張路遙，王麗麗，楊金剛，邢思寧，趙松，于穎，謝曉冬，馬東初

1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 113021；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 全軍腫瘤診治中心醫(yī)學實驗科，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 全軍腫瘤診治中心腫瘤科，遼寧 沈陽 110016

S6K1 C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域磷酸化與Akt去磷酸化協(xié)同調(diào)節(jié)SP600125誘導巨核細胞系多倍體化

張路遙1，3，王麗麗2，楊金剛2，邢思寧2，趙松2，于穎2，謝曉冬3，馬東初2

1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 113021；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 全軍腫瘤診治中心醫(yī)學實驗科，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 全軍腫瘤診治中心腫瘤科，遼寧 沈陽 110016

目的：探討JNK抑制劑SP600125誘導巨核細胞白血病系多倍體化的調(diào)控機制。方法：用SP600125和3種抑制劑（PD184352、U0126和LY294002）處理Dami和CMK細胞，用點突變技術(shù)對核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域和疏水基序突變構(gòu)建的S6K1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，流式細胞術(shù)分析細胞的DNA倍性，Western印跡檢測S6K1、MAPK和Akt蛋白的表達及磷酸化修飾位點的變化。結(jié)果：當單獨使用3種抑制劑時，對Dami和CMK細胞的倍性無影響。當SP600125與3種抑制劑聯(lián)合時，盡管PD184352下調(diào)了p44/42 MAPK在Thr202/Tyr204位點的磷酸化，但其并不抑制SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化；相反，U0126抑制SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化，但并不下調(diào)p44/42 MAPK的磷酸化；而LY294002增加Akt的磷酸化，并阻斷SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化。這3種抑制劑均在SP600125誘導的多倍體Dami和CMK細胞中部分抑制S6K1的Thr421/Ser424磷酸化，但并不增加S6K1的Thr389磷酸化。轉(zhuǎn)染S6K1突變質(zhì)粒的Dami細胞，并沒有對SP600125誘導的多倍體化產(chǎn)生影響，同時，無論是模擬磷酸化或去磷酸化的Thr389突變均對SP600125誘導的多倍體化無影響，且未顯現(xiàn)出與LY294002的協(xié)同作用。C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域突變質(zhì)粒（S6K1-D3E）可以進一步阻斷SP600125誘導的已經(jīng)被LY294002部分阻斷的Dami細胞多倍體化。結(jié)論：S6K1的C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域磷酸化與Akt去磷酸化協(xié)同調(diào)節(jié)SP600125誘導巨核細胞白血病系的多倍體化。

核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）；Akt；巨核細胞；多倍體化

巨核細胞是產(chǎn)生血小板的前體細胞，多倍體化在巨核細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）參與Nocodazole（微管抑制劑）和SP600125（JNK抑制劑）誘導的巨核細胞白血病細胞系Dami和CMK多倍體化，伴隨著S6K1在Thr421/Ser424位點的磷酸化及Thr389位點的去磷酸化[4-5]，并且H-89阻斷SP600125誘導的Dami和CMK細胞多倍體化伴隨著S6K1在Thr389位點磷酸化的增加，以及在Thr421/Ser424位點磷酸化的減少[5]。然而，S6K1在藥物誘導巨核細胞白血病細胞系多倍體化過程中的作用機制尚不十分清楚。另有報道脯氨酸介導有絲分裂原調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）磷酸化Thr421/Ser424，其位于S6K1的C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域[6]。此外，Akt，又稱蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1）激活S6K1[7]。

本此，我們用PD184352（高效選擇性MEK1/2抑制劑）、U0126（MEK抑制劑）和LY294002（PI3K抑制劑）處理Dami和CMK細胞，用點突變技術(shù)構(gòu)建S6K1 C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域和疏水基序內(nèi)不同位點的突變質(zhì)粒，探討了S6K1與MAPK和Akt通路在SP600125誘導細胞多倍體化方面所起的作用。我們的研究表明，S6K1的C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域磷酸化與Akt去磷酸化協(xié)同調(diào)節(jié)SP600125誘導巨核細胞白血病系的多倍體化。

