蔣珊珊 沈燕 李凱強(qiáng) 趙宇

●論 著

AQP1和AQP3在宮頸癌新輔助化療前后的表達(dá)變化及意義

蔣珊珊 沈燕 李凱強(qiáng) 趙宇

目的 觀察新輔助化療前后宮頸癌組織中水通道蛋白1（AQP1）與水通道蛋白3（AQP3）表達(dá)的變化，探討兩者在宮頸癌新輔助化療中的意義。方法 選擇宮頸鱗癌患者30例，術(shù)前接受以順鉑為基礎(chǔ)的有效新輔助化療?；熐昂褪中g(shù)中分別取癌組織標(biāo)本，應(yīng)用RT-PCR法、Western blot法和免疫組化法對水通道蛋白（AQPs）的mRNA、蛋白和組織分布進(jìn)行檢測。 結(jié)果化療后AQP1和AQP3的mRNA表達(dá)量約為化療前的3倍和2.7倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中大量表達(dá)，在細(xì)胞膜和胞質(zhì)中均有分布，化療后表達(dá)量提高，以胞質(zhì)更為明顯。30例患者經(jīng)過化療后，其中19例完全緩解，11例部分緩解。完全緩解組患者化療后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表達(dá)的增值雖然均大于部分緩解組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 結(jié)論 AQP1和AQP3在新輔助化療后宮頸癌組織中的表達(dá)增加，增幅可能與化療效果相關(guān)。

新輔助化療 宮頸癌 水通道蛋白1 水通道蛋白3

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，每年全球約有53萬新發(fā)宮頸癌患者，約27.5萬人死于宮頸癌[1]。手術(shù)和放療是宮頸癌的主要治療方法，然而，盡管手術(shù)技巧、放療設(shè)備和技術(shù)的不斷改進(jìn)，但宮頸癌的治療效果并無根本性的提高，總的5年生存率仍徘徊在40%左右[2]。新輔助化療的出現(xiàn)，為局部晚期宮頸癌患者爭取了手術(shù)機(jī)會，并提高了放療的敏感性。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一組跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水和小分子物質(zhì)的特異通道蛋白質(zhì)家族，在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)13種AQP亞型（AQP0～AQP12）[3]。近來的研究表明AQPs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。AQPs在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，已證實(shí)AQP1和AQP3在宮頸癌中表達(dá)顯著[4]。卵巢癌、結(jié)直腸癌模型的研究均提示AQPs與抗腫瘤藥物的效果具有相關(guān)性[5-6]。然而，關(guān)于AQPs與宮頸癌化療藥物療效的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究擬探討宮頸癌組織中AQP1與AQP3在新輔助化療前后的表達(dá)變化，以及與化療效果的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年1月至2016年1月在浙江省人民醫(yī)院婦科手術(shù)治療的宮頸鱗癌患者30例，年齡37～69歲。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床分期為Ⅰb2或Ⅱa2期；（2）手術(shù)病理確診為鱗狀細(xì)胞癌；（3）宮頸呈外生型生長，局部病灶≥4cm；（4）心肺功能良好，無化療及手術(shù)禁忌癥。所有患者均在術(shù)前接受2～3個(gè)周期的以順鉑為基礎(chǔ)的化療。經(jīng)患者同意，化療前和手術(shù)中分別取癌組織標(biāo)本存入液氮罐中備用。

1.2 化療效果評估 所有患者完成2～3個(gè)周期的化療后2周，對于可測量實(shí)體瘤按照1979年WHO抗瘤藥物客觀療效標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)療效：（1）完全緩解：全部可測量病灶完全消失持續(xù)4周；（2）部分緩解：病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少50%以上，持續(xù)至少4周：（3）穩(wěn)定：各病灶最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和減少＜50%，或增大＜25%，持續(xù)至少4周且無新病灶出現(xiàn)；（4）進(jìn)展：病灶的最大直徑與最大垂直橫徑乘積總和增大＞25%，或出現(xiàn)新的病灶。（1）、（2）為有效，（3）、（4）為無效。

1.3 RT-PCR法檢測AQP1、AQP3 mRNA的表達(dá)水平采用Trizol試劑盒法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用TaqMan探針法，設(shè)計(jì)引物探針AQP1、AQP3、βactin，以β-actin為參照，熒光標(biāo)記為FAM染料，在美國ABI公司的7500 PCR儀上進(jìn)行操作。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃10min預(yù)變性；然后95℃15s，60℃1min，并檢測熒光信號，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值。反應(yīng)結(jié)束后得出熒光反應(yīng)曲線及CT值。

