王歡 侯殿東 陳文娜 郭勝楠 雷萍 韓曉偉 徐銘 關(guān)洪全

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，遼寧 沈陽 116600

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人參多糖對NK92-MI細胞殺傷活性的影響及機制

王歡1侯殿東1陳文娜2郭勝楠2雷萍1韓曉偉1徐銘1關(guān)洪全1*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，遼寧 沈陽 116600

目的：研究人參多糖對NK92-MI殺傷活性的影響及機制。方法：采用200mg/L或400mg/L GPS作用于NK92-MI細胞，24h后收集細胞，采用CCK-8 試劑盒檢測GPS對NK92-MI細胞殺傷活性和增殖活性的影響；采用流式細胞術(shù)檢測GPS對NK92-MI細胞活化受體(NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D)表達的影響；采用western blot技術(shù)檢測NK細胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)表達水平。結(jié)果：與正常對照組相比，GPS可明顯促進NK細胞殺傷活性，上調(diào)活化受體(NKp30、NKp44、NKp46)、殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的表達水平(P<0.05)。結(jié)論：GPS通過上調(diào)活化受體(NKp30、NKp44、NKp46)的表達促進NK92-MI細胞的活化，并且通過上調(diào)殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的表達提高NK92-MI細胞的殺傷活性。

人參多糖；NK92-MI細胞；殺傷活性

人參多糖(Ginseng Polysaccharides，GPS)是中藥人參的主要活性成分之一，是一種高分子葡聚糖，主要由人參淀粉和人參果膠兩部分組成[1]。研究發(fā)現(xiàn)GPS具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、造血調(diào)控、抗疲勞和抗抑郁等作用，其中免疫調(diào)節(jié)活性尤為受重視[2]。前期的研究結(jié)果表明，GPS可明顯提高免疫抑制小鼠NK細胞的殺傷活性[3]。其機制可能為，GPS可能通過調(diào)節(jié)機體整體免疫功能(比如調(diào)節(jié)細胞因子的水平)而促進NK細胞的殺傷功能；或GPS進入機體也可能直接對NK細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。為進一步探討GPS對NK細胞的直接活化效應(yīng)及機制，采用GPS作用于NK92-MI細胞株，揭示GPS對NK細胞作用的分子機制，為進一步研究GPS的免疫調(diào)節(jié)活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 NK92-MI細胞株購自中科院上海細胞庫。人參多糖注射液(3mg/mL)(批號：Z20025235，沈陽雙鼎制藥公司);CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC購自美國eBioscience公司。anti-perforin、anti-granzyme B購自美國Santa Cruz公司;α-MEM 培養(yǎng)基(美國Invitrogen 公司)。馬血清及胎牛血清(美國HYCLONE公司);

1.2 方法

1.2.1 NK92-MI細胞培養(yǎng) 用含12.5% 胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組及細胞處理 實驗組NK92-MI細胞分別以200mg/L或400mg/L GPS刺激，對照組加入等量PBS，24h后收集細胞。

1.2.3 NK92-MI細胞對K562 殺傷活性的測定 K562 細胞以10% FBS RPMI-1640 培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。以對數(shù)期的K562細胞為靶細胞，各實驗孔加入靶細胞100μL/孔(濃度為1×105/mL)，使效靶比分別為4∶1，同時設(shè)效應(yīng)細胞對照孔、靶細胞對照孔及空白對照孔，各孔均設(shè)3個復(fù)孔。效靶細胞共同孵育4h后，每孔加入CCK-8 液(5mg/mL)20μL，再繼續(xù)孵育1h。用酶標儀于450nm 處測定OD值。按下列公式計算NK-92MI 細胞對K562細胞的殺傷率: NK 細胞殺傷率(%)=[1-(殺傷實驗組OD 值-效應(yīng)細胞對照組OD值)/靶細胞對照組OD值]×100% 。

1.2.4 流式檢測 調(diào)細胞濃度為4×105/mL，用人IgG(1μg/105)封閉Fc受體(室溫，15min)。加入10μL熒光標記單抗(CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC)，4℃避光孵育30～45min。染色后的細胞用相同PBS緩沖液洗滌3次。細胞重懸于500μL含0.5%BSA的 PBS緩沖液中，流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 GPS對NK92-MI細胞殺傷活性的影響 如表1所示，與正常對照組細胞相比，400mg/L GPS可明顯提高NK92-MI細胞殺傷活性(P<0.05)。

表1 GPS對NK92-MI細胞殺傷活性的影響

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 GPS對NK92-MI細胞活化受體表達的影響 如表2及圖1所示，200mg/L和400mg/L的GPS均可明顯或顯著上調(diào)NKp30或NKp44的表達(P<0.05或P<0.005)，400mg/L的GPS均可明顯上調(diào)NKp46的表達(P<0.005)。但兩個濃度的GPS對NKG2D的表達均無明顯影響(P>0.05)。

