高慧珍，陳理星，董定娟，高甜甜，黃敏婕，徐寧迎

（浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因家族在金華豬和長白豬中的組織表達分析

高慧珍，陳理星，董定娟，高甜甜，黃敏婕，徐寧迎*

（浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058）

miR-let-7基因廣泛參與動物組織器官的發(fā)育調控，其表達具有組織特異性。本研究選用70 d的金華豬和長白豬公豬（各3頭），采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術檢測了let-7基因家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在心臟、肝、脾、肺、腎、小腸中的表達量，分析它們在組織間及品種間的表達差異，重點分析了在小腸中的表達差異。結果表明：let-7基因家族在長白豬肝組織中表達量顯著高于其他組織（P＜0.05），在金華豬小腸和心臟中顯著高于其他組織（P＜0.05）；在小腸中，金華豬let-7a和let-7c基因表達量極顯著高于其他成員（P＜0.01），長白豬let-7a基因表達量極顯著高于其他成員（P＜0.01），let-7在小腸的表達存在品種間差異，金華豬的let-7a和let-7d-3p基因表達量極顯著高于長白豬（P＜0.01），let-7c基因顯著高于長白豬（P＜0.05），而let-7e基因卻顯著低于長白豬（P＜0.05）。本研究結果為探究miR-let-7基因在金華豬和長白豬生長和脂肪形成方面的分子作用機制提供了參考。

miR-let-7；基因相對表達量；組織表達；小腸；豬

microRNA（miRNA）介導的調控方式是基因表達調控機制中不可或缺的重要組成部分。通過對miRNA的研究發(fā)現(xiàn)，基因組的非組蛋白編碼區(qū)蘊藏著重要的生命功能活動信息，miRNA參與調控哺乳動物一系列的生物學過程，包括發(fā)育和衰老及死亡的時序調控[1]、肌細胞分化[2]、脂肪代謝和脂肪細胞分化[3]、腦及神經發(fā)育[4]、心臟發(fā)育[5]等。miR-let-7基因最早是在線蟲中發(fā)現(xiàn)，是線蟲發(fā)育的時間調控器[6]，被認為是miRNA的代表。miR-let-7基因可以促進成年動物體內脂肪細胞[7]、心肌細胞[8]以及肝臟和卵巢的發(fā)育，對青春期的時序和體型的調控有著重要的影響[9]。對miRNA調控機制的研究為動物生長及品質調控分子機制的研究奠定了基礎，對調控動物肌肉和脂肪組織生長發(fā)育和肉品質等性狀具有重要意義。金華豬是我國著名的優(yōu)良地方豬種之一，主要分布在浙江省，頭部和尾部呈黑色，中間體部為白色，又稱“兩頭烏”，具有肉質好、皮薄骨細、性成熟早、繁殖率高等優(yōu)點，常被用于腌制優(yōu)質火腿。長白豬又名蘭德瑞斯豬，原產于丹麥，體軀長，被毛白色，是典型的瘦肉型豬種，具有生長快、體形大、產仔多、飼料利用率高等優(yōu)點。金華豬和長白豬在生長速度、肌內脂肪含量等方面存在著極大的差異。豬的脂肪消化和吸收主要在小腸，脂肪合成主要在肝臟。本研究通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）分析比較金華豬和長白豬肝臟、小腸及其他組織中miR-let-7基因的表達，為進一步研究miRNA在豬的生長發(fā)育過程中對生長速度和脂肪合成發(fā)揮的調控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取相同飼養(yǎng)條件下70 d的金華豬和長白豬公豬（各3頭），體重在（8.87±0.09）kg。采集心臟、肝、脾、肺、腎、小腸組織，每個部位取3個重復樣品，立即投入液氮中速凍，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 熒光定量PCR儀為Step one plusPCR System(ABI)，NanoDrop2000c核酸分析儀，引物序列由上海Invitrogen公司合成。Trizol法提取總RNA，miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒（TIANGEN，北京），miRcute Plus miRNA qPCR 檢測試劑盒（TIANGEN，北京）。

1.3 RNA的提取及反轉錄 用Trizol試劑提取組織總RNA，用NanoDrop2000c核酸分析儀檢測RNA濃度和純度，OD260/280均在1.8～2.0，RNA濃度和純度都符合用miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒反轉錄的要求。

