臧濤 向東

摘 要 以藍(lán)藥睡蓮為材料，采用響應(yīng)面分析法對(duì)睡蓮花總酚的水提工藝條件進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取溫度、液料比、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，利用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳提取工藝。結(jié)果表明，藍(lán)藥睡蓮總酚水提的最佳工藝條件為：提取溫度74 ℃、液料比 43 ∶ 1 mL/g、提取時(shí)間51 min，在此條件下所得總酚提取率為11.5%，與預(yù)測(cè)值基本相符合，為睡蓮花的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 藍(lán)藥睡蓮；水提；總酚；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào) O625.31；Q949.746.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The water extraction of total polyphenols from N. stellata Willd was studied by Response Surface Methodology（RSM）. On the basis of single factor experiments， the extraction temperature， liquid to material ratio and extraction time were selected as the experimental factors. The response surface optimization experiment was carried out using the principle of a central composite design. Results showed that the optimum extraction conditions were extracting temperature 74 ℃， liquid-material ratio 43 ∶ 1 mL/g， extracting time 51 min， and the total phenol extraction rate under this condition was 11.5%. The experimental predictions are basically consistent. The study would provide a theoretical basis for further study of lotus.

Key words Nymphaea stellata Willd； water extraction； total phenol； response surface methodology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.025

藍(lán)藥睡蓮（Nymphaea stellata Willd.）屬于睡蓮科睡蓮屬，是一種生長(zhǎng)在湖泊和河流岸邊的多年生水生熱帶草本植物，又被稱(chēng)之為星形睡蓮、藍(lán)睡蓮或延藥睡蓮[1]。其原產(chǎn)于印度和東南亞，在中國(guó)主要分布在海南、廣東及云南等地[2]。藍(lán)藥睡蓮作為尼泊爾、印度以及中國(guó)西藏的傳統(tǒng)藥物，具有廣泛的藥用價(jià)值，不僅具有抗菌、消炎、麻醉、止血、利尿等作用，還可以用于心悸、消化不良、腸炎、腹瀉、感冒等治療[3]?，F(xiàn)研究已表明，藍(lán)藥睡蓮中含有豐富的酚類(lèi)成分，如槲皮素、山奈酚、沒(méi)食子酸及它們的衍生物等[4]，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、預(yù)防心血管疾病等多種生物活性[5-8]。

目前，藍(lán)藥睡蓮產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用較少，主要應(yīng)用于鮮切花的觀賞和裝飾品，鮮切花保存期短，不易貯藏，浪費(fèi)較嚴(yán)重。中國(guó)花茶飲用歷史悠久，隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)健康和高品味生活的追求日益增加，藍(lán)藥睡蓮作為藥食兩用的資源，不僅可以作為花茶飲用，還可以制備成茶飲料等多種產(chǎn)品，減少了資源浪費(fèi)，具有廣泛的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。傳統(tǒng)的總酚提取工藝多采用有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等進(jìn)行提取[9]，容易導(dǎo)致有機(jī)溶劑的殘留，不利于藍(lán)藥睡蓮做為藥食兩用資源在食品、醫(yī)藥中的應(yīng)用。水提法不僅具有方便、簡(jiǎn)單、快速、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)[10]，而且減少了有機(jī)溶劑的使用，具有更加實(shí)用的價(jià)值和意義?，F(xiàn)已有學(xué)者對(duì)茶葉[11]、光皮木瓜[12]、肉桂[13]等酚類(lèi)物質(zhì)水提工藝進(jìn)行了研究，關(guān)于藍(lán)藥睡蓮總酚水提工藝的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)藍(lán)藥睡蓮中酚類(lèi)物質(zhì)的水提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝，為進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)利用睡蓮花提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)藥睡蓮：采自海南省?？谑屑t旗鎮(zhèn)。

試劑：Folin-酚（北京索萊寶科技有限公司）；沒(méi)食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，上海英偉生物科技公司）；無(wú)水碳酸鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司）。