1 材料與方法

1.1 材料

人巨核細胞白血病細胞系Dami購自美國國立細胞庫（ATCC，其編號為CRL-9792），CMK細胞從德國微生物和細胞培養(yǎng)保存中心獲得。二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）購自Sigma公司；SP600125購自美國LC實驗室；PD184352、U0126、LY294002購自 Selleckchem公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Life Technologies公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人S6K1抗體、兔抗人磷酸化S6K1（Thr389）抗體、兔抗人磷酸化S6K1（Thr421/Ser424）抗體、兔抗人p44/42 MAPK抗體、兔抗人磷酸化p44/42 MAPK（Thr202/Tyr204）抗體、兔抗人Akt抗體，兔抗人磷酸化Akt（Ser473）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗鼠IgG均購自 Cell Signaling Technology公司；β-actin購自Santa Cruz Biotechnology公司；Amersham ECL Prime Western印跡試劑盒購自GE Healthcare公司；即用PCR擴增試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶DpnⅠ和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；Amaxa核轉(zhuǎn)染儀和轉(zhuǎn)染試劑盒購自Amaxa公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

CMK和Dami細胞均以2×105/mL的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中，在含10%新生牛血清的培養(yǎng)液中生長，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2的潮濕孵箱中培養(yǎng)。在3種抑制劑誘導倍體化實驗中，分別將PD184352（2μmol/L）、U0126（10μmol/L）或LY294002（30μmol/L）加入培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h。在SP600125聯(lián)合3種抑制劑誘導多倍體化實驗中，在加入SP600125（32μmol/L）前1 h，分別將PD184352（2μmol/L）、U0126（10μmol/L）或LY294002（30μmol/L）加入培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h。以終濃度為1%的DMSO作為溶媒對照組。孵育后，收集細胞，并用PBS洗滌3次。

1.3 細胞倍性分析

分別收集實驗組和對照組細胞5×105個，用80%冰甲醇于-20℃固定過夜，PBS洗滌3次，加入50 mg/mL PI染液，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測分析DNA倍性。

1.4 Western印跡

收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰浴中超聲波破碎細胞，100℃煮沸5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，回收上清即為提取的蛋白樣品，采用二辛可寧酸（BCA）法測定蛋白濃度。取蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE，并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，將膜在含5%脫脂牛奶的TBS-T中室溫孵育2 h。兔抗人S6K1抗體（1∶5000）、兔抗人p-S6K1（Thr389）抗體（1∶300）、兔抗人p-S6K1（Thr421/Ser424）抗體（1∶500）、兔抗人p44/ 42 MAPK抗體（1∶5000）、兔抗人磷酸化p44/42 MAPK（Thr202/Tyr204）抗體（1∶500）、兔抗人Akt抗體（1∶2000）、兔抗人磷酸化 Akt（Ser473）抗體（1∶300）、小鼠抗人β-actin抗體（1∶80 000）孵育，4℃搖床振蕩過夜；TBS-T洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶40 000）或HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶40 000），室溫孵育2 h；TBS-T洗滌3次，暗室內(nèi)用ECL化學發(fā)光檢測，X線膠片曝光。

1.5 定點突變

設計含S6K1相應位點堿基突變的一對互補引物，采用PAGE純化方式由Invitrion公司合成，按照要求加入一定量的無菌水溶解引物，配置成100μmol/L的母液，使用時稀釋至1/10。采用即用PCR擴增試劑盒，反應體系包括模板質(zhì)粒1 μL（50 ng）、2條引物各1μL、水9.5μL、2×HiFi緩沖液12.5μL。PCR條件為94℃預變性1 min，94℃變性40 s、60℃退火1 min、68℃延伸7 min，進行18個循環(huán)。PCR后加入1μLDpnⅠ酶，37℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物10μL直接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在氨芐西林平皿中篩選，挑取單克隆進行質(zhì)粒抽提和測序，以確認突變位點堿基取代是否正確，并且沒有其他突變被導入。T389E突變用引物1進行；T389A突變用引物2進行；D3E突變用2對引物，先用引物3進行S418D+T421E+S424D突變，確定突變成功后，以突變質(zhì)粒為模板，用引物4進行S411D突變；T389E/D3E突變用引物1，以S6K1-D3E為模板進行；T389A/D3E突變用引物2，以S6K1-D3E為模板進行。所有突變體見表1。

