牛東，武都都，高凱麗，王昭維，張存，張英起，張偉，李維娜

1．腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

2.第四軍醫(yī)大學(xué) a.藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；b.學(xué)員一旅二營(yíng)八連；陜西 西安 710032

胸腺素α1二聚體蛋白的初步毒理學(xué)研究

牛東1,2a,2b，武都都1,2a,2b，高凱麗1,2a，王昭維1,2a，張存1,2a，張英起1,2a，張偉1,2a，李維娜1,2a

1．腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

2.第四軍醫(yī)大學(xué) a.藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室；b.學(xué)員一旅二營(yíng)八連；陜西 西安 710032

目的：對(duì)胸腺素α1二聚體蛋白開展初步的毒理學(xué)研究，為后續(xù)系統(tǒng)地進(jìn)行臨床前研究提供依據(jù)。方法：將BALB/c小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和胸腺素α1二聚體蛋白高、中、低劑量組，觀察胸腺素α1二聚體蛋白給藥后小鼠的一般行為，進(jìn)行血液生化學(xué)指征及組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：動(dòng)物未見明顯的中毒癥狀和死亡，與對(duì)照組相比，高、中、低各劑量胸腺素α1二聚體蛋白注射組的動(dòng)物行為、活動(dòng)、體重、進(jìn)食量等與對(duì)照組無顯著差異，血液生化指標(biāo)與主要臟器組織形態(tài)學(xué)檢查也均未見異常。結(jié)論：未發(fā)現(xiàn)胸腺素α1二聚體對(duì)小鼠有明顯的毒性作用。

胸腺素α1；二聚體；毒理學(xué)；小鼠

胸腺素α1（thymosinα1，Tα1）是一種胸腺來源的酸性多肽，由28個(gè)氨基酸殘基組成，是重要的生物調(diào)節(jié)劑，可以顯著提高生物體的免疫應(yīng)答能力[1]，臨床上已廣泛用于治療各種原發(fā)性或繼發(fā)性T細(xì)胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、乙型肝炎、丙型肝炎以及輔助治療腫瘤[2-6]。其臨床療效確切，毒副作用輕微，具有廣闊的應(yīng)用前景。

為克服市場(chǎng)上同類藥品存在的純度低、價(jià)格昂貴等問題，我們實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建和表達(dá)了Tα1二聚體（Tα1②）蛋白，實(shí)現(xiàn)了Tα1以二聚體的形式在大腸桿菌中高效表達(dá)，并用簡(jiǎn)便廉價(jià)的純化工藝獲得了高產(chǎn)量、高活性的純化產(chǎn)物。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tα1②可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增值，具有比化學(xué)合成單體更高的生物學(xué)活性[7]。

為了進(jìn)行系統(tǒng)的臨床前研究，我們對(duì)Tα1②進(jìn)行了初步毒理學(xué)檢測(cè)。通過觀察不同劑量Tα1②給藥對(duì)小鼠的進(jìn)食、體重等一般狀況的影響，檢測(cè)血清生化學(xué)指標(biāo)、重要臟器相對(duì)重量、組織病理學(xué)情況，考察Tα1②的安全性，為進(jìn)一步系統(tǒng)性進(jìn)行Tα1②的臨床前研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，16～18 g）購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；日達(dá)仙（SciClone公司）；IPTG（Solon公司）；4℃高速離心機(jī)、全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼公司）；HE染色試劑盒（博士德公司）。

1.2 小鼠的飼養(yǎng)與給藥

BALB/c小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度24～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，自然通風(fēng)，光照/黑暗各12 h，自由攝食、飲水。40只小鼠按體重隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組及低濃度（80μg/只）、中濃度（160μg/只）、高濃度（320μg/只）Tα1②實(shí)驗(yàn)組，每組10只。分別于腹腔內(nèi)注射生理鹽水或Tα1②，每周2次，連續(xù)給藥6周，給藥后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 小鼠的一般情況

