張夢(mèng)燕，孫軍利*，趙寶龍，劉晶晶，張帥，李格

（1. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000）

外源ALA對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)及PAL活性的影響

張夢(mèng)燕1,2，孫軍利1,2*，趙寶龍1,2，劉晶晶1，張帥1，李格1,2

（1. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832000；2. 特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000）

以露地栽培的歐亞種葡萄克瑞森無(wú)核和紅地球?yàn)樵囼?yàn)材料，研究了不同濃度的5-氨基乙酰丙酸（ALA）處理對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)及苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性的影響。結(jié)果表明，不同濃度ALA處理能明顯提高葡萄果皮花青素含量及糖酸比幅度，以100 mg/L ALA處理表現(xiàn)最好，且葡萄果實(shí)中花青素含量與果肉中可溶性糖含量、可滴定酸含量以及果皮內(nèi)PAL活性密切相關(guān)。果皮中花青素含量與合成相關(guān)PAL酶活性、總糖的含量變化趨勢(shì)呈顯著正相關(guān)，與總酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明ALA處理能有效改善葡萄果實(shí)品質(zhì)及促進(jìn)葡萄果實(shí)著色。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）；葡萄；花青苷；品質(zhì)；PAL活性

果實(shí)色澤是作為鮮食消費(fèi)的重要依據(jù)，也是影響葡萄酒品質(zhì)的重要因素[1-2]?；ㄉ兆鳛樽匀唤缫环N重要的植物水溶性色素，是花青素和糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一種黃酮類化合物，普遍存在于植物的花、葉、莖、果實(shí)和根器官中，通過在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)合成運(yùn)輸?shù)揭号葜?，使果?shí)表面呈現(xiàn)出紅、紫紅到藍(lán)等不同顏色。有研究表明，果皮中花色苷能夠提高植物抗光氧化性和抗病性。經(jīng)常食用花色苷還有利于人體健康，并具有良好的抗氧化、防衰老、抗癌等功效。苯丙氨酸裂解酶（Phenvlalanine Ammonia Lvase，PAL）是一種受多種外界因素影響的誘導(dǎo)酶，通過轉(zhuǎn)錄合成能夠催化花青苷的生物合成，屬于葡萄花色苷生物合成途徑中初始反應(yīng)的關(guān)鍵酶。通過對(duì)PAL活性的調(diào)節(jié)，有學(xué)者研究認(rèn)為PAL能夠促進(jìn)牽?；ǖ戎参镏谢ㄉ盏男纬珊头e累，從而有效改變矮牽牛的花色[3]。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）作為自然界動(dòng)植物以及微生物體內(nèi)存在的一種生理活性物質(zhì)，與生命活動(dòng)有著密切聯(lián)系。有研究指出，ALA處理能夠促進(jìn)植物葉片光合效率，提高作物產(chǎn)量并改善品質(zhì)[4]，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，被視為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[5]。謝荔[6]對(duì)ALA誘導(dǎo)葡萄和蘋果果皮花青素積累機(jī)理的研究結(jié)果表明，ALA處理能夠顯著提高葡萄果實(shí)可溶性糖含量，降低可滴定酸含量，且一定濃度的ALA能顯著提高葡萄果皮花青素含量。新疆具有豐富的光熱資源，屬于葡萄種植的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。但目前生產(chǎn)中有些葡萄品種存在著色困難問題，其中噴施外源ALA改善果品色澤已經(jīng)在蘋果、番茄、紅棗等植物上普遍應(yīng)用，但有關(guān)外源ALA是否能夠有效促進(jìn)葡萄果實(shí)著色，提高葡萄果實(shí)品質(zhì)及PAL活性的研究較少。本試驗(yàn)以露地栽培歐亞葡萄品種克瑞森無(wú)核和紅地球?yàn)樵囼?yàn)材料，研究不同濃度ALA處理對(duì)發(fā)育成熟期的葡萄果皮著色效果、果實(shí)品質(zhì)及相關(guān)酶活性的影響，為ALA在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站葡萄園的歐亞葡萄品種克瑞森無(wú)核和紅地球?yàn)樵囼?yàn)材料，采用水平連疊式棚架露地栽培，株行距0.5 m×3.5 m，東西行向，獨(dú)龍干整形，葡萄果實(shí)性狀表現(xiàn)均勻一致。