1.6 核轉(zhuǎn)染

Dami細胞用編碼S6K1-WT或S6K1-T389E、S6K1-T389A、S6K1-D3E、S6K1-T389E/D3E和S6K1-T389A/D3E突變體的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，參見前文[4]。簡言之，用預冷的PBS緩沖液洗滌Dami細胞，然后將細胞重懸于指定的電穿孔緩沖液中，細胞懸液的終濃度為1.2×108/mL。每種突變質(zhì)粒2μg用0.1 mL細胞懸液混勻，將混合物轉(zhuǎn)移至一個2.0 mm電穿孔池中，用Amaxa核轉(zhuǎn)染儀進行核轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，孵育過夜。孵育后，轉(zhuǎn)染的Dami細胞用SP600125（32μmol/L）在有或無LY294002（30μmol/L）預處理1 h后，于37℃、5%CO2的潮濕孵箱中誘導72 h。孵育72 h后收集細胞，檢測細胞倍性。以未轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒，但用SP600125誘導的Dami細胞作為對照組。

表1 通過點突變產(chǎn)生的S6K1突變質(zhì)粒

1.7 統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復3次。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD184352、U0126和LY294002對巨核細胞系多倍體化的影響

用PD184352（高效選擇性MEK1/2抑制劑）、U0126（MEK抑制劑）和LY294002（PI3K抑制劑）來研究這些通路是否參與SP600125誘導Dami和CMK細胞多倍體?；?PD184352、U0126和LY294002對底物的選擇抑制濃度（數(shù)據(jù)未示），對應的使用終濃度分別為2、10和30μmol/L。

與我們以往報道的結(jié)果一致，SP600125處理顯著增加Dami和CMK細胞的DNA多倍性。與對照組（DMSO處理）Dami和CMK細胞的DNA平均倍性（2.8±0.2和2.9±0.4）相比，SP600125處理組的Dami和CMK細胞DNA平均倍性分別增至9.3±0.6和9.9±0.2（圖1A、B）。意外的是PD184352不能抑制SP600125誘導Dami和CMK細胞多倍體化。PD184352與SP600125聯(lián)合處理Dami和CMK細胞的DNA平均倍性與SP00125單獨處理沒有明顯差別，分別為8.9±0.7和9.5±0.3（圖1A、B）。然而，U0126和LY294002分別部分阻斷SP6000125誘導Dami和 CMK細胞 的多倍體化。U0126與SP600125聯(lián)合處理導致Dami和CMK細胞的DNA平均倍性分別降至6.8±0.2和7.3±0.3（與SP00125處理組比，P＜0.05）。LY294002與SP600125聯(lián)合處理導致Dami和CMK細胞DNA平均倍性分別降至6.6±0.1和7.2±0.2（與SP00125處理組比，P＜0.05）。同時，這些抑制劑自身并不能對Dami和CMK細胞的DNA含量分布產(chǎn)生影響（圖1C，CMK細胞數(shù)據(jù)未示）。該結(jié)果提示，PI3K和MAPK信號途徑，而不是MEK1/2信號途徑，可能參與SP600125誘導Dami和CMK細胞的多倍體化。

2.2 LY294002通 過 上 調(diào) Akt磷 酸 化 阻 斷SP600125誘導的多倍體化

圖1 流式細胞儀分析SP600125單獨處理或SP600125分別聯(lián)合PD184352、U0126和LY294002處理Dami和CMK細胞72 h，以及3種抑制劑PD184352、U0126和LY294002分別處理Dami細胞72 h的倍性變化

為進一步探討PD184352、U0126和LY294002對相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路的影響，用Western印跡分析了相關(guān)信號分子的表達和修飾變化。如圖2所示，PD184352可以顯著抑制SP600125誘導的p44/ 42 MAPK的Thr202/Tyr204的磷酸化，U0126則無此作用，表明SP600125誘導的Dami和CMK細胞多倍體化不依賴于MAPK信號轉(zhuǎn)導路徑。LY294002可上調(diào)SP600125誘導多倍體化Dami和CMK細胞Akt Ser473的磷酸化，表明 PI3K/Akt通路在用LY294002預處理的SP600126誘導的多倍體Dami和CMK細胞中被激活。鑒于PI3K/Akt通路活化促進細胞增殖，且LY294002處理可部分阻斷SP600125誘導的Dami和CMK細胞多倍體化，以及SP600125輕度下調(diào)Akt Ser473磷酸化（盡管并不十分明顯），因此，確保PI3K/Akt通路不過度活化有利于SP600125誘導Dami和CMK細胞多倍體化。值得注意的是，PD184352、LY294002和U0126均在SP600125誘導的多倍體Dami和CMK細胞中，部分抑制S6K1的Thr421/Ser424磷酸化。然而，這些抑制劑并不增加S6K1的Thr389磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明S6K1單獨的Thr421/Ser424磷酸化可能不足以介導由SP600125誘導Dami和CMK細胞的多倍體化，其他信號通路可能參與此過程。