1.4 Western blot法檢測AQP1、AQP3蛋白的表達(dá)水平提取總蛋白，利用一抗結(jié)合AQP1、AQP3，Western blot法檢測化療前后各指標(biāo)的表達(dá)情況。Western blot過程：轉(zhuǎn)印膜脫脂奶粉封閉后，一抗孵育24h，TBST洗膜，以HRP標(biāo)記的二抗孵育。再洗膜后加入ECL底物顯影、曝光，掃描膠片。

1.5 免疫組化法檢測組織中AQP1、AQP3蛋白的分布組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片，使用免疫組化SP法檢測。玻片脫蠟，微波修復(fù)，山羊血清室溫孵育30min，一抗（AQP1、AQP3）孵育過夜，二抗室溫孵育30min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，淡氨水返藍(lán)，樹脂封片，光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以 表示，化療前后AQP1和APQ3的表達(dá)水平比較采用配對秩和檢驗(yàn)，不同化療效果患者化療前后AQP1和APQ3的表達(dá)水平變化比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 化療后基本情況 30例患者經(jīng)過化療后，其中19例完全緩解，11例部分緩解，化療效果均為有效。

2.2 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3 mRNA的表達(dá)變化 RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，化療后AQP1 mRNA的表達(dá)量約為化療前的3倍（3.19∶0.99），而化療后AQP3 mRNA的表達(dá)量約為化療前的2.7倍（2.70: 0.99），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 化療前后宮頸癌組織中AQP1與AQP3mRNA表達(dá)量的變化

2.3 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達(dá)變化 Western blot法檢測結(jié)果顯示化療后宮頸癌組織中AQP1及AQP3蛋白的表達(dá)量較化療前均有明顯增加（均P＜0.05），見表1、圖2-3。

表1 化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達(dá)變化

圖2 Western blot法檢測化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白表達(dá)的電泳圖

2.4 化療前后AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中的分布 AQP1和AQP3蛋白在宮頸癌組織中大量表達(dá)，在細(xì)胞膜和胞質(zhì)中均有分布?；熀髮m頸癌組織中AQP1和AQP3蛋白的表達(dá)量增加，以胞質(zhì)更為明顯，見圖4。

圖3 化療前后宮頸癌組織中AQP1與AQP3蛋白表達(dá)量的變化

圖4 化療前后AQP1與AQP3蛋白的免疫組化結(jié)果（×200）

2.5 不同化療效果組化療前后AQP1和AQP3的表達(dá)變化 按照化療效果分組，完全緩解組患者新輔助化療后AQP1和AQP3的mRNA和蛋白表達(dá)的增值雖然均大于部分緩解組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同化療效果組化療前后AQP1和AQP3的表達(dá)變化

3 討論

宮頸癌是威脅女性健康的最主要的婦科惡性腫瘤之一。新輔助化療給晚期宮頸癌患者帶來了希望，但是化療效果的個(gè)體差異又使新輔助化療的推廣疑慮重重。近年來的研究篩選出了一些分子標(biāo)記物[7-8]，這些分子標(biāo)記物與宮頸癌化療效果具有相關(guān)性。

AQPs廣泛表達(dá)于機(jī)體的各部位，不僅在維持細(xì)胞內(nèi)外的水平衡方面起到了重要的作用，而且在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的病理過程中也扮演了重要的角色。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，AQP1在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸鱗癌組織間質(zhì)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞上陽性表達(dá)，AQP1在CIN中的表達(dá)高于宮頸鱗癌和正常宮頸組織，在宮頸鱗癌中臨床Ⅰ期的表達(dá)高于臨床Ⅱ期；AQP3在正常宮頸組織、CIN、宮頸鱗癌的表達(dá)逐漸增高[4]。而AQP1在腫瘤血管內(nèi)皮中的高表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的生長浸潤，其介導(dǎo)的高滲透性引起流體靜力壓的增高，導(dǎo)致缺氧而促進(jìn)血管生成[9]。本研究探究了有效的新輔助化療前后宮頸癌組織中AQP1和AQP3的變化，發(fā)現(xiàn)化療后AQP1和AQP3的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且兩種蛋白在細(xì)胞膜和胞質(zhì)的分布發(fā)生變化，提示AQP1和AQP3可能在新輔助化療治療宮頸癌的機(jī)制中起到促進(jìn)作用，其相關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

其他惡性腫瘤的相關(guān)研究表明AQPs與化療效果有關(guān)。在卵巢癌體外實(shí)驗(yàn)研究中，AQPs阻滯劑和高滲狀態(tài)可以增加卵巢癌細(xì)胞株SKOV3對順鉑的敏感性[5]。Shi等[6]利用結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為模型，AQP5的表達(dá)與化療療效正相關(guān)，并且推測是AQP5-P38 MAPK信號通路起作用。有關(guān)AQP1和AQP3與宮頸癌化療療效相關(guān)的研究尚罕見于報(bào)道。王曉云等[10]用免疫組化法檢測了36例宮頸鱗癌化療有效患者和54例無效患者，AQP1在敏感組宮頸癌中表達(dá)率為87.1%，高于無效組的表達(dá)率78.5%，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，新輔助化療后AQP1和AQP3 mRNA及蛋白水平的表達(dá)均明顯增高。而完全緩解組患者新輔助化療后AQP1、AQP3的mRNA和蛋白表達(dá)的增值大于部分緩解組，提示表達(dá)量的增幅可能與化療效果具有相關(guān)性。但本研究上述結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究樣本量較少，且缺少化療無效病例有關(guān)。今后需擴(kuò)大樣本量，增加與化療無效組的比較，來進(jìn)一步探討水通道蛋白在不同化療效果類型上的表達(dá)差異。

