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        鉤吻生物堿化在不同濕熱滅菌條件下的成分動態(tài)變化

        2017-06-09 06:26:35黃美霞洪懷山廖華軍王英豪李德森吳水生
        中國民族民間醫(yī)藥 2017年9期

        黃美霞 洪懷山 廖華軍 王英豪 李德森 吳水生*

        1.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 350108;2. 福建省立醫(yī)院/福建省立金山醫(yī)院,福建 福州 350028

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        藥物研究

        鉤吻生物堿化在不同濕熱滅菌條件下的成分動態(tài)變化

        黃美霞1洪懷山2廖華軍1王英豪1李德森1吳水生1*

        1.福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建 福州 350108;2. 福建省立醫(yī)院/福建省立金山醫(yī)院,福建 福州 350028

        目的:探討鉤吻生物堿類化學成分隨濕熱滅菌條件的變化規(guī)律。方法:采用高壓蒸汽滅菌、低溫間歇滅菌等不同條件,將鉤吻藤莖粉末進行濕熱滅菌,用HPLC法對滅菌前后的化學成分中的鉤吻堿甲、鉤吻素子、鉤吻素己、胡蔓藤堿乙的含量進行監(jiān)測。結果:60℃,70℃滅菌3次,鉤吻生物堿成分含量未見明顯變化,鉤吻堿甲在各滅菌條件下較穩(wěn)定。鉤吻素己80℃滅菌4次分別降低29.3%,28.2%,26.4%,32.8%,其余生物堿影響不大;90℃滅菌4次,鉤吻素子分別降低8.5%,15.4%,15.4%,17.4%;鉤吻素己分別降低32.8%,48.3%,55.2%,56.9%;胡蔓藤堿乙降低了1.3%,12.7%,12.7%,11.9%;121℃,21min高壓滅菌對鉤吻多種生物堿成分的破壞均較大,其中鉤吻素己含量降低多達89%。結論:鉤吻生物堿受濕熱溫度影響較大,其中鉤吻素己最顯著,80℃間歇滅菌4次是保證對鉤吻滅菌較徹底且破壞性最低的滅菌方法。

        鉤吻;滅菌溫度;生物堿;含量;HPLC

        鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn. et Champ.) Benth.系馬錢科Loganiaceae鉤吻屬Gelsemium植物[1]。因其具有劇毒,自古以來又被稱為斷腸草。鉤吻有2種,北美鉤吻,有劇毒,主要分布于美洲;中國鉤吻,產(chǎn)于亞洲,主要分布在福建,江西,浙江,湖南等地[2-3]。研究表明,鉤吻具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗應激等藥理作用。生物堿是其主要活性成分,同時也是其主要的毒性成分[4-6],這給廣大研究人員帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)與機遇。課題組采用炮制、配伍、雙向固體發(fā)酵[7-8]等方式對鉤吻進行系列減毒研究。并發(fā)現(xiàn)鉤吻堿甲,鉤吻素子,鉤吻素己,胡蔓藤堿乙4種生物堿類化學成分在發(fā)酵前后含量發(fā)生了顯著變化。因雙向固體發(fā)酵的設計為基于純種菌的發(fā)酵,因此發(fā)酵前對鉤吻藥材進行了必要的滅菌環(huán)節(jié),實驗發(fā)現(xiàn)上述生物堿的含量不僅受發(fā)酵過程影響,且受滅菌溫度、濕度影響顯著,筆者報道不同濕熱條件下,鉤吻主要化學成分的含量變化,為鉤吻的減毒研究提供依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司);島津 LC solution工作站、DV215CD 型1/10萬分析天平(奧豪斯公司) ;Milli-Q 型超純水儀(美國Millipore);高壓蒸氣滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司)。

        1.2 材料 乙腈(色譜純,德國MERCK公司);95%乙醇,三乙胺,磷酸(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。鉤吻(生品)采集于福建省寧德市霞浦縣,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學大學楊成梓教授鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物Gelsemium elegans (Gardn. et Champ.) Benth.。

        2 方法

        2.1 樣品制備

        2.1.1 高壓蒸汽滅菌樣品制備 平行稱取3份干燥的鉤吻粉末10g,粉碎(過10目篩),裝入三角錐形瓶,加20mL水浸潤至透,加清潔棉塞,牛皮紙扎口。0.2 MPa蒸汽,121℃滅菌20min。放涼后,置于濕度90%,溫度28℃培養(yǎng)箱內(nèi)。