2.3 S6K1 C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域磷酸化與Akt去磷酸化協(xié)同調(diào)節(jié)SP600125誘導的多倍體化

圖2 Western印跡檢測SP600125單獨處理和SP600125分別聯(lián)合PD184352、U0126、LY294002處理Dami和CMK細胞72 h的蛋白表達及磷酸化修飾位點的變化

我們以往曾發(fā)現(xiàn)myc-d/ED3E-pRK5（包含Ser411→Asp、Ser418→Asp、Thr421→Glu、Ser424→Asp和Thr389→Glu突變質(zhì)粒）可以阻斷Nocodazole誘導的Dami細胞多倍體化[4]。SP600125誘導 Dami和CMK細胞多倍體化伴隨著S6K1的Thr421/Ser424磷酸化和Thr389去磷酸化（圖2），而且，H-89通過占據(jù)S6K1的ATP結(jié)合位點，下調(diào)Thr421/Ser424磷酸化和上調(diào)Thr389磷酸化，阻斷SP600125誘導Dami和CMK細胞多倍體化[5]。然而，PD184352雖然可以下調(diào)SP600125誘導多倍體化Dami和CMK細胞上Thr421/Ser424磷酸化，但其并不阻斷SP600125誘導Dami和CMK細胞的多倍體化（圖1、2）。因此，為了明確S6K1 C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域磷酸化和Thr389磷酸化修飾在SP600125誘導多倍體化方面所起的作用，我們構(gòu)建了C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域內(nèi)相關(guān)磷酸化位點和Thr389位點的突變質(zhì)粒，即S6K1-WT、S6K1-T389E、S6K1-T389A和S6K1-D3E（圖3），并分別用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Dami細胞，觀察了對SP600125誘導Dami細胞倍體化的影響。令我們意外的是，與SP600125誘導的Dami細胞倍體化（7.04±0.37）相比，無論是轉(zhuǎn)染野生型S6K1（S6K1-WT：7.27±0.37）或突變型 S6K1（S6K1-T389E：6.93±0.32；S6K1-T389A：6.86±0.51；S6K1-D3E：6.78±0.4）均不能影響SP600125誘導的Dami細胞倍體化。然而，當S6K1-D3E與LY294002共同處理SP600125誘導的Dami細胞后，LY294002對倍體化的抑制作用（從7.04±0.37降至5.30± 0.18，P＜0.05）可被 S6K1-D3E進一步增強（從5.30±0.18降至4.07±0.14，P＜0.05）（圖4A、B）。然而，無論是S6K1-D3E突變聯(lián)合Thr389位點的模擬磷酸化突變（S6K1-T389E/D3E），還是去磷酸化突變（S6K1-T389A/D3E）均未明顯增強或降低S6K1-D3E對SP600125誘導倍體化的抑制作用（圖4C）。鑒于LY294002誘導Akt的Ser473磷酸化，該結(jié)果提示S6K1 C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域的磷酸化參與SP600125誘導Dami細胞的多倍體化調(diào)控，并需要Akt Ser473去磷酸化的協(xié)同作用。

3 討論

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是調(diào)控細胞合成代謝的重要開關(guān)[8]，已有研究發(fā)現(xiàn)，其參與哺乳動物細胞的多倍體化調(diào)控[9-10]。S6K1是mTOR下游的重要靶分子之一，其通過調(diào)控核糖體合成、蛋白質(zhì)合成、細胞周期進程和代謝，在細胞生長、增殖和分化中起重要作用[11-15]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，S6K1可能在藥物誘導巨核細胞白血病細胞系多倍體化過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。然而，詳細的作用機制尚不十分清楚，而且S6K1活性的調(diào)控比較復雜，至少包括mTOR、生長因子、激素和應激有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控的8個磷酸化位點（即 Thr229、Ser371、Thr389、Ser404、Ser411、Ser418、Thr421和Ser424）[16-18]。因此，在前期研究基礎上，我們進一步解析了S6K1的磷酸化修飾變化在藥物誘導巨核細胞白血病細胞系多倍體化過程中的調(diào)控機制。有研究報道，血清素誘導肺動脈平滑肌生長，且15（S）-羥基花生四烯酸誘導血管生成需要S6K1在Thr421/Ser424位點的磷酸化，但該過程可以被LY294002顯著阻斷[19-20]；脯氨酸介導有絲分裂原調(diào)節(jié)MAPK磷酸化Thr421/Ser424[6]；在心肌細胞中U0126阻斷TPA或胰島素誘導的S6K1 Thr421/Ser424位點的磷酸化[21]。