[1] Wen F,Xu J Z,Wang X R.Increased expression of miR-15b is associated with clinicopathological features and poor prognosis in cervical carcinoma[J].Arch Gynecol Obstet,2017,295(3): 743-749.doi:10.1007/s00404-016-4286-4.

[2] de Azevedo C R,Thuler L C,de Mello M J,et al.Neoadjuvant chemotherapy followed by chemoradiation in cervical carcinoma: a review[J].Int J Gynecol Cancer,2016,26(4):729-736.doi:10. 1097/IGC.0000000000000663.

[3]Verkman AS,Hara-Chikuma M,Papadopoulos MC,et al.Aquaporins-new players in cancer biology[J].J Mol Med,2008,86(5): 523-529.doi:10.1007/s00109-008-0303-9.

[4] 林溫靜,鄒雙微,朱雪瓊,等.AQPs在宮頸鱗癌癌變過程中的表達(dá)和意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2012,41(5):105-109.

[5] Chen X J,Chen W M,Ding X Y,et al.Effects of aquaporins on chemosensitivity to cisplatin in ovarian cancer cells[J].Archives of gynecology and obstetrics,2014,290(3):525-532.doi:10.1007/ s00404-014-3216-6.

[6]ShiXM,Wu S C,Yang YB,et al.AQP5 silencing suppresses p38 MAPK signaling and improves drug resistance in colon cancer cells[J].Tumor Biol,2014,35(7):7035-7045.doi:10.1007/s13277-014-1956-3.

[7] Liu Y,Li H,Zhang R,et al.Overexpression of the BRIP1 ameliorates chemosensitivity to cisplatin by inhibiting Rac1 GTPase activity in cervical carcinoma HeLa cells[J].Gene,2016,578(1): 85-91.doi:10.1016/j.gene.2015.12.007.

[8] 盧明東,李丕宏,孫維建,等.胃癌組織中水通道蛋白1、微血管密度與細(xì)胞脹亡的關(guān)系及臨床意義[J].浙江醫(yī)學(xué),2014,36(4):274-277.

[9] Zou L B,Shi S,Zhang R J,et al.Aquaporin-1 plays a crucial role in estrogen-induced tubulogenesis of vascular endothelial cells [J].J Clin EndocrinolMetab,2013,98(4):672-682.doi:10.1210/jc. 2012-4081.

[10] 王曉云,張凡,陳江平,等.HIF-1α、AQP-1表達(dá)與新輔助化療宮頸鱗狀細(xì)胞癌耐藥及預(yù)后關(guān)系的研究[J].中國婦幼保健,2010,25 (28):4142-4144.

Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy

JIANG Shanshan,SHEN Yan，LI Kaiqiang,et al.Department of Gynecology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Neoadjuvant chemotherapy Cervical cancerAQP1 AQP3

2017-02-16）

（本文編輯:陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.10.2017-295

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2015KYB015）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ17H160017）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院婦科（蔣珊珊、沈燕），輸血科（李凱強(qiáng)）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科（趙宇）

趙宇，E-mail：894867055@qq.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-3(AQP3)in cervical cancer patients with neoadjuvant chemotherapy. Methods Thirty patients with cervical cancer were enrolled in the study.Effective neoadjuvant chemotherapy with cis-platinum was given in all cases before surgery.Tumor specimens were obtained before chemotherapy and during surgery.The expression of AQP1 and AQP3 mRNA and protein was determined by RT-PCR,Western blot and immunohistochemistry,respectively.Results The mRNA expression of AQP1 and AQP3 increased 3 and 2.7 times after chemotherapy,respectively.The AQP1 and AQP3 proteins were expressed abundantly in both cytomembrane and cytoplasm of cancer tissue;and the protein expression increased significantly after chemotherapy,especially in cytoplasm.Among the thirty patients,19 cases achieved complete remission(CR)and 11 cases partial remission(PR)after chemotherapy.There was no significant difference in AQP1 and AQP3 expression between CR cases and PR cases,although there was a trend of increasing expression in CR patients. Conclusion Expression of AQP1 and AQP3 in cervical cancer is increased after neoadjuvant chemotherapy.