1.4 實時熒光定量PCR 用反轉錄的cDNA按照miRcute Plus miRNA qPCR 試劑盒說明書利用通用引物和特定的miRNA引物在Step one plus （PCR System(ABI)）儀器上進行反應。反應體系：2× miRcute Plus miRNA Premix（含SYBR, 含ROX）10 μL， 上、下游引物 （10 μmol/L）各0.4 μL，miRNA第1鏈cDNA 2 μL，50× ROX Reference Dye 2 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：95℃起始模板變性 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計分析 本研究采用相對實時熒光定量qRT-PCR 法，內參引物為Met-tRNA。采用2-ΔΔCt方法來計算基因在組織中的相對表達量，實驗數據用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析來分析miR-let-7在金華和長白豬的不同組織間的表達差異性，采用LSD進行多重比較。采用t檢驗法分析miR-let-7在品種間的肝和小腸組織中的表達差異性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。結果數據用平均值±標準誤表示。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 miR-let-7基因熒光定量擴增結果 從圖1可以看出，擴增曲線為平滑的S型曲線，基線平整，拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性好。由圖2可知，熔解曲線均為單峰，且重合性好，說明擴增產物單一，引物特異性強，可以用于進一步分析。說明本實驗中熒光定量PCR反應特異性和重復性良好，表達定量檢測結果可靠。

圖1 熒光定量PCR擴增曲線

2.2 miR-let-7基因成員在不同組織中表達量的比較 相對實時熒光定量PCR檢測miR-let-7家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金華豬和長白豬6個組織的表達量，利用SPSS20. 0軟件進行單因素方差分析并采用LSD法進行多重比較。由圖3可知，在長白豬中，let-7a和let-7c在肝組織的表達量顯著高于其他組織（P ＜0.05），7d-3p基因在肝組織的表達量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7e和let-7g基因在肝、腎組織的表達量顯著高于其他組織（P＜0.05），let-7f基因在肝、心臟中的表達量顯著高于其他組織（P ＜0.05）；在金華豬中，let-7a和let-7e基因在心臟中的表達量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7c基因在心臟、小腸組織中的表達量顯著高于其他組織（P ＜0.05），let-7d-3p和let-7g基因在小腸和心臟中的表達量極顯著高于其他組織（P ＜0.01），let-7f基因在心臟的表達量顯著高于其他組織（P ＜0.05）。let-7基因家族成員在長白豬的肝組織中表達最高，在金華豬的小腸中表達最高、心臟次之。

2.3 miR-let-7基因在小腸中的表達差異分析 如圖4所示，let-7基因在金華豬和長白豬小腸中的表達模式不同。在金華豬小腸組織中，let-7a和let-7c基因表達量最高，極顯著高于其他成員（P＜0.01），let-7g表達量較高，let-7d-3p、let-7e和let-7f在小腸中都是低表達，且三者間無差異。在長白豬的小腸中，let-7a基因表達最高，極顯著高于其他成員（P ＜0.01）；let-7c、let-7e和let-7f的表達量較高，且三者間無差異，let-7d-3p、let-7f表達量最低，兩者間無差異。let-7基因成員在小腸中的表達也存在品種間的差異，在金華豬小腸中，let-7a和let-7d-3p基因表達量極顯著高于長白豬（P ＜0.01），let-7c基因表達量顯著高于長白豬（P＜0.05），而let-7e基因卻顯著低于長白豬（P ＜0.05）。