儀器：HH-ZK4電恒溫水浴鍋（鞏義予華儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TS-RO-20L/H超純水設(shè)備（陶氏水處理設(shè)備工程有限公司）；SP-722可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 選取色澤新鮮已開(kāi)放的藍(lán)藥睡蓮花，去掉最外層帶有綠色的花瓣，切掉花柄，底部花托僅留3～5 mm，將其在60 ℃烘箱中烘干，將花瓣粉碎過(guò)80目篩后備用。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[14] 準(zhǔn)確稱(chēng)取沒(méi)食子酸100 mg，用超純水溶解并定容至100 mL。分別制得濃度為0.100、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，加入20 mg/mL 的Na2CO3溶液2 mL。2 min后，加入0.9 mL Folin-酚試劑，反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)測(cè)定各組溶液在750 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 睡蓮干花中酚類(lèi)物質(zhì)的提取及測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎后的睡蓮干花花瓣，按一定液料比加入蒸餾水，在設(shè)定的溫度下水浴浸提一定時(shí)間后，將浸提液進(jìn)行抽濾，將濾液移入100 mL容量瓶中，定容，用量程為0.2 mL的移液槍精確量取0.1 mL于10 mL刻度試管中，按1.2.2的方法進(jìn)行操作，測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出提取液中總酚的提取率。以不加提取液的空白處理作參比。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 以睡蓮花總酚的提取率為考察指標(biāo)，對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這3個(gè)因素對(duì)睡蓮花中總酚提取效果的影響。

提取溫度對(duì)睡蓮花總酚提取效果的影響：當(dāng)液料比為30 ∶ 1 mL/g時(shí)，分別在40、50、60、70、80、90 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚提取率。

液料比對(duì)睡蓮干花總酚提取效果的影響：當(dāng)液料比分別為20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1、70 ∶ 1 mL/g時(shí)，分別在70 ℃下水浴提取40 min后，按1.2.2的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚提取率。

提取時(shí)間對(duì)睡蓮花總酚提取效果的影響：當(dāng)液料比為30 ∶ 1 mL/g，溫度為70 ℃時(shí)，分別水浴提取10、20、30、40、50、60、70 min后，按1.2.2的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚提取率。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.05b軟件，采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則建立數(shù)學(xué)模型[15]，以睡蓮花中總酚的提取率為響應(yīng)值，對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化出最佳提取工藝條件。因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

如圖1所示，得回歸方程為y=1.317 5x+0.011 2，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 4，回歸分析表明，在0～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)睡蓮花中酚類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系，可用于定量分析。因此，利用回歸方程，根據(jù)吸光度，可計(jì)算總酚的提取率。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)總酚提取效果的影響 由圖2可知，隨著提取溫度的增加，總酚的提取率增大，提取液中總酚含量存在差異顯著，原因可能是隨著溫度的增加，酚類(lèi)物質(zhì)的溶出率增加，提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)70 ℃時(shí)，睡蓮花總酚提取率最高，繼續(xù)升高溫度，總酚提取率稍有下降，這是因?yàn)闇囟壬?，部分酚?lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能受高溫破壞或被氧化，導(dǎo)致提取率下降。當(dāng)溫度在80～90 ℃之間，差異不顯著。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)選擇60～80 ℃為適宜的提取溫度。

2.2.2 液料比對(duì)總酚提取效果的影響 由圖3可知，液料比對(duì)睡蓮干花花瓣總酚提取率有顯著影響，提取液的總酚含量在不同的液料比中存在顯著差異，隨著液料比的增加，睡蓮花總酚的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為40 ∶ 1 mL/g時(shí)，總酚提取率達(dá)最高，這是由于前期液料比較低，酚類(lèi)物質(zhì)沒(méi)有完全溶出，隨著液料比的增加，溶出的酚類(lèi)物質(zhì)達(dá)到最大，繼續(xù)增加一方面可能由于溶劑增多，其提取液濃度被稀釋了，導(dǎo)致提取率下降，另一方面可能是溶劑增大，使其他一些可溶性的雜質(zhì)溶解的量也逐漸增大，使得多酚提取含量下降[16]。因此，在響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)選擇液料比為30 ∶ 1～50 ∶ 1 mL/g為宜。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總酚提取效果的影響 由圖4可以看出，提取時(shí)間對(duì)睡蓮花總酚提取率具有一定的影響。隨著提取時(shí)間的增加，睡蓮花總酚提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在20～60 min，提取液中總酚含量存在差異顯著，當(dāng)時(shí)間為50 min時(shí)達(dá)到最大；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，總酚提取率下降，這可能是因?yàn)槎喾游镔|(zhì)較不穩(wěn)定，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生氧化分解，從而導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)提取率下降[17]。在提取時(shí)間為60～70 min時(shí)，總酚含量差異不顯著，因此，在響應(yīng)面試時(shí)選擇40～60 min為適宜的提取時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、液料比、提取時(shí)間為影響因素，采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到模型對(duì)應(yīng)的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=11.36+0.33A+0.34B+0.088C+0.1AB-0.16AC+0.063BC-0.42A2-0.77B2-0.25C2