1.2 方法

選擇架勢(shì)、長(zhǎng)勢(shì)和負(fù)載量均相似的葡萄植株，在葡萄花青素形成的兩個(gè)高峰期即盛花期后4～8周和14～18周將待用的葡萄果穗用0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ALA溶液噴施葡萄植株及果穗，其中0 mg/L是以清水噴施為對(duì)照。在克瑞森無(wú)核和紅地球兩個(gè)品種完全成熟期進(jìn)行采樣，每個(gè)處理采集3穗果，3次重復(fù)，測(cè)定葡萄果實(shí)的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.2.1 果實(shí)品質(zhì)測(cè)定

可溶性糖含量測(cè)定參照李合生[7]的方法：用蒽酮比色法?？傻味ㄋ岷康臏y(cè)定采用酸堿滴定法[8]。在采集的每個(gè)處理果穗中隨機(jī)選取10粒長(zhǎng)勢(shì)較一致的果粒，去皮后的新鮮果肉用榨汁機(jī)打碎混勻，稱取3份各1g，用以可溶性糖、可滴定酸含量的測(cè)定，重復(fù)3次。

1.2.2 果皮PAL活性測(cè)定

果皮PAL酶活性測(cè)定參考Lister等[9]方法并加以改進(jìn)，每個(gè)處理分別稱取果皮1 g，加液氮研磨至粉末狀后加入5 mL提取液（0.05 mol/L Na2HPO4(pH7.0)；0.05 mol/L 抗壞血酸；0.018 mol/L巰基乙醇），冰浴勻漿，4 ℃，15 000 r/min離心20 min，上清液即為酶液。取1 mL酶液，加入3 mL反應(yīng)體系中（2 mL的0.2 mol/L，pH 8.8 的硼酸緩沖溶液；1 mL的0.05 mol/L L-苯丙氨酸），于37 ℃水浴中反應(yīng)90 min，后加入0.2 mL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，測(cè)定290 nm下吸光值。每分鐘光密度變化0.01為1個(gè)酶活力單位（U）。酶活性單位表示為U/g FW。

1.2.3 果皮花青素含量測(cè)定

果皮花青素含量的測(cè)定按照仝月澳等[10]方法加以改進(jìn)，在采集的每個(gè)處理果穗中隨機(jī)選取10粒均勻一致的果實(shí)，剝?nèi)」び靡旱賰鰩Щ貙?shí)驗(yàn)室于-80 ℃超低溫冰箱中貯存待測(cè)。每個(gè)處理分別稱取葡萄果皮1 g剪碎混勻放入刻度試管中，加0.1 mol/L HCl溶液10 mL（蓋緊杯口）置32 ℃恒溫箱中提取4 h以上，過濾，濾液為花青素提取液，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。將讀取的光密度值乘以10用以代表花青素相對(duì)濃度（U/g FW）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA處理對(duì)葡萄果肉中可溶性糖、可滴定酸含量及糖酸比的影響

