吳國泰 牛亭惠 劉五州 王瑞瓊 杜麗東，2 李廣遠(yuǎn)*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

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藏藥唐古特烏頭總生物堿的急性毒性及抗炎鎮(zhèn)痛作用

吳國泰1,2牛亭惠1劉五州1王瑞瓊1杜麗東1，2李廣遠(yuǎn)1*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

目的：研究藏藥唐古特烏頭總生物堿(TAA)的急性毒性及抗炎鎮(zhèn)痛作用。方法：采用灌胃和腹腔注射兩種給藥途徑研究TAA的急性毒性；采用二甲苯致小鼠耳腫脹、瓊脂肉芽腫兩種炎癥模型，考察TAA的抗炎作用；采用冰醋酸致小鼠扭體和熱板致痛兩種疼痛模型，觀察TAA的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果：TAA具有一定急性毒性，對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和皮下瓊脂肉芽腫兩種炎癥模型以及冰醋酸致小鼠扭體和熱板致痛兩種疼痛模型均有一定的抑制作用。結(jié)論：藏藥唐古特烏頭總生物堿具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，也具有一定的急性毒性。

唐古特烏頭；生物堿；急性毒性；抗炎鎮(zhèn)痛

藏藥唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.) Stapf為高山珍稀藥材，其性涼味苦，具有清熱解毒，生肌燥濕的功效。主要用于肝膽熱癥、肺熱肺炎、肝炎、胃腸炎、傳染病引起的發(fā)燒等，傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床使用歷史悠久，療效確切[1,2]。唐古特烏頭生長在高山草甸及碎石帶，平均海拔為4000米，主產(chǎn)于西藏西東部、青海東南部、甘肅南部、四川西北部和云南北部等地。在四川(黑水縣、紅原縣、馬爾康、金川縣)、甘肅省(天?？h、甘南州、和政縣)、青海省(循化縣、貴德縣、互助縣、貴南縣、同德縣、玉樹州)、西藏(昌都地區(qū))多呈零散分布，沒有種群優(yōu)勢(shì)，易遭到破壞。目前在四川金川、馬爾康地區(qū)有少量栽培，但是栽培狀況和種植規(guī)模等并不樂觀。唐古特烏頭收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》(第1冊(cè))，由唐古特烏頭組成復(fù)方形成的藏成藥中共有9個(gè)品種，分別為安兒寧顆粒、二十五味肺病丸、十二味翼首散、八味獐芽菜丸、大月晶丸、十一味金色丸、紅龍鎮(zhèn)痛片、十三味榜嘎散、二十五味鬼臼丸。資料顯示，藏藥甘青烏頭有小毒，具有廣泛的藥理活性，抗菌抗炎、抗病毒、抗高血壓和抗腫瘤等作用已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[3,4]。唐古特烏頭含有內(nèi)酯型二萜生物堿，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，追蹤單個(gè)生物堿成分目前存在較大困難[5]。在前期制備總生物堿的基礎(chǔ)上，研究其急性毒性和抗炎鎮(zhèn)痛作用，為明確其抗炎鎮(zhèn)痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、開發(fā)藏藥資源提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 供試藥品 醋酸潑尼松片(批號(hào)：1306041，天津天藥藥業(yè)股份有限公司)；氫溴酸高烏甲素注射液(批號(hào)：20131103，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)；泊洛沙姆(pluronic-127，批號(hào)：201412，上海源葉生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：WXBB5403V，Sigma-aldrich公司)。唐古特烏頭(青海帝瑪爾藏藥有限公司)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制教研室劉峰林博士鑒定為毛茛科烏頭屬植物唐古特烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf的全草，標(biāo)本存放于該教研室?？偵飰A(TAA)：將唐古特烏頭粉碎過20目篩，稱取500g，加15倍量(7500mL)90%乙醇在85℃條件下攪拌提取1.5h，回收乙醇，濃縮，冷凍干燥，得提取物88.25g，用氯仿精制，用酸堿滴定法測(cè)得總生物堿含量為0.3323%，即獲得293.2mg唐古特烏頭總生物堿。臨用前用終濃度為0.1%的二甲基亞砜配制乳濁液備用。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重(20±2g)，雌雄不拘，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證號(hào)SYXK(甘)2011-0001。室溫(25±0.5)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，12h燈光，12h黑暗，適應(yīng)3d開始實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 BS110Sartorius電子天平(德國Sartorius公司)；52770型冷熱痛覺測(cè)試儀(美國Stoelting公司)；KDM型可調(diào)電子控溫電熱套(成都泰盟科技有限公司)；HH.S11-2型水浴鍋(浙江科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)；DT510H型超聲波清洗器(德國Bandelin公司)。

