程樂樂 李增平 王貴貴 羅大全

摘 要 對(duì)海南棕櫚科植物上一種新發(fā)現(xiàn)的病害（柄腐?。┻M(jìn)行了病原鑒定和致病性測(cè)定，并對(duì)病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性的測(cè)定，為該病的防治提供理論依據(jù)。致病性測(cè)定表明：從發(fā)病植株分離所得菌株在椰子葉柄和檳榔莖桿上成功定殖并擴(kuò)展，并從變色部位分離得到相同的菌株，表明分離菌為病原菌；通過觀察病原菌宏觀形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和ITS序列分析，確定病原菌為棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]，并在木屑培養(yǎng)基和甘蔗段上成功誘導(dǎo)出該菌的子實(shí)體。對(duì)棕櫚淺孔菌菌絲的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，30 ℃、連續(xù)黑暗、pH5、麥芽糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏是菌絲生長(zhǎng)最適條件。

關(guān)鍵詞 棕櫚科植物；柄腐??；棕櫚淺孔菌；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) TQ641 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Identification and biological characteristics of the pathogen from the petiole rot disease in palmaceous plants were reported in this study. The pathogenicity of the strain isolated from the diseased plant was tested， the mycelium was successfully colonized and expanded on the coconuts petiole and betelnuts stem， and the same strain was isolated from the discolored part， indicating that the fungus was the pathogen. According to the basidiocarps of the pathogen morphology and microstructure， the pathogen was identified as Grammothele fuligo（Berk.&Broome）Ryvarden， and the fruiting bodies were successfully induced on the sawdust medium and the sugarcane section. Biological characteristics tests showed that 30 ℃， continuous darkness， pH5， maltose， soya peptone and yeast extract were the optimum growth conditions for mycelia.

Key words Palmae； petiole rot disease； Grammothele fuligo（Berk.&Broome）Ryvarden； biological characters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.022

棕櫚科（Palmae）植物是隸屬于單子葉植物綱（Monocotytedoneae）、檳榔目（Crecales）的植物，棕櫚科植物泛熱帶分布，生長(zhǎng)于南、北緯40°之間[1]。據(jù)報(bào)道，全世界棕櫚科植物約222屬2 500種，在中國(guó)的南部、西南部臺(tái)灣、海南島分布22屬72種[2]。棕櫚科植物在熱帶森林中廣泛存在，適生于各種環(huán)境，是熱帶雨林植物群落的典型代表[3]。棕櫚科植物不僅是海南重要的經(jīng)濟(jì)作物（如椰子、檳榔等），很多種類還是重要的景觀植物（如大王棕、中東海棗等），它們?cè)跓釒мr(nóng)業(yè)和熱帶園林中的地位十分重要。覃偉權(quán)等[4]記錄了棕櫚科植物上發(fā)生的病害78種，病原多為半知菌類真菌，少數(shù)為卵菌門、子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌，極少數(shù)為細(xì)菌、藻類、植原體和原生動(dòng)物。目前已報(bào)道擔(dān)子菌門的棕櫚科植物病原菌有狹長(zhǎng)孢靈芝[Ganoderma boninense]、靈芝[Ganoderma lucidum]、樹舌靈芝[Ganoderma applanatum]、南方靈芝[Ganoderma australe]、有害木層孔菌[Phellinus noxius]、假蜜環(huán)菌[Armillariella tabescens]、白微皮傘[Marasmiellus candidus]和裂褶菌[Schizophyllum commune][4-10]。筆者在環(huán)島采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)有很多種類的棕櫚科植物活立木的葉柄基部被一種藍(lán)灰色真菌侵染，初步鑒定為淺孔菌屬真菌，引起柄腐癥狀，取名為柄腐病，此病在海南多個(gè)市縣均有發(fā)生，嚴(yán)重影響了棕櫚科植物的觀賞價(jià)值，對(duì)植株的長(zhǎng)勢(shì)亦造成較大的影響。本研究從發(fā)病植株葉柄基部采集樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行種類鑒定、致病性測(cè)定和生物學(xué)特性測(cè)定，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病樣 2015年10月至2017年1月，從海南省各市縣的棕櫚科植物上采集柄腐病樣本，編號(hào)后帶回室內(nèi)進(jìn)行分離和鑒定。

1.1.2 供試苗木 1年生甘蔗莖段、4年生椰子幼樹、20年生的結(jié)果檳榔樹。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基和橡膠樹木屑培養(yǎng)基，參考《植病研究方法》[11]和李增平等[12]的方法進(jìn)行配制。

