閆 爽 高孟婷 鄭園園 郭娜娜 陳俊雅 耿 玲 肖 懷,3,4 李 玥,3,4*

1.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000； 2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000; 3.中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000； 4.藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000

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美洲大蠊、斑蝥提取物對(duì)3株人腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究

閆 爽1,2高孟婷1,2鄭園園1,2郭娜娜1,2陳俊雅2耿 玲2肖 懷1,2,3,4李 玥1,2,3,4*

1.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000； 2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000; 3.中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類(lèi)資源開(kāi)發(fā)利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000； 4.藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000

目的：研究從昆蟲(chóng)美洲大蠊和斑蝥中提取的3個(gè)活性部位YS-I、YS-II、YS-III對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109和人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用。方法：將從昆蟲(chóng)美洲大蠊、斑蝥中提取的3個(gè)活性部位分別作用于MGC-803、Eca-109、HepG2細(xì)胞株，采用MTT法檢測(cè)受試物作用24、48、72小時(shí)后細(xì)胞增殖抑制情況，計(jì)算IC50值，并研究其量效、時(shí)效關(guān)系。結(jié)果：3個(gè)由昆蟲(chóng)中提取的活性部位對(duì)人源MGC-803、Eca-109、HepG2腫瘤細(xì)胞株均有一定的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)較好的時(shí)間依賴(lài)和劑量依賴(lài)關(guān)系。結(jié)論：美洲大蠊提取物YS-I及斑蝥不同極性提取物YS-II、YS-III對(duì)人胃癌、食管癌、肝癌細(xì)胞具有較好的增殖抑制作用，為今后進(jìn)一步研發(fā)昆蟲(chóng)源低毒、高效的抗腫瘤藥物奠定了一定基礎(chǔ)。

昆蟲(chóng)；美洲大蠊；斑蝥；增殖抑制；抗腫瘤

惡性腫瘤對(duì)人類(lèi)生命健康危害極大，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2014年世界癌癥報(bào)告》提及未來(lái)20年每年新發(fā)癌癥病例將達(dá)到2200萬(wàn)，同期癌癥死亡數(shù)將上升至1300萬(wàn)例[1]。據(jù)全國(guó)腫瘤登記中心報(bào)道，2015年中國(guó)有429.2萬(wàn)例癌癥新發(fā)病例，281.4萬(wàn)例死亡病例，其中肺癌、胃癌、食管癌和肝癌居于前列[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)腫瘤的治療方式主要是手術(shù)、藥物及放射治療等。癌癥中、晚期，化療和放療為主要的治療手段，但化療和放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，對(duì)正常細(xì)胞也有一定影響，使患者承受著身體和精神上的巨大痛苦[3]。

動(dòng)物源類(lèi)中藥資源豐富，在我國(guó)疾病治療中的應(yīng)用有著悠久的歷史。近年研究發(fā)現(xiàn)多種藥用動(dòng)物中提取的活性成分在體外或體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞、荷瘤小鼠腫瘤具有一定的抑制作用[4-6]，且副作用小、相對(duì)安全，提示天然動(dòng)物源抗癌藥物具有較好的開(kāi)發(fā)前景。藥用斑蝥多為芫菁科昆蟲(chóng)南方大斑蝥(MylabrisphalerataPallas)或黃黑小斑蝥 (MylabriscichoriiLinnaeus)的干燥體，臨床研究表明，斑蝥提取物在治療尖銳濕疣、斑禿、風(fēng)濕、肝炎等疑難雜癥時(shí)效果明顯，近年來(lái)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示斑蝥素及其衍生物對(duì)喉癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞有顯著療效[7-9]。美洲大蠊(Periplanetaamericana)，俗稱(chēng)“蟑螂”，屬昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬，現(xiàn)代藥理學(xué)及臨床研究顯示其具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、增強(qiáng)肌體免疫力等作用[10-12]，大理大學(xué)藥化學(xué)院工作者致力于藥用昆蟲(chóng)研發(fā)近30年，何正春等[13-15]將美洲大蠊醇提取物通過(guò)聚酰胺柱層析分離劃段得到不同部位，采用MTT法檢測(cè)所得部位對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖毒性，結(jié)果表明美洲大蠊提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性且毒副作用較小，這些研究為開(kāi)發(fā)低毒、高效的動(dòng)物類(lèi)抗腫瘤藥物打下一定基礎(chǔ)。