2 方法

2.1 TAA的急性毒性試驗(yàn) 分別以1：10：100劑量比例配制乳濁液，灌胃給藥(20mL/kg體重)找出受試物的0%和100%估計(jì)致死量。另取小鼠，以受試物0%和100%估計(jì)致死量為依據(jù)，分別以1：4：16劑量比例配制乳濁液，灌胃給藥(20mL/kg體重)，測(cè)定受試物的Dmin和Dmax。根據(jù)Dmin和Dmax的值，以及計(jì)劃分組數(shù)，計(jì)算組間劑量比值(K)，以Dmin作為最低劑量組，Dmax作為最高劑量組，按K值計(jì)算出中間幾組劑量。灌胃給藥(20mL/kg體重)后觀察并詳細(xì)記錄小鼠的反應(yīng)情況以及死亡分布情況，采用LD50處理軟件計(jì)算TAA的半數(shù)致死量(LD50)和LD50的95%可信區(qū)間，采用腹腔注射給藥，同法測(cè)定腹腔注射的LD50和LD50的95%可信區(qū)間[6]。

2.2 TAA的抗炎作用

2.2.1 TAA對(duì)二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響[7-8]取小鼠50只，雄性，按體重隨機(jī)分為DMSO對(duì)照組，陽性對(duì)照組(醋酸潑尼松45mg/kg，相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，總生物堿(TAA)高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA高、中、低劑量分別用DMSO助溶(DMSO終濃度為0.1%)，配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對(duì)照組小鼠灌胃0.1%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，清潔小鼠雙耳耳面，于左耳兩面涂抹二甲苯25μL/只，右耳不涂抹作為對(duì)照，30min后，頸椎脫臼處死小鼠，用9mm打孔器取下左右耳相同部位的圓片，稱重。用下面公式計(jì)算腫脹度和抑制率。

腫脹度=左耳片重-右耳片重

抑制率=[DMSO對(duì)照組腫脹度-藥物組腫脹度]/DMSO對(duì)照組腫脹度×100%

2.2.2 TAA對(duì)小鼠皮下瓊脂肉芽腫增生的影響[7,9]取小鼠50只，雄性，按體重隨機(jī)分為DMSO對(duì)照組，陽性對(duì)照組(醋酸潑尼松45mg/kg，相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，總生物堿(TAA)高劑量組、中劑量組和低劑量組，共5組，每組10只。分別在各小鼠背部皮下注射2%瓊脂(65℃保溫融化，生理鹽水配制)0.4mL/只。TAA高、中、低劑量分別用DMSO助溶(DMSO終濃度為0.1%)，配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對(duì)照組小鼠灌胃0.1%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)7d，末次給藥60min后，頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮下瓊脂肉芽腫塊，稱濕重。用下面公式計(jì)算抑制率。

抑制率=(DMSO對(duì)照組肉芽腫重量-藥物組肉芽腫重量)/DMSO對(duì)照組肉芽腫重量×100%

2.3 TAA的鎮(zhèn)痛作用

2.3.1 TAA對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的影響[10]取小鼠50只，雌雄兼用，按性別體重隨機(jī)分為DMSO對(duì)照組，陽性對(duì)照組(氫溴酸高烏甲素注射液1.0mg/kg，相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，總生物堿(TAA)高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA用DMSO助溶(DMSO終濃度為0.1%)，配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對(duì)照組小鼠灌胃0.1%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，各組小鼠分別腹腔注射新鮮配制的0.6%冰醋酸0.2mL/只，觀察各小鼠的扭體反應(yīng)，記錄15min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，用下面公式計(jì)算抑制率。