1.1.4 ITS分析主要試劑 引物為華大基因提供的ITS1和ITS4，DNA Marker DL 2 000，OMEGA Extraction Kit，OMEGA Fungal DNA Kit，Taq-Mixture等，同程樂樂等[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離和致病性測(cè)定 菌株分離：采用常規(guī)組織分離法分離致病菌[11]。

致病性測(cè)定：椰子葉柄接種，先用70%酒精擦拭待接種的4年生健康椰子植株的葉柄背面，再用刀削出六個(gè)直徑約2 cm的傷口，其中五個(gè)傷口接1 cm×1 cm大小的分離菌菌餅，最上一個(gè)傷口接空白PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，用濕棉花保濕并用塑料袋包裹；檳榔莖桿接種，與程樂樂等[13]方法一致。接種后定期觀察葉柄癥狀，每30 d觀察1次，并進(jìn)行拍照和記錄。

1.2.2 病原菌鑒定 形態(tài)觀察參考戴玉成等[14]的方法，觀察子實(shí)體樣本的宏觀特征及顯微結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行染色、拍照和使用Imagine Pro Plus 5.0軟件測(cè)量菌絲及擔(dān)孢子大小。ITS序列分析與程樂樂等[13]的方法一致。

1.2.3 子實(shí)體誘導(dǎo) 橡膠樹木屑培養(yǎng)基誘導(dǎo)：將配制好的橡膠樹木屑培養(yǎng)基分裝在組培瓶（350 mL）中，滅菌120 min。從純化培養(yǎng)的菌株菌落上挑取直徑為1 cm大小的菌餅2塊，接種到滅菌好的橡膠樹木屑培養(yǎng)基上，置于室溫下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)開蓋保濕培養(yǎng)，定期觀察有無子實(shí)體形成。

甘蔗莖段誘導(dǎo)：從純化培養(yǎng)的菌株菌落上取直徑為1 cm大小的菌餅，接種到創(chuàng)傷的甘蔗段上并保濕，在室溫下進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，定期觀察有無子實(shí)體形成。

1.2.4 生物學(xué)特性測(cè)定 選菌齡一致的培養(yǎng)菌，打取直徑5 mm的圓形菌餅，在PDA平板上于ZSH-70型生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)4次，待菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)用十字交叉法測(cè)量其直徑。分別設(shè)置：溫度10、15、20、25、28、30、32、35和42 ℃共9個(gè)梯度；光照采用15 W照明燈，分別設(shè)連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和光暗交替3種處理；pH值設(shè)置2、3、4、5、6、7、8、9、10共9個(gè)pH梯度；碳源用含碳百分比相同的D-半乳糖、D-果糖、D-木糖、葡萄糖、麥芽糖、α-乳糖、D-山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油共10種碳源分別替換Czapek培養(yǎng)基中的碳源，并以原培養(yǎng)基中的蔗糖碳源和缺碳為對(duì)照組；氮源用含氮百分比相同的硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨、草酸銨、L-天門冬酰胺、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、酵母浸膏共10種氮源分別替換Czapek培養(yǎng)基中的氮源，并以原培養(yǎng)基中的硝酸鈉氮源和缺氮為對(duì)照組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 9.1.3、Duncans multiple range test對(duì)所測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕櫚科植物柄腐病癥狀

2015年10月至2017年1月，在海南省海口、東方、儋州、三亞、文昌、萬寧、昌江、澄邁、定安、樂東、陵水等地調(diào)查時(shí)均發(fā)現(xiàn)有多種棕櫚科植物發(fā)生柄腐病，病菌寄主主要有中東海棗（Phoenix sylvestris Roxb.）、蒲葵[Livistona chinensis（Jacq.）R. Br.]、椰子（Cocos nucifera L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）、軟葉刺葵（Phoenix roebelenii O. Brien）等，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該病菌可腐生在檳榔（Areca catechu L.）、大王棕[Roystonea regia（HBK.）O.F. Cook]及椰子等棕櫚科植物的死樹頭及倒干上。病菌主要從割葉傷口，風(fēng)害、蟲害等所造成的傷口處侵入葉柄組織，受害葉柄表面組織變褐色至深褐色，病斑邊緣具明顯的黃色暈圈，后期病斑變枯白色，葉柄失水干縮，內(nèi)部組織發(fā)生白腐，多雨潮濕季節(jié)在病部表面或側(cè)面生出藍(lán)灰色膜狀擔(dān)子果。條件適宜時(shí)，病菌可沿葉柄侵入莖干內(nèi)部造成莖干組織白腐，導(dǎo)致病株生長(zhǎng)減慢，葉片提早枯黃，樹冠明顯縮小，嚴(yán)重影響植株長(zhǎng)勢(shì)，重病株后期整株枯死。嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)30%（圖1）。