圖1、圖2顯示的是不同濃度ALA處理后葡萄果實(shí)完全成熟時(shí)可溶性糖與可滴定酸含量的變化。由這兩個(gè)圖可知，在葡萄果實(shí)著色期用不同濃度ALA處理可在不同程度上提高果實(shí)的可溶性糖含量，同時(shí)降低可滴定酸含量。從圖1中可看出，經(jīng)不同濃度ALA處理后，兩品種果實(shí)中可溶性糖含量明顯高于對(duì)照處理，以100 mg/L ALA處理表現(xiàn)最好，且顯著高于對(duì)照，克瑞森無(wú)核高達(dá)20.23%，紅地球達(dá)到14.93%。同時(shí)，圖2顯示所有濃度ALA處理兩葡萄品種果實(shí)中可滴定酸含量明顯低于對(duì)照，雖差異幅度較糖變化小，但也可看出100 mg/L ALA處理的效果最顯著，克瑞森無(wú)核葡萄果肉總酸度為0.16%，紅地球?yàn)?.15%。

結(jié)合圖1、圖2，從圖3中可看出，由于可溶性糖含量的上升，可滴定酸下降，3種濃度ALA處理在不同程度上提高了果實(shí)的糖酸比，其克瑞森無(wú)核葡萄平均增幅達(dá)41.83%，紅地球葡萄平均增幅達(dá)42.54%。

2.2 ALA處理對(duì)葡萄果皮中PAL活性變化的影響

圖1 不同濃度ALA處理對(duì)克瑞森無(wú)核及紅地球葡萄果實(shí)可溶性糖含量的影響

圖2 不同濃度ALA處理對(duì)克瑞森無(wú)核及紅地球葡萄果實(shí)可滴定酸含量的影響

圖3 不同濃度ALA處理對(duì)克瑞森無(wú)核及紅地球葡萄果實(shí)糖酸比的影響

從圖4中可看出，經(jīng)不同濃度ALA處理后，兩品種葡萄果皮中PAL的活性顯著高于對(duì)照，同樣以100 mg/L ALA處理的促進(jìn)效應(yīng)表現(xiàn)最好，克瑞森無(wú)核達(dá)到134 U/g FW，紅地球達(dá)到126 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA處理之間差異幅度較小。

2.3 ALA處理對(duì)葡萄果皮中花青素含量變化的影響

由圖5可知，不同濃度ALA處理對(duì)葡萄果皮中花青素含量增加的促進(jìn)效應(yīng)不同。經(jīng)不同濃度ALA處理后，兩品種葡萄果實(shí)完全成熟時(shí)花青素含量大幅度提升，顯著高于對(duì)照處理。其中，100 mg/L ALA處理的促進(jìn)效應(yīng)最顯著，克瑞森無(wú)核葡萄果皮中花青素含量達(dá)35.3 U/g FW，紅地球達(dá)30.4 U/g FW，50 mg/L和150 mg/L ALA處理之間無(wú)顯著差異。

2.4 果皮花青素與其合成相關(guān)PAL酶活性、果肉糖、酸含量的相關(guān)性分析

應(yīng)用 SPSS 16.0對(duì)100 mg/L ALA處理的克瑞森無(wú)核和紅地球兩品種果皮花青素與其合成相關(guān)PAL活性、果肉可溶性糖、可滴定酸含量進(jìn)行線性相關(guān)分析，結(jié)果表明，克瑞森無(wú)核和紅地球葡萄果皮中花青素的形成與果肉中糖積累量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)與果肉中酸含量呈明顯負(fù)相關(guān)。兩品種果皮中的花青素的積累量與其合成相關(guān)PAL活性均達(dá)顯著水平。相關(guān)系數(shù)見表1。

圖4 不同濃度ALA處理對(duì)克瑞森無(wú)核及紅地球葡萄果皮PAL活性的影響

圖5 不同濃度ALA處理對(duì)克瑞森無(wú)核及紅地球葡萄果皮花青素含量的影響

表1 克瑞森與紅地球葡萄果皮花青素與糖、酸及PAL活性的相關(guān)系數(shù)