基于團(tuán)隊(duì)前期的研究基礎(chǔ)，筆者對(duì)大量昆蟲(chóng)來(lái)源的提取物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性篩選，對(duì)于活性明顯的樣品，再次進(jìn)行復(fù)篩及量效、時(shí)效考察。現(xiàn)將來(lái)源于美洲大蠊及斑蝥的3個(gè)活性樣品對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC-803、人食管癌細(xì)胞Eca-109、和人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)抑制活性及其量效、時(shí)效關(guān)系報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 受試樣品 美洲大蠊提取物活性部位(YS-I)、斑蝥提取物活性部位(YS-II、YS-III)由大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院制備提供。其中YS-I由美洲大蠊乙醇提取物經(jīng)聚酰胺柱分離，40%乙醇/水部分濃縮、冷凍干燥獲得[16]；YS-II為干燥斑蝥蟲(chóng)體粉末用等極性溶劑提取濃縮物，YS-III為干燥斑蝥蟲(chóng)體粉末用低極性溶劑提取濃縮物；具體制備方法因涉保密內(nèi)容暫不公開(kāi)。

1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；0.25 %胰蛋白酶-EDTA消化液(密理博公司)；噻唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；青霉素、硫酸鏈霉素(Amersco，美國(guó))；順鉑(DDP,齊魯制藥有限公司)。

1.3 主要儀器 SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；3111型水套式CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；CKX41SF型倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；SN255939型酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國(guó))；XK96-3微量振蕩器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；BSA124S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器(上海東亞壓力容器制造有限公司)。

1.4 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株(MGC-803)、人食管癌細(xì)胞株(Eca-109)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理 MTT法是一種快速、簡(jiǎn)便的體外抗腫瘤藥物敏感性測(cè)試方法，目前已被廣泛用于抗腫瘤藥物體外活性篩選實(shí)驗(yàn)。它是利用活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶可將黃色的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide ](噻唑藍(lán)，MTT)還原為藍(lán)紫色的甲臜(Formazan)，甲臜不溶于水，可溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm處的光密度(Optical Delnsity，OD)值可推測(cè)活細(xì)胞數(shù)目，了解受試樣品對(duì)細(xì)胞增殖的作用效果。

2.2 受試樣品溶液及陽(yáng)性對(duì)照品溶液的配制 樣品溶液配制：稱(chēng)取一定量活性樣品凍干粉或浸膏，用少量DMSO溶解配制成100mg/mL的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液將濃度分別稀釋為300、100、50、30、10、3μg/mL。陽(yáng)性對(duì)照品溶液配制：稱(chēng)取一定量DDP凍干粉，配制成10mg/mL的儲(chǔ)備液，于4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液將濃度分別稀釋為5、0.5、0.05μg/mL。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞株在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，約每2～3日傳代1次。MGC-803、Eca-109細(xì)胞株均在含有10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，約每2～4天傳代1次。

2.4 細(xì)胞毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、MGC-803、Eca-109細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×105/mL的懸液，接種于96孔板，每孔100μL，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔分別加入受試樣品溶液100μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(DDP)、陰性對(duì)照(等量不含藥物的培養(yǎng)液)和空白對(duì)照(只有等量培養(yǎng)基、沒(méi)有細(xì)胞)，以上于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，棄去上清液，每孔加入20μL，5mg/mL的MTT溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，然后每孔加入150μL的DMSO，于微量振蕩器上振蕩至甲臜完全溶解，在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 按以下公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率(%)：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(OD陰性— OD樣品)/(OD陰性 — OD空白)×100%；以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)繪制量效曲線，并分別用SPSS17.0的Logistic回歸模型計(jì)算不同作用時(shí)間后的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3 結(jié)果

3.1 樣品對(duì)所選腫瘤細(xì)胞的增殖影響效果 3個(gè)活性樣品YS-I、YS-II、YS-III及陽(yáng)性藥DDP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2的IC50值，詳見(jiàn)表1。