圖3miR-let-7基因在金華和長白豬各組織中的相對表達量

圖4miR-let-7基因在金華和長白豬小腸組織中的相對表達量

3 討 論

與其他miRNA一樣，miR-let-7基因的表達具有組織特異性[10]，在豬的肝臟、心臟和胸腺組織上有120個miRNA被鑒定出來，其中miR-499和miR-208在心臟中特異性表達，miR-122則是在肝臟特異性表達[11]。本研究結果顯示，let-7基因家族6個成員（let-7a、let-7c、let-7d-3p、let-7e、let-7f、let-7g）在金華豬和長白豬心臟、肝、脾、肺、腎、小腸中均有表達，這與前人研究的let-7基因參與了心臟[12]、骨骼和肌肉[13]等器官的發(fā)育調控的結果相一致。但每個基因成員在各組織的表達量存在差異，let-7基因家族成員在長白豬的肝組織中表達量高于其他組織，在金華豬的小腸中表達量最高，心臟次之。趙俊生等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，大約克夏豬的let-7i基因在小腸組織中的表達量顯著高于其他組織。let-7基因家族成員在金華豬和長白豬小腸組織中表達模式不同，說明let-7基因通過基因表達量的變化實現(xiàn)對組織的調控作用。雖然let-7a基因在金華豬和長白豬的小腸組織中表達量都極顯著高于其他組織，但金華豬let-7a基因表達量極顯著高于長白豬；趙俊生等也發(fā)現(xiàn)miR-let-7i基因在金華豬和大約克夏豬的心臟、肝、脾、肺、腎、胰和皮脂中都有表達，但表達量存在品種間差異[14]。王云霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著let-7a的表達上調，細胞凋亡率增大；也有前人發(fā)現(xiàn)，let-7基因家族能直接或間接地作用于相關的細胞周期基因，在調控細胞分裂和分化方面發(fā)揮重要的作用[16-17]。小腸中miR-let-7基因的表達對小腸的生長抑制和潘氏細胞的增殖有關鍵作用[18]。let-7a在細胞生長增殖方面有重要的調控作用。苗志國等[19-21]檢測發(fā)現(xiàn)，與長白豬相比，金華豬具有較低的始重、終重和平均日增重，有較高的胴體脂肪率、平均背膘厚、肌內脂肪；回腸黏膜絨毛高度在80 d和125 d時都顯著低于長白豬，隱窩深度顯著高于長白豬。豬對營養(yǎng)物質，尤其是脂肪的消化和吸收主要在小腸，所以金華豬和長白豬小腸的結構差異影響著兩豬種的生長和脂肪形成方面的差異。推測由于let-7a基因的表達影響了小腸細胞的生長增殖，進而影響小腸對營養(yǎng)物質的消化吸收，let-7a基因在金華和長白豬小腸中的表達差異一定程度地影響了兩豬種在生長發(fā)育和脂肪沉積方面的差異。此后，筆者的研究將預測和篩選miR-let-7可能的靶基因，以了解miR-let-7對小腸影響的分子機制和功能，為進一步探究miRNA的調控網絡奠定基礎，并檢測miR-let-7前體基因多態(tài)性，分析其多態(tài)性與肉質或生長性狀的關聯(lián)，以期成為豬的肉質及生長標記。

[1] Ambros V. MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing[J]. Cell, 2003, 113(6): 673-676.

[2] Townley-Tilson W H, Callis T E, Wang D. MicroRNAs 1, 133, and 206; Critical factors of skeletal and cardiac muscle development, function and disease[J]. Int J Biochem Cell B, 2010, 42(8): 1252-1255.

[3] Parra P, Serra F, Palou A. Expression of adipose microRNAs is sensitive to dietary conjugated linoleic acid treatment in mice[J]. PLoS One, 2010, 5(9): e13005.

[4] Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing[J]. Cell, 2007, 129(7): 1401-1414.

[5] Zhao Y, Samal E, Srivastava D. Serum response factor regulates a muscle- specific microRNA that targets hands during cardiogenesis[J]. Nature, 2005, 436: 214-220.

[6 ] Reinhart B J, Slack F A, Basson M, et al. The 21 nucleotide let-7 RNA regulates C. elegans developmental timing in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[7] Li G, Li Y, Li X, et al. MicroRNA identity and abundancein developing swine adipose tissue as determinedby Solexa sequencing[J]. J Cell Biochem, 2011, 112(5): 1318-1328.

[8] Crippa S, Cassano M, Sampaolesi M. Role of miRNAsin muscle stem cell biology: Proliferation, differentiationand death[J]. Curr Pharm Design, 2012, 18(13): 1718-1729.

[9] Hou W, Tian Q, Steuerwald N M, et al. The let-7 microRNAenhances hemeoxygenase- 1 by suppressingBach1 and attenuates oxidant injury in human hepatocytes[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1819(11-12):1113-1122.