3 討論與結(jié)論

果皮色澤是衡量鮮食葡萄果品商品價(jià)值的重要指標(biāo)，同時(shí)也是釀酒葡萄果實(shí)重要質(zhì)量指標(biāo)。大量研究證明，花色苷的含量以及不同花色苷的組成比例是使葡萄漿果與葡萄酒呈現(xiàn)不同顏色的主要因素。花色苷的合成與可溶性糖、可滴定酸含量密切相關(guān)[11-12]?；ㄉ辗肿佑商呛突ㄉ亟M成，糖不僅是花色苷合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，更多是通過信號(hào)機(jī)制作為信號(hào)物質(zhì)促進(jìn)花色苷的合成。曹雄軍等[13]對(duì)歐亞種葡萄紅寶石無(wú)核和紅地球果實(shí)著色與糖含量關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)不斷發(fā)育，葡萄果皮中花色苷含量與果肉中糖積累量的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，同時(shí)與葡萄果肉中酸含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，這一結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

PAL基因的表達(dá)受到各種類型外源植物激素的影響，王中華等[14]通過在蘋果果實(shí)著色期噴施ALA對(duì)蘋果果皮花青素形成的促進(jìn)效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ALA處理后，果實(shí)中可溶性固形物含量顯著提高，酸度明顯降低，在光照36 h內(nèi)其果皮中PAL的活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且在離體條件下蘋果果皮花青素的積累量明顯提高。還有學(xué)者提出，不僅ALA處理能夠促進(jìn)“富士”蘋果果皮中花青素的積累，且ALA生物合成前體谷氨酸也能明顯提高花青素的含量[15]。因而，ALA處理對(duì)提高果實(shí)品質(zhì)效應(yīng)具有一定的普遍性。

本研究表明，一定濃度的外源ALA處理能夠顯著提高葡萄果皮花青素含量及合成相關(guān)PAL酶活性，且提高果實(shí)可溶性糖含量，可滴定酸含量相應(yīng)降低，糖酸比大幅度提升，改善了葡萄果實(shí)的品質(zhì)，對(duì)葡萄果實(shí)著色具有很好促進(jìn)作用。但從ALA的具體濃度分析來(lái)看，ALA對(duì)葡萄果實(shí)的這種促進(jìn)作用并不隨其濃度的增大而增強(qiáng)，根據(jù)ALA濃度的配比存在其處理的最適濃度。本研究發(fā)現(xiàn)ALA處理能夠大幅度提升葡萄果實(shí)的糖酸比，這與前人在ALA促進(jìn)蘋果糖酸含量積累的結(jié)果相似。但ALA對(duì)促進(jìn)果實(shí)花色苷合成生理機(jī)制的研究尚不明確，需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

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Effects of exogenous ALA on fruit quality and PAL enzyme activity of grapevine

ZHANG Mengyan1,2, SUN Junli1,2*, ZHAO Baolong1,2, LIU Jingjing1, ZHANG Shuai1, LI Ge1,2
(1. College of Agronomy, Shihezi University, 2. Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germlasm Resources Utilization, Shihezi 832000)

Crimson Seedless and Red Globe (Vitis vinifera L.cv.) in the open field cultivation as experimental materials, were treated by different concentrations of ALA to investigate the effect of ALA on grape quality and PAL enzyme activity. Results showed that in the process of fruit ripening, sugar, acid and anthocyanidin synthesis related regulatory gene was closely related with the accumulation of anthocyanidin, ALA treatment could obviously increase the contents of sugar and acids in berries, and anthocyanidin content in pericarp, the 100 mg/L ALA treatment was the best. There were signifi cant positive correlation between anthocyanidin content and PAL activity and total sugar content, which was negatively correlated with total acid content. The results indicated that ALA could effectively improve quality and coloration of berries.

5-aminolevulinic acid(ALA); grape; anthocyanidin; quality; PAL enzyme activity

S663.1；Q945.15

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2017.03.003

2017-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31560542）；新疆建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016AG007）

張夢(mèng)燕，女，四川簡(jiǎn)陽(yáng)人，在讀碩士研究生。E-mail: 1511449518@qq.com

*通訊作者：孫軍利，E-mail: 1530322722@qq.com