圖3 S6K1突變質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖4 S6K1突變質(zhì)粒對SP600125單獨處理和SP600125聯(lián)合LY294002處理Dami細胞72 h的倍性影響

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SP600125誘導p44/42 MAPK在Thr202/Tyr204位點的磷酸化及Dami和CMK細胞的多倍體化。雖然PD184352和U0126均能顯著抑制S6K1在Thr421/Ser424的磷酸化，然而盡管PD184352下調(diào)了p44/42 MAPK在Thr202/Tyr204位點的磷酸化，但并不抑制SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化。與此相反，U0126抑制SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化，但并不下調(diào)p44/42 MAPK的磷酸化。這些結(jié)果表明SP600125誘導的Dami和CMK細胞多倍體化不依賴于MAPK信號轉(zhuǎn)導路徑。有趣的是，LY294002不僅抑制Thr421/Ser424的磷酸化，同時增加Akt的磷酸化，并阻斷SP600125誘導的Dami和CMK細胞的多倍體化，該結(jié)果提示LY294002可能通過上調(diào)Akt磷酸化阻斷SP600125誘導的多倍體化。值得注意的是，這3種抑制劑均在SP600125誘導的多倍體Dami和CMK細胞中部分抑制S6K1的Thr421/Ser424磷酸化，然而，它們并不增加S6K1的Thr389磷酸化?？傊?，上述結(jié)果提示S6K1在Thr421/Ser424位點的磷酸化可能在SP600125誘導Dami和CMK細胞的多倍體化中發(fā)揮重要作用，然而，S6K1單獨的Thr421/Ser424磷酸化可能不足以介導由SP600125誘導Dami和CMK細胞的多倍體化。

有文獻報道，通過復合多位點磷酸化S6K1的逐步活化是通過C端假底物結(jié)構(gòu)域中的4個位點（Ser411、Ser418、Thr421和Ser424）的磷酸化來啟動，其誘導構(gòu)象變化、疏水基序（HM）和T-loop位點[7,22]。雖然這4個C端位點的磷酸化有助于S6K1激活，但其并非關(guān)鍵。這4個位點突變?yōu)楸彼釟埢蛘邚腃端刪除101個氨基酸殘基可以適當?shù)卣T導S6K1激活[7]。一般認為，Thr389位點的磷酸化是S6K1活化的標志[23]。盡管前期研究表明S6K1參與巨核細胞多倍體化的調(diào)控[4-5]，但調(diào)控S6K1活性的磷酸化位點的磷酸化修飾和倍體化的關(guān)系尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)用S6K1-WT、S6K1-T389E、S6K1-T389A和S6K1-D3E分別轉(zhuǎn)染Dami細胞，并沒有對SP600125誘導的多倍體化Dami細胞產(chǎn)生影響，同時，具有Thr389→Glu突變或Thr389→Ala突變的任何一種S6K1對SP600125單獨處理或聯(lián)合LY294002處理的Dami細胞多倍體化沒有影響。然而，S6K1-D3E可以進一步阻斷SP600125誘導的已被LY294002部分阻斷的Dami細胞多倍體化。鑒于LY294002誘導Akt的Ser473磷酸化，阻斷SP00125誘導的多倍體化，而且S6K1-D3E包含Ser411→Asp、Ser418→Asp、Thr421→Glu和Ser424→Asp的突變位點均位于C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域內(nèi)，提示Akt的Ser473位點去磷酸化和C端自抑制假底物結(jié)構(gòu)域內(nèi)上述位點的磷酸化在SP600125誘導的多倍體化方面發(fā)揮重要作用。然而，S6K1蛋白可分成數(shù)個重要結(jié)構(gòu)域，其通過復雜的多位點磷酸化來調(diào)控其活性。因此，仍需要進一步的研究來解析巨核細胞白血病細胞系多倍體化期間S6K1的相關(guān)分子機制。

[1]Wilcox D A.Megakaryocyte-and megakaryocyte precursor-related gene therapies[J].Blood,2016,127(10): 1260-1268.

