’s評分系統(tǒng)[3]，對腸粘膜損傷進行組織學評分也看到(表3)，酵母多糖致傷組評分增加，傷后24 h損傷增幅更大，而DMSO可以減輕酵母多糖致傷所致腸損傷。

Group4h24hSS0.4±0.020.6±0.04DS0.3±0.010.5±0.09ZS1.8±0.25*4.2±0.29*ZD1.6±0.21*3.6±0.17*#

SS: Sham group of saline; DS: Sham group of DMSO; ZS: Zymosan+saline group; ZD: Zymosan + DMSO group

*P<0.05vsSS group;#P<0.05vsZS group

3 討論

酵母多糖腹腔注射通過激活補體系統(tǒng)、刺激巨噬細胞釋放大量炎性介質(zhì)、炎癥細胞氧自由基生成及溶酶體酶釋放[9-11]，引起無菌性腹腔炎癥，進而導致全身性炎癥反應和有效循環(huán)血量減少[12]。腸組織局部過強的炎癥反應和血流量減少均可削弱腸屏障功能，形成腸源性內(nèi)毒素血癥和細菌移位，從而進一步加重全身性炎癥反應，引發(fā)膿毒癥甚至MODS。因此，早期改善腸組織炎癥反應狀態(tài)、減輕腸屏障功能損傷對防止失控性全身炎癥反應有重要意義。

研究觀察到在酵母多糖腹腔注射模型中，酵母多糖致傷后4 h，小腸組織中致炎因子TNF-α含量大幅升高，傷后24 h有所回落；DMSO注射不影響正常大鼠小腸TNF-α含量，但明顯降低酵母多糖致傷大鼠小腸TNF-α的含量。以往研究發(fā)現(xiàn)，酵母多糖可與巨噬細胞表面TLR2結(jié)合，通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)通路上調(diào)TNF-α表達[13]。TNF-α對調(diào)控炎癥介質(zhì)表達的NF-κB具有正反饋激活作用，進一步上調(diào)其他細胞因子如ICAM-1的表達[14]，加重組織損傷。近年研究發(fā)現(xiàn)，DMSO能抑制LPS刺激的巨噬細胞和腸細胞系Caco-2中NF-κB活化[15,16]，下調(diào)細胞因子mRNA表達、降低TNF-α的生物活性。還有研究報道，DMSO抑制膿毒癥大鼠NF-κB活化和ICAM-1、TNF-α的基因表達[14]，對膿毒癥動物和炎癥性腸疾病具有改善作用[17]。

小腸組織中抗炎因子IL-10在酵母多糖致傷后也增加，傷后24 h比4 h增加的幅度更大，并且DMSO進一步增加小腸IL-10的含量。IL-10的抗炎作用與其抑制NF-κB活性相關，而DMSO可通過影響NF-κB活性發(fā)揮抗炎效應：(1)DMSO通過抑制IκB激酶的活性，阻止NF-κB與IκB的解離[18]；(2)DMSO 抑制NF-κB與 DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合，從而抑制相應的炎癥因子轉(zhuǎn)錄[19]。本研究中觀察到，在酵母多糖致傷大鼠，雖然小腸TNF-α和IL-10水平均大幅升高，但TNF-α 4 h模型損傷比24 h損傷嚴重，而IL-10 24 h模型損傷比4 h損傷嚴重；DMSO在抑制TNF-α升高的同時，促進IL-10進一步增加。表明DMSO在抑制酵母多糖引發(fā)的小腸炎癥因子生成的同時，促進抗炎因子的產(chǎn)生。酵母多糖致傷后早期ZD組腸組織TNF-α的減少可能和內(nèi)源性IL-10增加與外源性DMSO協(xié)同發(fā)揮抗炎作用有關。盡管致炎因子的增加有助于抗衡過度炎癥反應、減輕炎癥性損傷，但同時可抑制機體免疫機能，從而增加感染機會，加重病情。因此，在抗炎治療時應避免致炎和抗炎反應失衡而加重機體免疫紊亂。

DMSO不僅具有抗炎、止痛、改善微循環(huán)的作用，還能減少氧自由基生成，從而減輕肝缺血-再灌注、內(nèi)毒素及化學物質(zhì)導致的肝損傷和腎損傷[20,21]。本研究觀察DMSO對酵母多糖致傷后腸粘膜屏障的保護作用。DAO是存在于小腸粘膜上皮細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)酶，上皮細胞膜完整性受損時可釋放入細胞間質(zhì)和循環(huán)中。因此，血漿中DAO活性的增長間接地反映腸粘膜上皮細胞完整性的變化。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在酵母多糖致傷后，血漿中DAO活性升高，表明腸粘膜上皮細胞受損，并且損傷隨時間延長而加重。給予DMSO治療的動物，傷后24 h有明顯改善(P<0.05)。組織形態(tài)學觀察也表明，酵母多糖致傷組大鼠小腸粘膜受損，傷后早期即出現(xiàn)腸粘膜充血、水腫、絨毛間質(zhì)炎癥炎細胞浸潤；傷后24 h時損傷加重，呈現(xiàn)出腸粘膜糜爛，絨毛萎縮、壞死、脫落等損傷。而給予DMSO 治療組的大鼠，傷后24 h 時腸粘膜損傷有明顯改善(P<0.05)。DMSO對酵母多糖致傷大鼠腸屏障的改善作用與其抗炎、改善微循環(huán)及抗脂質(zhì)過氧化功能相關。

綜上所述，DMSO能夠改善酵母多糖誘導的腸組織炎癥反應，減輕腸屏障功能損傷。

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Protective effects of dimethyl sulfoxide on zymosan-insulted gut barrier impairment

ZHANG Hui-ping, MA Li-qian, LV Yi, LUO Hong-min, LI Yu-meng, LIU Rui, HU Sen△

(Laboratory for Shock and Multiple Organ Dysfunction of Burns Institute, Key Research Laboratory of Tissue Repair and Regeneration of PLA,and Beijing Key Research Laboratory of Skin Injury and Repair Regeneration, the First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital,Beijing 100048, China)

Objective: To explore the effect of dimethyl sulfoxide(DMSO) on suppressing the release of gut inflammatory cytokine and restore of the barrier impairment following zymosan-insulted systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Methods: S D rats were randomly divided into four groups: sham with administration of normal saline (SS group); sham with administration of DMSO (DS group); zymosan with administration of normal saline (ZS group); and zymosan with administration of DMSO (ZD group), each group includes two subgroups at 4 h and 24 h after surgery. At 4 h and 24 h after intraperitoneal injection of zymosan (750 mg/kg), the levels of intestinal inflammatory cytokines (tumor necrosis factor-α and interleukin-10) and the activity of diamine oxidase in plasma were examined. Intestinal injury was evaluated by using an intestinal histological score. Results: DMSO suppressed the release of tumor necrosis factor-α and increased interleukin-10 levels in the intestine compared with the ZS group at the corresponding time points. DMSO decreased the level of diamine oxidase in plasma compared with the ZS group. DMSO restored the injury of intestinal villi and the gut injury score was significantly lower than that in the ZS group. Conclusion: DMSO can suppress the release of intestinal inflammatory cytokines and restore zymosan-insulted gut barrier impairment.

DMSO; zymosan; inflammatory cytokines; gut barrier; rat

國家自然科學基金青年基金項目(81301607)；軍隊十一五專項課題(06Z055)

2016-03-29

2016-12-08

R333

A

1000-6834(2017)03-193-04

10.12047/j.cjap.5443.2017.049

△【通訊作者】Tel: 010-66867397; E-mail: bs0425@163.com