[10] Johnson C D, Esquela-Kerscher A, Stefani G, et al. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007, 67(16): 7713-7722.

[11] Reddy A M, Zheng Y, Jagadeeswaran G, et al. Cloning, characterization and expression analysis of porcine microRNAs[J]. BMC Genomics, 2009, 10(1): 1.

[12] Thum T, Galuppo P, Wolf C, et al. MicroRNAs in the human heart: a clue to fetal gene reprogramming in heart failure [J]. Circulation, 2007, 116(3): 258-267.

[13] Harfe B D, Mcmanus M T, Mansfield J H, et al. The RNaseIII enzyme Dicer is required for morphogenesis but not patterning of the vertebrate limb[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(31): 10898-10903.

[14] 趙俊生, 李艷華, 周輝云, 等. 豬miR-let-7i的組織表達譜分析[J]. 中國畜牧雜志, 2015, 51(13): 6-10.

[15] 王云霞, 王琪, 周輝云, 等. miR-let-7a在大白豬甲狀腺中的表達及其對甲狀腺細胞凋亡的影響[J]. 農業(yè)生物技術學報, 2015, (2): 220-226.

[16] Johnson C D, Esquela-Kerscher A, Stefani G, et al. The let-7 microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J]. Cancer Res, 2007. 67(16): 7713-7722.

[17] Ivey KN, Muth A, Arnold J, et al. MicroRNA regulationof cell lineages in mouse and human embryonicstem cells[J]. Cell Stem Cell, 2008, 2(3): 219-229.

[18] Madison B B, Liu Q, Zhong X, et al. LIN28B promotes growth and tumorigenesis of the intestinal epithelium via Let -7[J]. Genes Dev, 2013, 27(20): 2233-2245.

[19] 苗志國, 劉長忠, 李國旺, 等. 金華豬與長白豬生產性能和肉品質的發(fā)育差異[J]. 湖北農業(yè)科學, 2010, 49(8): 1912-1914.

[20] 苗志國. 金華豬與長白豬脂肪代謝和消化功能發(fā)育差異的研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2009.

[21] 苗志國, 劉長忠, 張金洲, 等. 金華豬與長白豬小腸黏膜形態(tài)結構發(fā)育差異的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2010, (23): 73-75.

Analysis of miR-let-7 Tissue Expression Pattern in Jinhua and Landrace Pigs

GAO Hui-zhen, CHEN Li-xing, DONG Ding-juan, GAO Tian-tian, HUANG Min-jie, XU Ning-ying*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Zhejiang Hangzhou 310058, China)

miR-let-7 gene family is a tissue-specific expressed and widely involved in the regulation and the development of animal tissues and organs. In our study, three of each Jinhua and Landrace pigs at 70 days old were selected to detected the expression of let-7 gene family (let-7a, let-7c, let-7d-3p, let- 7e, let-7f, let-7g) in six tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine). The differential expression of let-7 genes were analyzed in various tissues and especially in the small intestine for the Jinhua and Landrace pigs. The results showed that the expression level of let-7 genes were abundantly expressed in liver of landrace (P ＜0.05) while the expression of let-7 genes in the heart and small intestine of Jinhua pig were greater than other tissues(P ＜0.05). In the small intestine of Jinhua pig, the expression levels of let-7a and let-7c genes were significantly higher than other members of the let-7 gene family; the expression level of let-7a gene was observably higher than other members in Landrace. The expression levels of let-7a and let-7d-3p gene in small intestine of Jinhua was significantly higher than those of Landrace (P＜0.01). The expression of let-7c gene was higher than that of Landrace (P ＜0.05). But the expression of let-7e gene was lower than that of Landrace (P ＜0.05). The expression of miR-let-7 gene family was studied in this paper, it provides useful clues for further study of molecular mechanism of miR-let-7 on the growth and fat formation for Jinhua and Landrace.

miR-let-7; Gene expression ; Tissue expression ; Small intestinal ; Pig

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-044

2016-10-26；

2016-11-18

國家自然科學基金（31272424）

高慧珍（1991-），女，河南人，碩士研究生，主要從事microRNA方面研究，E-mail：21517004@zju.edu.cn

* 通訊作者：徐寧迎，E-mail：nyxu@zju.edu.cn