為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可靠性，對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。該模型p<0.000 1，為差異極顯著，說(shuō)明該模型回歸方程的自變量和因變量的線性關(guān)系顯著；失擬項(xiàng)p=0.087 9>0.05，不顯著，且R=0.989 3，R2Adj=0.979 6，說(shuō)明該二次回歸模型是適當(dāng)?shù)模Ｐ团c實(shí)際擬合情況好，誤差較小，實(shí)驗(yàn)方法可靠。因此，可以利用該模型較好的分析和預(yù)測(cè)在不同條件下睡蓮花中總酚的提取情況。由表3可知，影響因素A提取溫度和B液料比對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響（p<0.01），影響因素C提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（p<0.05），此外，AC即提取溫度與提取時(shí)間之間的交互作用差異為極顯著（p<0.01），AB即提取溫度與液料比之間的交互作用差異為顯著（p<0.05），顯著表中各因素的F值可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)響應(yīng)值的影響越大，重要性越大[18]，分析可知，各因素對(duì)睡蓮花總酚提取率的影響程度大小順序?yàn)椋阂毫媳龋˙）>提取溫度（A）>提取時(shí)間（C）。

2.3.2 響應(yīng)曲面的分析與條件優(yōu)化 響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以形象的反映響應(yīng)值隨各因素的變化趨勢(shì)[19]。因此，采用Design Expert 8.05b軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，繪制了提取溫度、液料比、提取時(shí)間這3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)總酚提取率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，見(jiàn)圖5～7，可以看出液料比的響應(yīng)曲線陡峭，隨著液料比的增大，提取率上升較明顯，說(shuō)明液料比對(duì)總酚提取率的影響較大，另外，等高線的形狀可以反映兩因素之間的交互作用，等高線形狀為橢圓形時(shí)說(shuō)明兩因素之間的交互作用顯著，為圓形時(shí)說(shuō)明交互作用不顯著[20]。圖6等高線圖形狀為橢圓形，說(shuō)明AC之間存在顯著的交互作用，圖7等高線圖形狀近似于圓形，說(shuō)明BC之間的交互作用不顯著，這與上述方差分析結(jié)果相符合。

利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)總酚提取率的工藝進(jìn)行優(yōu)化得到最佳工藝條件為：提取溫度74.08 ℃、液料比42.51 mL/g、提取時(shí)間50.81 min，預(yù)測(cè)總酚提取率理論值為11.47%，在此優(yōu)化條件下，根據(jù)實(shí)際可操作情況，將工藝調(diào)整為：提取溫度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取時(shí)間51 min，經(jīng)3次試驗(yàn)得到的睡蓮花總酚提取率平均值為11.5%，與理論值接近，說(shuō)明此模型可行。

3 討論

目前，關(guān)于植物多酚提取工藝的研究報(bào)道較多，但對(duì)藍(lán)藥睡蓮總酚提取工藝的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。藍(lán)藥睡蓮中富含有多種酚類(lèi)物質(zhì)，景贊等[14]對(duì)藍(lán)藥睡蓮中多酚類(lèi)物質(zhì)抗氧化活性和降糖作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藥睡蓮中酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，具有明顯的抗氧化活性和降糖作用，可廣泛應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥等行業(yè)，而藍(lán)藥睡蓮在實(shí)際作為食品和藥品的應(yīng)用中多采用水進(jìn)行浸提，因此有必要對(duì)其水提工藝條件進(jìn)行研究。

響應(yīng)面分析法是一種利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，并通過(guò)回歸方程來(lái)尋找最佳響應(yīng)值的統(tǒng)計(jì)方法[16]。該法與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)相比，不僅能了解在提取過(guò)程中不同因素之間的交互作用程度，而且能更加精確的確定提取工藝的最佳點(diǎn)，對(duì)于非線性影響因素的預(yù)測(cè)指導(dǎo)性更強(qiáng)，具有更好的應(yīng)用價(jià)值[21]。因此，本試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)含量影響較大的因素，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)睡蓮花總酚提取率的水提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Design Expert 8.05b軟件，根據(jù)中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則進(jìn)行試驗(yàn)，建立了合理可靠的數(shù)學(xué)模型，得到了因素的主效應(yīng)關(guān)系為：液料比>提取溫度>提取時(shí)間，最后確定最佳的工藝參數(shù)為：提取溫度74 ℃、液料比43 ∶ 1 mL/g、提取時(shí)間51 min。該工藝安全、經(jīng)濟(jì)又實(shí)用，為睡蓮花茶飲料等產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，以及深入研究睡蓮花提供了一定的參考價(jià)值和理論依據(jù)。

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