抑制率=(DMSO對(duì)照組扭體次數(shù)-藥物組扭體次數(shù))/DMSO對(duì)照組扭體次數(shù)×100%

2.3.2 TAA對(duì)小鼠熱痛閾的影響[11]取小鼠50只(實(shí)驗(yàn)前篩選，熱痛反應(yīng)時(shí)間為5～30s)，雌性，按體重隨機(jī)分為DMSO對(duì)照組，陽性對(duì)照組(氫溴酸高烏甲素注射液1.0mg/kg，相當(dāng)于臨床70kg成人日用量的10倍)，總生物堿(TAA)高、中和低劑量組，共5組，每組10只。TAA用DMSO助溶(DMSO終濃度為0.1%)，配成乳濁液供試，分別灌胃100、75、50mg/kg的TAA乳濁液，DMSO對(duì)照組小鼠灌胃0.1%DMSO蒸餾水乳濁液，給藥容量均為20mL/kg，1次/d，連續(xù)3d，末次給藥60min后，用冷熱痛覺測(cè)試儀(T=(55±0.5)℃)測(cè)定熱刺激時(shí)小鼠舔后足時(shí)間，用下面公式計(jì)算抑制率。

抑制率=(藥物組舔后足時(shí)間-DMSO對(duì)照組舔后足時(shí)間)/DMSO對(duì)照組舔后足時(shí)間×100%

3 結(jié)果

3.1 TAA的急性毒性 給藥后小鼠在30min內(nèi)出現(xiàn)興奮，豎尾，不安，張口，弓背，抽搐，四肢僵直，眼球突出，大量唾液分泌等癥狀，最后抽搐死亡，大體解剖肉眼觀察，未見肺、肝、腎、腦、心臟的形態(tài)和顏色異常；生存小鼠在給藥120min后開始進(jìn)水進(jìn)食，在之后的整個(gè)觀察期內(nèi)，各小鼠活動(dòng)正常，糞便性狀正常，體重增加正常，對(duì)照組小鼠未見明顯異常。測(cè)得TAA灌胃的LD50為0.745g/kg，置信系數(shù)a=0.05時(shí)的置信區(qū)間為0.646g≤LD50≤0.860g。同法測(cè)得TAA腹腔注射的LD50為0.336g/kg，置信系數(shù)a=0.05時(shí)的置信區(qū)間為0.285g≤LD50≤0.396g。

3.2 TAA對(duì)二甲苯所致小鼠耳殼腫脹的影響 由表1、圖1結(jié)果顯示TAA高、中劑量對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹具有明顯抑制作用，TAA低劑量抑制效應(yīng)不顯著。

表1 TAA對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 ±s)

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 TAA對(duì)小鼠皮下瓊脂肉芽腫增生的影響 由表2可知，TAA高劑量對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹具有明顯的抑制效應(yīng)，TAA中、低劑量抑制效應(yīng)不顯著。

表2 TAA對(duì)小鼠皮下瓊脂肉芽腫增生的影響 ±s，n=10)

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 TAA對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的影響 由表3可知，TAA高、中劑量組小鼠15min內(nèi)的扭體次數(shù)明顯減少，TAA低劑量組扭體次數(shù)減少得不明顯。

表3 TAA對(duì)冰醋酸致小鼠疼痛的影響

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 TAA對(duì)小鼠熱痛閾的影響 由表4可知，TAA高劑量組小鼠熱痛閾明顯增高，TAA中劑量和低劑量組痛閾增高不明顯。

表4 TAA對(duì)小鼠熱痛閾的影響

注：與DMSO對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

烏頭屬植物在我國分布約有200種，其中70多種可作為藥用[12]，該屬藥用植物大部分以塊根或根入藥，大多數(shù)具有溫經(jīng)止痛和祛風(fēng)除濕的功效，其主要有效組分為生物堿類化合物[13]。唐古特烏頭是烏頭屬藥用植物的經(jīng)典代表，是傳統(tǒng)藏醫(yī)臨床常用藥物之一，臨床使用歷史悠久，療效確切，具有比較雄厚的臨床基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)記載唐古特烏頭有小毒，臨床使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制用量[4,13]。前期研究表明，烏頭中的雙酯型生物堿的毒性是非常嚴(yán)重的，尤其是烏頭堿，而單酯型烏頭堿的毒性是烏頭堿的1/200～1/500，并具有相同的抗炎，抗高血壓活性[3,5]。本研究證實(shí)TAA經(jīng)灌胃和腹腔注射對(duì)小鼠均具有一定的急性毒性，初步推測(cè)中毒靶器官為植物神經(jīng)系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)，中毒較快，持續(xù)時(shí)間較短。另外，甘青烏頭中含有苯甲酰異葉烏頭堿、異葉烏頭堿和阿替辛、大麥芽堿benzoylheteratisine、tangutimine，hetisinone，talatizamine，atisine，hordeine[14]。在唐古特烏頭也分離得到異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、唐烏堿等[15]，其生物堿為有效的抗炎物質(zhì)，能顯著降低RA模型大鼠血清COX-2、IL-1、TNF-α和PGE2的含量[16]。