        2.1.2 低溫間歇滅菌樣品的制備 平行稱取干燥的鉤吻藤莖10g,粉碎(過10目篩),分別裝入三角錐形瓶,加20mL 60、70、80、90℃蒸餾水浸潤至透,加清潔棉塞,牛皮紙扎口。并分別置于60、70、80、90℃烘箱中1h,滅菌3次,80、90℃組分別滅菌4次,每2次滅菌時間間隔24 h,各個樣品平行測定3份。每次滅菌后放涼并置于相對濕度90%,溫度28℃培養(yǎng)箱內(nèi)。2.2 樣品的提取與前處理 取鉤吻生品(GV)、滅菌鉤吻(樣品1~10),分別用7倍量95%乙醇回流提取3次,合并提取液旋轉蒸發(fā)回收溶劑,得到各樣品浸膏。真空冷凍干燥,研碎稱重,使用前用色譜甲醇溶解并定容至0.06g/mL(按藥材計)。

        2.3 對照品溶液的制備 精密成定鉤吻堿甲(Gelsemine)、鉤吻素子(Koumine)、鉤吻素己(Gelsenicine)、胡蔓藤堿乙(Humantenine),加入甲醇制備成分別含80.00、51.25、65.15、42.32μg/mL的對照品溶液。采用外標一點法對樣品中個生物堿成分的含量進行測定。

        2.4 色譜條件 色譜柱: 依利特Sino Chrome ODS-BP (4.6 mm ×250 mm,5μm) ;流動相:乙腈-0.3%磷酸+0.5%三乙胺水溶液;梯度洗脫: 0~40 min,乙腈10%~20%;40~80 min,乙腈20%~40%;80~85 min,乙腈40%~50%;85~90 min,乙腈50%~80%;90~95 min,乙腈80%~10%;95~100 min,乙腈10%~10%;體積流量:1 mL /min;柱溫:40℃;檢測波長:254 nm;進樣量20 μL。

        3 結果與討論

        3.1 高壓蒸汽滅菌對鉤吻生物堿的影響 鉤吻的生物堿主要為吲哚型生物堿。在實驗條件下,考察的四個鉤吻生物堿分離度良好,基線穩(wěn)定。如下圖1所示。鉤吻經(jīng)121℃,0.2MPa、20min高壓蒸汽滅菌后生物類化學成分顯著降低,尤其是鉤吻素己降低了89%,色譜峰幾乎消失。鉤吻堿甲,鉤吻素己,胡蔓藤堿乙分別降低了4.5%、2.6%,20%。提示高溫高壓蒸汽滅菌對鉤吻素己的破壞性極大,結果見圖2。

        3.2 不同滅菌溫度對鉤吻堿甲的影響 考察低溫間歇滅菌對生物堿的影響,在所考察的四中生物堿中,鉤吻堿甲在60、70、80、90℃溫度條件下,含量均未發(fā)生明顯變化,即使經(jīng)過高壓蒸汽滅菌含量也僅降低了4.5%,提示鉤吻堿甲的熱穩(wěn)定性良好。結果見圖3。

        3.3 不同滅菌溫度對鉤吻素子、胡蔓藤堿乙的影響 鉤吻素子在低溫條件下含量變化較小,而在90℃滅菌第2次至第4次時,含量降低較明顯,分別降低了15.4%、15.4%、17.4%,但三次滅菌之間并未見進一步降低。所考察的四種生物堿中,胡蔓藤堿乙的穩(wěn)定性僅次于胡蔓藤堿甲。但在90℃第2~4次滅菌,含量分別降低12.7%、12.7%、11.9%,見圖4a、4b。提示90℃滅菌2次起,對鉤吻素子、胡蔓藤堿乙有一定的破壞性。3.4 不同滅菌溫度對鉤吻素己的影響 鉤吻素己顯示出了對濕熱極不穩(wěn)定,在各種滅菌條件下僅60~70℃略微降低,80℃起,含量分別下降了29.3%、28.2%、26.4%、32.8%,90℃條件下,含量分別降低了32.8%、48.3%、55.2%、56.9%;在高壓滅菌121℃時,鉤吻素己幾乎完全被破壞,高達89%,實驗結果顯示鉤吻素己熱不穩(wěn)定。實驗結果如圖5所示。實驗亦發(fā)現(xiàn),當溫度到達80℃起,鉤吻素己原本尖銳的單峰,裂解為2個較低并且不完全分離的色譜峰,提示化學結構的變化引起了極性變化。

        4 結論

        鉤吻生物堿受濕熱溫度影響較大,其中鉤吻素己最顯著,80℃間歇滅菌4次是權衡對鉤吻堿甲、鉤吻素子、胡蔓藤堿乙、鉤吻素己的破壞性最低并保證對鉤吻滅菌較徹底的滅菌方法。

        [1]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編(下冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出社,1983:118-121.