給藥后每日觀察小鼠一般狀況，包括體貌、毛色、活動(dòng)、攝食、飲水、對(duì)刺激的反應(yīng)等。觀察各組是否出現(xiàn)豎尾、躁動(dòng)、驚厥等興奮現(xiàn)象，或嗜睡、蜷縮、弓背等抑制現(xiàn)象。觀察各組糞、尿情況，是否有腹瀉、便血、黑便、尿血等現(xiàn)象，如有異常則進(jìn)行記錄。每周稱取小鼠空腹體重并測(cè)定飼料消耗量1次，共計(jì)6周。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠最后一次給藥次日摘眼球取血，取血前禁食過夜。血液靜置30 min使其充分凝固，3000～4000 r/min離心分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清生化學(xué)檢測(cè)。

1.5 重要臟器形態(tài)學(xué)與組織學(xué)觀察

迅速脫頸處死小鼠，進(jìn)行系統(tǒng)解剖，觀察各主要臟器形態(tài)大小差異，同時(shí)稱重，與小鼠體重比較，求得各臟器系數(shù)（g/100 g）。摘取心、肝、肺、腎及腦新鮮組織，用多聚甲醛固定；固定后的組織經(jīng)修塊取材，常規(guī)石蠟包埋，滑動(dòng)切片機(jī)5 μm切片；切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下對(duì)各組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件，組間t檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)量結(jié)果以x±s表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況檢測(cè)

高、中、低劑量Tα1②組及生理鹽水對(duì)照組注射給藥期間，各組動(dòng)物一般狀況良好，沒有出現(xiàn)死亡；各組一般生理活動(dòng)及二便未見異常；小鼠皮毛光澤，皮膚黏膜無異常，眼、耳、鼻、口及肛門等無異常分泌物；未見呼吸困難或呼吸頻率、幅度等發(fā)生異常變化；攝食、飲水正常，未見嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)。

小鼠按體重隨機(jī)分組，入組時(shí)各組體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。于給藥第1、2、3、4、5、6周各稱量體重一次，觀察各組小鼠體重是否有變化，結(jié)果如表1及圖1，各組小鼠體重呈緩慢上升趨勢(shì)，給藥組體重變化與對(duì)照組比較無顯著性差異。

小鼠入組時(shí)各組攝食量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。于給藥第1、2、3、4、5、6周各計(jì)算攝食量一次，給藥組與對(duì)照組比較無顯著差異（表2、圖2）。

表1 胸腺素α1二聚體對(duì)小鼠體重的影響（g，x±s，n=10）

2.2 血清生化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

給藥6周后進(jìn)行血清生化學(xué)分析，結(jié)果見表3。高劑量給藥組總膽紅素（TBIL）和血糖（GLU）水平與對(duì)照組比較略升高（P＜0.05），低劑量給藥組的白蛋白（ALB）水平低于對(duì)照組（P＜0.01），但上述變化均在BALB/c小鼠的正常值范圍內(nèi)；其他各項(xiàng)血清生化指標(biāo)與對(duì)照組比較無顯著差異。

2.3 臟器組織病理學(xué)結(jié)果

解剖小鼠，肉眼觀察各主要臟器均顏色鮮活，位置、大小無異常。稱重并計(jì)算各臟器數(shù)（表4），給藥組與對(duì)照組相比較無顯著差異。各組織用多聚甲醛固定后，包埋蠟塊切片進(jìn)行HE染色（圖3），各劑量組小鼠心、肝、肺、腎沒有發(fā)現(xiàn)明顯病變，與生理鹽水對(duì)照組相比無差異。

3 討論

作為一種重要的生物學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)物，Tα1對(duì)調(diào)節(jié)免疫功能、維持人體內(nèi)動(dòng)態(tài)免疫平衡具有重要作用。Tα1可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖及對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性[8]，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)同種或自身淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力[9]，并且通過延遲自由基的產(chǎn)生和減少谷胱甘肽的消耗，拮抗淋巴細(xì)胞成熟過程中的凋亡[10]。Tα1能夠活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其胞飲、胞吞及抗原提呈能力[11]。Tα1對(duì)樹突狀細(xì)胞（DCs）也具有促進(jìn)成熟、分化的作用，能促使DCs分泌巨噬細(xì)胞激活因子從而增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答功能[12]。Ta1還有雙向性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，具有保護(hù)免疫功能和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的作用，從而減輕細(xì)胞因子所致炎性損害，改善感染導(dǎo)致的高代謝狀態(tài)[13]。