2.2 致病性測(cè)定

接種60 d后觀察葉柄，發(fā)現(xiàn)接種部位變?yōu)楹诤稚?，且變色范圍大，深入?nèi)部組織。對(duì)照組只是在傷口邊緣略微變黑。取發(fā)病變色的組織進(jìn)行分離，重新分離獲得了培養(yǎng)形狀與最初分離菌一致的菌株；接種90 d后檢查接種分離菌的檳榔植株莖干基部，其基部組織也發(fā)生了白腐，對(duì)照僅表皮變褐。表明該分離菌為致病菌（圖2）。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 菌落特征：在PDA平板上純化后的菌落呈白色（圖3-A），菌絲毛絮狀，培養(yǎng)一段時(shí)間后菌絲變?nèi)榘咨q毛狀消失，菌落出現(xiàn)褐色斑塊（圖3-B）。在組培瓶上培養(yǎng)100 d和在甘蔗段上培養(yǎng)93 d后長(zhǎng)出與田間相同的擔(dān)子果（圖3-C、D）。

子實(shí)體：子實(shí)體平伏生長(zhǎng)在基物表面，孔面藍(lán)灰色，管口7～9個(gè)/mm（圖4-A）。

顯微結(jié)構(gòu)：菌絲系統(tǒng)三體型：生殖菌絲無色透明，薄壁，在棉藍(lán)試劑中變成藍(lán)色，直徑為1.619～5.008 μm；骨架菌絲灰褐色，厚壁，在棉藍(lán)試劑中不變色，直徑為2.154～4.245 μm（圖4-B）；纏繞菌絲無色至淺褐色，厚壁，有短小的分枝，在棉藍(lán)試劑中部分變藍(lán)，直徑為2.056～3.294 μm（圖4-C）；擔(dān)子無色，薄壁，棍棒狀，大小為3.558～4.996 μm，在棉藍(lán)試劑中不變色（圖4-D）；擔(dān)孢子橢圓形或卵圓形，壁光滑，一端有尖狀突起，在棉藍(lán)試劑中孢子變藍(lán)，大小為5.652～7.557 μm×2.396～3.386 μm，平均長(zhǎng)為6.510 μm，平均寬為2.788 μm，長(zhǎng)寬比為Q=1.76～2.68（圖4-E）。其形態(tài)特征與戴玉成[14]報(bào)道的棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]相同。

2.3.2 rDNA-ITS序列比對(duì) 測(cè)序所得rDNA-ITS序列為608 bp，將其在NCBI上進(jìn)行Blastn比對(duì)，所得ITS序列（NCBI登錄號(hào)為KY971636）與NCBI登錄號(hào)為KJ831827.1和KJ831834.1的相似度達(dá)100%，與KP012931.1、HQ248224.1、GQ355956.1等的序列相似度達(dá)99%，這些序列所對(duì)應(yīng)的真菌為棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]。結(jié)合形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS序列分析，鑒定此病原菌為棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]。

2.4 生物學(xué)特性測(cè)定

2.4.1 不同溫度對(duì)棕櫚淺孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

病菌菌絲在15～35 ℃之間均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，低于10 ℃或高于42 ℃時(shí)不生長(zhǎng)（圖5）。

2.4.2 不同光照對(duì)棕櫚淺孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

在所測(cè)定的3種不同光照條件下，菌絲在連續(xù)黑暗條件下生長(zhǎng)速度最快，連續(xù)光照和光暗交替條件下生長(zhǎng)速度無差異（圖6）。

2.4.3 不同pH對(duì)棕櫚淺孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在pH 3～7間均可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的pH為5，pH值小于2或大于8時(shí)菌絲均不生長(zhǎng)（圖7）。

2.4.4 不同碳、氮源對(duì)棕櫚淺孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響

在測(cè)試的碳源中，從菌落平均直徑的大小來看，肌醇和蔗糖的菌落平均直徑最大，其次是D-半乳糖和麥芽糖，甘油的平均直徑最??；從菌落菌絲層生長(zhǎng)密度來看，在葡萄糖、D-果糖、麥芽糖和α-乳糖中菌絲層較其它組稍厚些，在D-山梨醇和甘露醇的菌絲層最薄，為一層極薄菌絲。從菌落平均直徑大小和形態(tài)兩方面綜合考慮，此菌最適生長(zhǎng)的碳源為麥芽糖（表1）。

氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：①在非復(fù)合氮源中，從菌落平均直徑的大小來看，L-天冬酰胺、硝酸銨和硫酸銨的菌落平均直徑最大，其次是缺氮、硝酸鉀、硝酸鈣和氯化銨，硝酸鈉的平均直徑最??；從菌落生長(zhǎng)勢(shì)來看，在L-天冬酰胺中生長(zhǎng)的菌落最濃密，其次是銨鹽，在硝酸鹽和缺氮中的菌絲層稀薄。②在復(fù)合氮源中，從菌落平均直徑的大小來看，大豆蛋白胨和酵母浸膏的菌落平均直徑比牛肉膏更大，三者的菌絲層厚度相差無幾。從菌落平均直徑大小和形態(tài)兩方面綜合考慮，此菌最適生長(zhǎng)的非復(fù)合碳源為L(zhǎng)-天冬酰胺、硝酸銨和硫酸銨，最適生長(zhǎng)的復(fù)合碳源為大豆蛋白胨和酵母浸膏。對(duì)于所測(cè)定的氮源種類，該病原菌在復(fù)合氮源中生長(zhǎng)最好，其次為氨基酸類，再次是銨鹽，對(duì)硝酸鹽的利用率最低（表2）。

3 討論

淺孔菌屬真菌遍布于熱帶，在東非、中國(guó)、印度、牙買加、日本、委內(nèi)瑞拉、夏威夷、伯利茲和巴西的棕櫚科植物上均有發(fā)現(xiàn)[15]，但鮮有對(duì)其致病和生物學(xué)特性的相關(guān)研究。本研究記述了淺孔菌所致棕櫚科植物柄腐病的田間癥狀，進(jìn)行了致病測(cè)定、形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定后，確定其為棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]，是一種擔(dān)子菌門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、淺孔菌屬的病原木腐菌，可引起中東海棗、蒲葵、椰子、油棕、軟葉刺葵等棕櫚科植物柄腐病，同時(shí)可腐生在檳榔、大王棕及椰子等棕櫚科植物的死樹頭及倒干上。淺孔菌屬最初是由Berkeley & Curtis等[16]鑒定描述的，原先置于伏革菌科（Corticiaceae s. lat.），因其具有平伏的擔(dān)子果，不發(fā)達(dá)、不規(guī)則的孔口和受限的子實(shí)層的特征[17]，Kirk等[18]其歸于淺孔菌科（Grammotheleaceae Jülich）。但是Larsson[19]根據(jù)其二體系的菌絲系統(tǒng)和對(duì)其DNA序列的分析，將淺孔菌屬歸屬于多孔菌科。本研究中采用Larsson的分類，將棕櫚淺孔菌置于多孔菌科（Polyporaceae Corda）。Karasiński等[20]描述了棕櫚科植物相關(guān)的淺孔菌屬真菌Grammothele bolivianus Karasiński，其與棕櫚淺孔菌的擔(dān)子果顏色相似，但菌孔和擔(dān)孢子比其更大。筆者觀察到的菌絲系統(tǒng)和擔(dān)孢子與戴玉成[14]所描述的棕櫚淺孔菌[Grammothele fuligo（Berk. & Broome）Ryvarden]特征相符。

棕櫚淺孔菌可生長(zhǎng)于單子葉植物腐爛組織上，但主要生長(zhǎng)在棕櫚科植物上，田間調(diào)查時(shí)在海南南渡江邊生長(zhǎng)的佛肚竹（Bambusa ventricosa McClure）上發(fā)現(xiàn)此菌也能引起其莖腐病。本研究通過對(duì)甘蔗莖段接種，成功誘導(dǎo)出了棕櫚淺孔菌的擔(dān)子果，表明棕櫚淺孔菌也可在甘蔗莖上腐生。生物學(xué)特性測(cè)定表明：棕櫚淺孔菌菌絲最適生長(zhǎng)條件為30 ℃，黑暗、pH5、麥芽糖、大豆蛋白胨或酵母浸膏。棕櫚淺孔菌在海南島分布廣泛，幾乎全島均有分布，雖然它為弱寄生的傷口侵入病原菌，但海南臺(tái)風(fēng)多，高溫高濕的時(shí)間長(zhǎng)，臺(tái)風(fēng)會(huì)對(duì)椰子、蒲葵、中東海棗、油棕、軟葉刺葵等棕櫚科觀賞植物造成大量傷口，利于棕櫚淺孔菌的侵入，在高溫高濕的環(huán)境中擴(kuò)展較快，其柄腐病發(fā)生嚴(yán)重，建議生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)此病后及時(shí)清除病殘組織，集中后深埋或燒毀，減少侵染來源。同時(shí)對(duì)積水的栽培園清溝排水，及時(shí)砍除病株枯葉和鏟除園內(nèi)雜草，保持園內(nèi)通風(fēng)透光，降低濕度，可有效防止柄腐病的發(fā)生及擴(kuò)展。

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