        [2]黃慶彰,黃明. 胡蔓藤屬植物、成分及毒理作用[J]. 廣西衛(wèi)生,1980,3:32-35.

        [3]陳毅勝.中國有毒植物[M]. 北京:科學出版社,1990 :371-376.

        [4]Gao Ming-Ya, Shen Wei-Zai, Wu Yan-Hui, et al. Study on anti-proliferation activity and the mechanisms of alkaloid monomers from Gelsemiumelegans on HepG2 cell in vitro [J]. Journal of ChinBese medicinal materials, 2012, 35(3):438-42.

        [5]Xu YK, Liao SG, Na Z, et al. Gelsemium alkaloids, immunosuppressive agents from Gelsemium elegans[J]. Fitoterapia,2012, 83(6):1120-1124.

        [6]Liu M,Huang H H,Yang J,et a1.The active alkaloids of Gelsemium elegans Benth are potent anxiolytics[J].Psychopharmacology (Ber1),2013,225(4):839-851.

        [7]吳水生,邱頌平,王英豪,等.不同炮制與配伍法減緩鉤吻毒性及其機制的實驗研究[C].//第五屆全國臨床中藥學學術研討會論文集,武漢,2012.

        [8]莊毅.藥用真菌新型(雙向型)固體發(fā)酵工程[J].中國食用菌,2002,21(4):3-6.

        Determination of Gelsemium Alkaloids and Its Dynamic Changes in Different Damp-heat Condition

        HUANG Meixia1HONG Huaishan2LIAO Huajun1WANG Yinghao1LI Desen1WU Shuisheng1*

        1. School of Pharmacy,F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine,F(xiàn)uzhou 350122,China; 2. Fujian Provincial Hospital /Fujian Provincial Jinshan Hospital,F(xiàn)uzhou 350028,China

        Objective To observe the dynamic changes of 4 Gelsemium Alkaloids before and after different damp-heat conditions. Methods Gelsemium elegans was Sterilization in high pressure exterminating and 4 kinds of low-temperature fractional sterilization. HPLC was used to determine the different changes of gelsemine, koumine, gelsenicine and humantenine before and after Sterilization. Results Contents of the four Gelsemium Alkaloids had no obvious change before and after 3 times of 60℃ or 70℃ sterilization, the content of gelsemine had no significantly change before and after all kinds of sterilization conditions. In the 4 times of 80℃ fractional sterilization, gelsenicine decreased 29.3%,28.2%,26.4%,32.8% respectively; And it had decreased 32.8%,48.3%,55.2%,56.9% in the 4 times of 90℃ fractional sterilization. Koumine had decreased 32.8%,48.3%,55.2%,56.9% while humantenine decreased 1.3%,12.7%,12.7%,11.9% in the 4 times of 90℃ fractional sterilization. All 4 alkaloids had decreased varying degrees in the high pressure exterminating of 121℃×20min. Conclusion Gelsemium Alkaloids were heat unstable, gelsenicine was especially heat sensitive, 4 times of 80℃ fractional sterilization can afford a kind of Sterilization that make the lowest damage of Gelsemium Alkaloids.

        Gelsemium elegans; Sterilization temperature; Gelsemium Alkaloids; Content; HPLC

        福建省科技廳項目(2015J01329);教育部高等學校博士學科點專項科研基金聯(lián)合資助課題(20133519 110005);2016年福州市食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目。

        黃美霞(1982-),女,漢族,碩士,講師,研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎與藥理活性研究。E-mail:67657674@qq.com

        吳水生(1965-),男,漢族,博士,教授,博士生導師,研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎與作用機制研究。E-mail:498366498@qq.com

        【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517(2017)09-0008-04

        2017-02-24 編輯:陶希睿)

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