表2 胸腺素α1二聚體對(duì)小鼠攝食量的影響（g，x±s，n=10）

圖1 小鼠給藥期間的體重變化

圖2 小鼠給藥期間的攝食量變化

圖3 各組小鼠重要臟器的HE染色圖

表3 胸腺素α1二聚體對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響（x±s，n=10）

Tα1已廣泛應(yīng)用于各種原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫病、病毒及微生物感染、腫瘤等的治療中。單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合其他藥物，臨床療效確切，不良反應(yīng)極其輕微，且大劑量使用時(shí)無發(fā)熱及過敏反應(yīng)，有廣闊的應(yīng)用前景。但是，目前市售的Tα1多為化學(xué)合成或生物提取。前者制備成本高、售價(jià)昂貴，且生產(chǎn)工藝對(duì)環(huán)境有很大污染；后者從小牛等動(dòng)物胸腺組織中提取獲得，產(chǎn)量和純度低，易引起患者的過敏反應(yīng)。而Tα1序列過短，因此難于用基因工程方法直接獲得。為解決這一難題，我們構(gòu)建表達(dá)了有生物學(xué)活性的Tα1②，獲得了高產(chǎn)量、低成本、高活性的純化產(chǎn)物，具有比化學(xué)合成單體更高的生物學(xué)活性[7]。

我們以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)Tα1②進(jìn)行了初步毒理學(xué)研究，以評(píng)價(jià)其安全性。Tα1②給藥后未引起動(dòng)物死亡及出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育和血液生化指標(biāo)等均沒有不良影響。Tα1②給藥后動(dòng)物的行為、活動(dòng)、體重、進(jìn)食量等與對(duì)照組無顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道Tα1主要通過腎臟排泄[14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，腎功能檢測(cè)指標(biāo)與腎臟外觀大小、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)等指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)異常，其他主要臟器組織形態(tài)學(xué)檢查也均未見異常。綜上所述，未發(fā)現(xiàn)Tα 1②對(duì)小鼠有明顯的毒性作用，為進(jìn)一步系統(tǒng)性進(jìn)行Tα1②的臨床前研究提供了參考依據(jù)。

表4 胸腺素α1二聚體對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（g/100g，x±s）

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Toxicity Study of Thymosinα1 Concatemer in BALB/c M ice

NIU Dong1,2,WU Du-Du1,2,GAO Kai-Li1,2,WANG Zhao-Wei1,2, ZHANG Cun1,2,ZHANG Ying-Qi1,2,ZHANG Wei1,2,LIWei-Na1,2*

1.State Key Laboratory of Cancer Biology;2.Department of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Fourth Military Medical University;Xi'an 710032,China

*Corresponding author,E-mail:liweina@fmmu.edu.cn

Objective:A primary safety study of recombinant human thymosinα1 concatemer protein was conducted to support the following design of preclinical trial.Methods:The BALB/c mice were injected intraperitoneally with saline or thymosinα1 concatemer protein.The parameters of standard toxicology were evaluated systematically.Results:Visible changes were not found on general signs,body weight,food consumption,clinical chemistry and necropsy analysis of main organ between thymosinα1 concatemer administrated group and normal saline control group.Conclusion:In conclusion,primary toxicology study showed that recombinant human thymosinα1 concatemer was well tolerated and had no significant adverse effect on mice.

thymosinα1;concatemer;toxicology;mice

R99

A

1009-0002（2017）03-0338-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.019

2017-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301785，81472649，81672800）

牛東（1995-），男，本科生，（E-mail）88488031@qq.com

李維娜，（E-mail）liweina@fmmu.edu.cn