表2 GPS對NK92-MI細胞活化受體表達的影響 (%)

注：與對照組相比，ΔP<0.005，*P<0.05

2.3 GPS對NK92-MI細胞穿孔素和顆粒酶B表達的影響 如圖2所示，400mg/L的GPS可有效上調(diào)NK92-MI細胞穿孔素和顆粒酶B的表達(P<0.005),但200mg/L的GPS對穿孔素和顆粒酶B的表達均無明顯影響(P>0.05)。

3 討論

NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細胞，是機體抵御腫瘤和病毒感染的第1道防線。NK細胞在機體抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的作用[4]。研究表明GPS增強NK細胞的活性，提高機體抗腫瘤的能力，但相關(guān)機制研究較少。NK92-MI是源自NK-92的IL-2非依賴的NK細胞株，實驗采用NK92-MI細胞株研究了GPS對NK細胞的直接活化作用。NK細胞識別和殺傷靶細胞的機制與其表面受體的特性密切相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)的NK細胞表面的活化性受體包括自然細胞毒受體(Natural Cytotoxicity Receptors，NCRs)、NKG2D、活化殺傷免疫球蛋白樣受體(Killer immunogloblin-Like receptors，KIRs)及其他輔助刺活化性受體等[5-6]?；罨允荏w與配體交聯(lián)結(jié)合后產(chǎn)生的激活信號導(dǎo)致NK細胞脫顆粒，釋放殺傷介質(zhì)穿孔素和顆粒酶，誘導(dǎo)靶細胞凋亡[7]。NCRs為近年發(fā)現(xiàn)的一類非MHC限制的特異性啟動NK細胞活化的表面分子，屬于免疫球蛋白超家族受體，成員包括NKp46、NKp44和NKp30。NK細胞表面的活化性受體在細胞表面的表達程度與NK細胞功能的發(fā)揮密切相關(guān)[8]。

實驗中，與正常對照組相比，400mg/L的GPS均可明顯提高NK92-MI細胞殺傷活性，200mg/L和400mg/L的GPS均可明顯或顯著上調(diào)NKp30或NKp44的表達，400mg/L的GPS均可顯著上調(diào)NKp46的表達。并且400mg/L的GPS可顯著上調(diào)NK92-MI細胞穿孔素和顆粒酶B的表達。

綜上所述，研究表明GPS能提高NK92-MI細胞的殺傷活性，其機制為GPS通過上調(diào)活化受體(NKp30、NKp44、NKp46)的表達促進NK92-MI細胞的活化，并且通過上調(diào)殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的表達提高NK92-MI細胞的殺傷活性。

[1]Cheng H,Li S,Fan Y, et al.Comparative studies of the antiproliferative effects ofginsengpolysaccharideson HT-29 human colon cancer cells[J]. Med Oncol, 2011, 28(1):175-181.

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[8] Chang CJ, Chen YY, Lu CC, et al.Ganoderma lucidum stimulatesNKcellcytotoxicityby inducingNKG2D/NCR activation and secretion of perforin and granulysin[J].Innate Immun, 2014，20(3):301-311.

Effects of ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells

WANG Huan1HOU Diandong1CHEN Wenna2GUO Shengnan2LEI Ping1HAN Xiaowei1XU Ming1GUAN Hongquan1*

1.Basic Medical College, Liaonign University of China Medical University，Shenyang 116600，China；2. Experiment and Technology Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 116600，China

Objective To research the influence and mechanism of Ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells.Methods CCK8 kit was adopted to detect the cytotoxicity of NK92-MI cells, Flow cytometric analysis was adopted to detect the expression of activated receptors, western blot was adopted to detect the expression level of perforin and Granzyme B.Results Compare to the normal control group, GPS could increase the cytotoxicity, expression of NKp30, NKp44, NKp46, perforin and granzymeB.Conclusion GPS can increase the cytotoxicity of NK92-MI cells by increasing expression of activated receptors, perforin and granzyme B.

GPS; NK92-MI Cells; Cytotoxicity

國家自然科學(xué)基金(81303079)；遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長計劃(LJQ2015072)。

王歡(1988-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥及有效成分免疫調(diào)節(jié)作用。E-mail:huan.4653@qq.com

關(guān)洪全(1954-),男，滿族，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥及有效成分免疫調(diào)節(jié)作用。E-mail:hongquanguan@sina.com

R284.2

A

1007-8517(2017)09-0037-04

2017-03-08 編輯：梁志慶)