二甲苯致小鼠耳殼腫脹是經(jīng)典的非特異性急性炎癥模型，是篩選抗炎作用的經(jīng)典方法之一，本研究結(jié)果顯示TAA對(duì)耳殼腫脹具有一定的抑制作用，能迅速控制急性炎癥反應(yīng)；皮下棉球肉芽腫是經(jīng)典的非特異性慢性炎癥模型，本研究結(jié)果顯示TAA對(duì)慢性增生性炎癥反應(yīng)也具有抑制作用，由此推斷TAA的抗炎作用是明確的，非特異性的。冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)是經(jīng)典的化學(xué)損傷致痛模型，能有效反應(yīng)受試物通過抗炎而減輕疼痛反應(yīng)，本研究證實(shí)TAA能減少小鼠扭體次數(shù)，初步推斷TAA在抗炎的同時(shí)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。物理損傷也是導(dǎo)致機(jī)體疼痛的主要原因，熱板法模擬燙傷導(dǎo)致的機(jī)體痛反應(yīng)，是鎮(zhèn)痛藥有效性篩選的經(jīng)典方法，本研究顯示TAA能提高熱刺激時(shí)的痛閾值，可以推斷具有中樞性鎮(zhèn)痛作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

目前，對(duì)唐古特烏頭的系統(tǒng)研究較少，在其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分、藥理毒理作用及機(jī)制、質(zhì)量評(píng)價(jià)方法和制劑質(zhì)量控制的研究不足，鑒于唐古特烏頭在藏藥中的應(yīng)用廣泛而且極為重要，調(diào)查發(fā)現(xiàn)其資源蘊(yùn)藏量大，因此，今后對(duì)甘青烏頭進(jìn)行細(xì)致深入的系統(tǒng)性研究，為有效合理地開發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

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Acute Toxicityand Anti-inflammatoryor Analgesic Effects of Total Alkaloids of Aconitum Tanguticum in Mice

WU Guotai1, 2NIU Tinghui1 LIU Wuzhou1WANG Ruiqiong1DU Lidong1, 2LI Guang yuan1*

1.Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2.Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine in Gansu province, Lanzhou 730000, China

Objective To study the acute toxicityand anti-inflammatoryor analgesic effectsoftotal alkaloids ofAconitumtanguticum(Maxim)stapf(TAA) through experiments.Methods Acute toxicity of TAA were measured by using oral and intraperitoneal injection of routes of administration.The anti-inflammatory effects of TAA were observed by using the test of mouse ear swelling induced by xylene and the weight of placing agar into subcutaneous of mouse to induce granuloma.The analgesic effects of TAA were observed by using the test of mouse twister induced by glacial acetic acid and the test of ache induced by hot were set up.Results TAA have inhibitory effect to both of the inflammatory models and ache models.TAA has some acute toxicity.Conclusion TAA had anti-inflammatory and analgesic effects，andacute toxicity was appreciated.

Aconitumtanguticum(Maxim)stapf; Alkaloids;Acute Toxicity; Anti-inflammatory and Analgesic Effect

西藏自治區(qū)重大專項(xiàng)(No.2013KJGX01-30)，甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(No.ZDSYS-KJ-2012-004)。

吳國泰(1978-) ，男，漢族，博士，副教授，研究方向?yàn)橹胁厮幩幚砼c毒理及新藥開發(fā)。E-mali:wgt@gszy.edu.cn

李廣遠(yuǎn)(1973-) ，男，漢族，副教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)基礎(chǔ)理論和民族藥物。E-mali:lgy@gszy.edu.cn

R29

A

1007-8517(2017)10-0028-05

2017-03-14 編輯：陶希睿)