表1 樣品YS-I、II、III及DDP對(duì)三株人腫瘤細(xì)胞的IC50值 /μg/mL

3.2 樣品對(duì)所選細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)效、量效關(guān)系分析 3個(gè)活性樣品YS-I、YS-II、YS-III及陽(yáng)性藥DDP對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用的時(shí)效、量效關(guān)系分析結(jié)果見(jiàn)圖1、2、3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示3個(gè)昆蟲(chóng)類(lèi)活性樣品YS-I、YS-II、YS-III對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人食管癌細(xì)胞株Eca-109、人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均具有一定的抑制作用；通過(guò)量效和時(shí)效關(guān)系分析表明，3個(gè)樣品對(duì)所選三株細(xì)胞的增殖抑制存在一定的劑量和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。其中YS-I對(duì)MGC-803細(xì)胞株在處理24h、48h、72h的IC50值分別為10.07、9.73、6.47μg/mL，已接近陽(yáng)性藥DDP IC50值的1/2至1/3，具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用；對(duì)另兩株細(xì)胞株Eca-109和HepG2，作用72小時(shí)后的IC50值也小于20μg/mL，提示YS-I對(duì)三株人腫瘤細(xì)胞、尤其是胃癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用。

4 討論

蔣永新等[17]研究表明“康復(fù)新液”(主要成分為美洲大蠊提取物)有抑制MGC-823腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，梁剛等[18]研究表明美洲大蠊提取物有抑制人肝癌細(xì)胞Bel- 7402裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的作用。YS-I是美洲大蠊聚酰胺有效部位，對(duì)人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均具有較好抑制作用，而人胃癌細(xì)胞株MGC-803、人肝癌細(xì)胞株HepG2分別與MGC-823、Bel- 7402細(xì)胞株為同源細(xì)胞，推測(cè)YS-I抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)相關(guān)。YS-I尚為多成分混合物，故從其中純化出具有研究和開(kāi)發(fā)前景的高效抗腫瘤成分值得引起重視。YS-II、YS-III均為斑蝥的有機(jī)溶劑提取部位，在配制樣品溶液時(shí)，會(huì)有少量樣品析出，這可能會(huì)對(duì)斑蝥素抑制腫瘤細(xì)胞的效果有一定影響。本研究顯示，昆蟲(chóng)來(lái)源提取物對(duì)人腫瘤細(xì)胞確實(shí)存在明顯的抑制(或殺滅)作用，具有對(duì)其進(jìn)行深入研究的科研及臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Proliferation Inhibition of Extracts fromReriplanetaamerlcanaandMylabrison Three Human Tumor Cells

YAN Shuang1,2GAO Meng ting1,2ZHENG Yuanyuan1,2GUO Nana1,2CHEN Junya2GEN Ling2XIAO Huai1,2,3,4LI Yue1,2,3,4*

1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China; 2.College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali 671000, China; 3.Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali 671000, China; 4.National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics, Dali 671000, China

Objective To study the proliferation inhibition on MGC-803 cell、Eca-109 cell and HepG2 cell with three active extracts(YS-I, YS-II, YS-III)fromPeriplanetaamericanaandMylabris.Methods To incubate MGC-803、Eca-109 and HepG2 cell with three active extracts fromPeriplanetaamericanaandMylabrisfor24,48 and 72 hours, cell proliferation in different concentration and time was determined by MTT assay.Calculating IC50values and study its dose,time-effect relationship.Results Three active extracts frominsects have a certain proliferation inhibition on MGC-803 cell, Eca-109 cell and HepG2 cell.The inhibition effect had good time-dependent and dose-dependent.Conclusion Three active extracts fromPeriplanetaamericanaandMylabrishavea good proliferation inhibition on MGC-803, Eca-109 and HepG2 cell.Laying a foundation for further research and development of low toxicity, efficient insect anti-tumor drugs．

Insects;Periplanetaamericana;Mylabris; Proliferation Inhibition;Antitumor

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81260475)：云南民族民間藥用昆蟲(chóng)喙尾琵琶甲抗腫瘤活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究。云南省科技廳(No.2014FA007)：美洲大蠊抗腫瘤活性部位在腫瘤免疫中的作用及機(jī)制研究。

閆爽(1993-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幱行镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail:yanshuang475706755@163.com

李玥(1986-)，女，白族，碩士，研究方向?yàn)橹兴幱行镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail:liyue0208@163.com

R282.740.7

A

1007-8517(2017)10-0033-05

2017-03-22 編輯：陶希睿)