[2]Geddis A E. Megakaryopoiesis[J]. Semin Hematol, 2010,47(3):212-219.

[3]Trakala M,Rodríguez-Acebes S,Maroto M,et al. Functional reprogramming of polyploidization in megakaryocytes[J].Dev Cell,2015,32(2):155-167.

[4]Ma D,Yu H,Lin D,et al.S6K1 is involved in polyploidization through its phosphorylation at Thr421/ Ser424[J].J Cell Physiol,2009,219(1):31-44.

[5]王麗麗,楊金剛,李長嶺,等.核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）介導SP600125誘導的巨核細胞白血病細胞系多倍體化依賴于細胞分化程度[J].細胞與分子生物學雜志,2016,32(10):1336-1341.

[6]Mukhopadhyay N K,Price D J,Kyriakis J M,et al. An array of insulin-activated,proline-directed serine/ threonine protein kinases phosphorylate the p70 S6 kinase[J].J Biol Chem,1992,267:3325-3335.

[7]Magnuson B,Ekim B,Fingar D C.Regulation and function of ribosomal protein S6 kinase(S6K)within mTOR signalling networks[J].Biochem J,2012,441:1-21.

[8]Li T,Wang G.Computer-aided targeting of the PI3K/ Akt/mTOR pathway:toxicity reduction and therapeutic opportunities[J].Int J Mol Sci,2014,15(10):18856-18891.

[9]Li Y,Chen X,Tang X,et al.DNA synthesis during endomitosis is stimulated by insulin via the PI3K/Akt and TOR signaling pathways in the silk gland cells of Bombyx mori[J].Int J Mol Sci,2015,16(3):6266-6280.

[10]Sharma S,Yao H P,Zhou Y Q,et al.Prevention of BMS-777607-induced polyploidy/senescence by mTOR inhibitor AZD8055 sensitizes breast cancer cells to cytotoxic chemotherapeutics[J].Mol Oncol,2014,8(3):469-482.

[11]Tavares M R,Pavan I C,Amaral C L,et al.The S6K protein family in health and disease[J].Life, 2015,131:1-10.

[12]Yi S A,Um S H,Lee J,et al.S6K1 Phosphorylation of H2B mediates EZH2 trimethylation of H3:A determinant of early adipogenesis[J].Mol Cell,2016,62(3): 443-452.

[13]Wu H,Xiao Z,Wang K,et al.MiR-145 is downregulated in human ovarian cancer and modulates cell growth and invasion by targeting p70S6K1 and MUC1 [J].Biochem Biophys Res Commun,2013,441(4):693-700.

[14]Pavan I C,Yokoo S,Granato D C,et al.Different interactomes for p70-S6K1 and p54-S6K2 revealed by proteomic analysis[J]. Proteomics, 2016,16(20):2650-2666.

[15]Miyake S,Wakita H,Bernstock J D,et al.Hypophosphorylation of ribosomal protein S6 is a molecular mechanism underlying ischemic tolerance induced by either hibernation or preconditioning[J].J Neurochem, 2015,135(5):943-957.

[16]Shin S,Wolgamott L,Yu Y,et al.Glycogen synthase kinase(GSK)-3 promotes p70 ribosomal protein S6 kinase(p70S6K)activity and cell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(47):E1204-1213.

[17]Wang J,Zhong C,Wang F,et al.Crystal structures of S6K1 provide insights into the regulation mechanism of S6K1 by the hydrophobic motif[J].Biochem J,2013,454(1):39-47.

[18]Zhang H,Hoff H,Marinucci T,et al.Mitogen-independent phosphorylation of S6K1 and decreased ribosomal S6 phosphorylation in senescent human fibroblasts[J].Exp Cell Res,2000,259(1):284-292.

[19]Liu Y,Fanburg B L.Serotonin-induced growth of pulmonary artery smooth muscle requires activation of phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine protein kinase B/mammalian target of rapamycin/p70 ribosomal S6 kinase 1[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2006, 34:182-191.

[20]Ohanna M,Sobering A K,Lapointe T,et al.Atrophy of S6K1(2/2)skeletal muscle cells reveals distinct mTOR effectors for cell cycle and size control[J].Nat Cell Biol,2005,7:286-294.

[21]Iijima Y,Laser M,Shiraishi H,et al.c-Raf/MEK/ ERK pathway controls protein kinase C-mediated p70S6K activation in adult cardiac muscle cells[J].J Biol Chem,2002,277:23065-23075.

[22]Fenton T R,Gout I T.Functions and regulation of the 70kDa ribosomal S6 kinases[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(1):47-59.

[23]Doscas M E,Williamson A J,Usha L,et al.Inhibition of p70 S6 kinase(S6K1)activity by A77 1726 and its effect on cell proliferation and cell cycle progress[J].Neoplasia,2014,16(10):824-834.

SP600125-Induced Polyploidization of Megakaryocytic Cell Lines by the Regulation of S6K 1 C-Terminal Autoinhibitory Pseudosubstrate Domain Phosphorylation and Akt Dephosphorylation

ZHANG Lu-Yao1,3,WANG Li-Li2,YANG Jin-Gang2,XING Si-Ning2, ZHAO Song2,YU Ying2,XIE Xiao-Dong3*,MA Dong-Chu2*
1.Liaoning University of Chinese Medicine,Shenyang 113021;
2.Department of Experimental Medicine,Tumor Center of PLA,Norhern Hospital,Shenyang 110016;
3.Department of Oncology,Tumor Center of PLA,Norhern Hospital,Shenyang 110016;China

*Co-corresponding authors,MA Dong-Chu,E-mail:mdc580819@sina.com;XIE Xiao-Dong,E-mail:doctor-xxd@163.com

［Abstract］Objective:To investigate the mechanism of SP600125-induced polyploidization of megakaryocytic leukemia cell lines.Methods:Dami and CMK cells were treated with SP600125 and three inhibitors PD184352, U0126 and LY294002.Meanwhile,we constructed plasmid encoding mutated ribosomal protein S6 kinase 1（S6K1）by point mutagenesis targeting the C-terminal autoinhibitory pseudosubstrate domain and the hydrophobic motif of S6K1 to transfecte cells.The DNA ploidy was analyzed by flow cytometry.The expression and phosphorylation of S6K1,MAPK and Akt were detected by Western blot.Results:When three inhibitors were used alone,there was no effect on the ploidy of Dami and CMK cells.When SP600125 was combined with three inhibitors,PD184352 did not inhibit SP600125-induced polyploidization of Dami and CMK cells,although it decreased the phosphorylation of p44/42 MAPK at Thr202/Tyr204.In contrast,U0126 inhibited SP600125-induced polyploidization of Dami and CMK cells,but did not decreased p44/42 MAPK phosphorylation.While LY294002 increased the phosphorylation of Akt and blocked SP600125-induced polyploidization of Dami and CMK cells.Notably,these three inhibitors,in SP600125-induced polyploidization of Dami and CMK cells,partially inhibited the phosphorylation of S6K1 at Thr421/Ser424,but did not increase the phosphorylation of S6K1 at Thr389.Dami cells that transfected with S6K1 mutant plasmid did not affect SP600125-induced polyploidization.At the same time,either the phosphorylation or dephosphorylation mutations with Thr389sites had no effect on SP600125-induced polyploidization,and it did not show synergistic effect with LY294002.However,C-terminal autoinhibitory pseudosubstrate domain mutant plasmid（S6K1-D3E）could further block polyploidization of SP600125-induced polyploidization of Dami cells that had been partially blocked by LY294002.Conclusion:SP600125-induced polyploidization of megakaryocytic leukemia cell lines by the regulation of S6K1 C-terminal autoinhibitory pseudosubstrate domain phosphorylation and Akt dephosphorylation.

S6 kinase 1（S6K1）;Akt;megakaryocytes;polyploidization

Q25

A

1009-0002（2017）03-0233-09

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.002

2016-12-29

國家自然科學基金（61302003，31571398）

張路遙（1990-），女，碩士研究生，（E-mail）329730208@qq.com

馬東初，（E-mail）mdc580819@sina.com；謝曉冬，（E-mail）doctor-xxd@163.com