燕 霞 何頌華 謝培德

廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

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HPLC-CAD法測定女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量

燕 霞 何頌華 謝培德

廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021

目的：建立高效液相-電霧式檢測器(HPLC-CAD)方法測定女貞子藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為AcclaimTM120 C18；流動相為乙腈-50mmol/L醋酸銨(70:30)；流速為1.0mL /min；柱溫為35℃；電霧式檢測器，霧化溫度35℃，采集頻率10Hz。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.3210～6.420、0.1009～2.018μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD<2%；加樣回收率分別為100.21%～104.74%、96.26%～103.38%，RSD分別為1.78%、2.55%(n=6)。結(jié)論：該方法操作簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于女貞子中齊墩果酸和熊果酸含量的測定。

女貞子；齊墩果酸；熊果酸；HPLC-CAD；含量測定

女貞子系木犀科(Oleaceae)植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的果實，具有補腎滋陰、養(yǎng)肝明目的功效，臨床用于肝腎不足、頭暈耳鳴、頭發(fā)早白及兩目昏糊等病癥。研究表明女貞子中主要含有三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類、黃酮類、多糖類等化合物，具有抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抗血栓形成、抗衰老及抗疲勞的作用[1]，能調(diào)節(jié)免疫，提高腫瘤患者的免疫功能[2]，是目前抗衰老、抗腫瘤方劑中的主要藥物之一，其中三萜類化合物齊墩果酸與熊果酸是具有抗變異活性的主要成分。2015版《中國藥典》一部收載了女貞子以特女貞苷做為含量測定指標，并未對齊墩果酸和熊果酸進行定量控制。經(jīng)查閱文獻[3-5]，研究者多用TLC和HPLC- ELSD法對齊墩果酸和熊果酸進行定量測定。本文采用HPLC-CAD方法同時測定女貞子藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量，建立了一種準確、快速、高效的含量測定方法，對女貞子藥材及女貞子制劑的質(zhì)量標準的制定具有參考價值，對其類似化合物的測定提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Dionex Ultimate 3000 系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司)；DGP-3600RS雙三元液相色譜泵；WPS-3000自動進樣器；TCC-3x00(RS)柱溫箱；Corona Veo RS 檢測器 Chromeleon Chromatography Data System 7.2 SR4 色譜軟件；Sartorius BP211D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-600VDB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-100型中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；Milli-Q型超純水制備儀(美國Millipore公司)。

1.2 材料 齊墩果酸(批號：110709-200304)、熊果酸(批號：110742-200516)對照品中國食品藥品檢定研究院；女貞子(批號：160203，廣西桂林三金藥業(yè)有限公司；批號：16071201，廣西康全藥業(yè)；批號：151001，廣西一心藥業(yè)；批號：20150901，廣西南寧朝陽大藥房)經(jīng)廣西食品藥品檢驗所中藥室謝培德主任鑒定均為木犀科植物女貞子LigustrumlucidumAit .的干燥成熟果實；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：AcclaimTM120C18柱(4.6mm×250mm, 5μm) ；流動相：乙腈-50mmol/L醋酸銨(70∶30)；流速：1.0mL /min；檢測器為電噴霧檢測器，霧化溫度為35℃；載氣：N2，壓力63.5psi；柱溫：35℃。進樣量：混合對照品：5、15μL，供試品：10μL。在此條件下，齊墩果酸與熊果酸峰完全達到基線分離(R>1.5)，理論板數(shù)以齊墩果酸峰計在10000以上。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取齊墩果酸和熊果酸對照品適量，分別置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得齊墩果酸和熊果酸對照品貯備液。分別精密量取上述貯備液適量，置于同一10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含齊墩果酸0.3210mg，熊果酸0.1009mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末(過40目篩)1.0g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率：320W，頻率：40KHz)處理30min，取出放冷后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[6]。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液1、5、7、10、15、20μL進樣，測定峰面積。以進樣量對數(shù)(X)為橫坐標，對照品峰面積對數(shù)值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果得齊墩果酸回歸方程為：Y=0.8898X+0.8262(r=0.9997)、熊果酸回歸方程為：Y=0.8194X+0.8884(r=0.9999)。結(jié)果表明齊墩果酸在進樣量為0.3210～6.420μg時，進樣量與齊墩果酸峰面積的線性關(guān)系良好；熊果酸在進樣量為0.1009～2.018μg時，進樣量與熊果酸峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗 取同一供試品溶液(批號：160203)適量，按“2.1”項下色譜條件，精密吸取10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.31%、0.78%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品(批號：160203)粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品供試品溶液，分別于放置0、2、6、8、10、14、20、24h時按“2.1”項下色譜條件進樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.05%、1.25%(n=8)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取樣品(批號：160203)粉末適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果齊墩果酸含量平均值為8.046mg/g，RSD為1.91%(n=6)，熊果酸含量平均值為3.288mg/g，RSD為1.54%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率測定

2.7.1 混合對照品貯備液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品40.65mg，熊果酸對照品15.71mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對照品貯備液。

2.7.2 回收率的測定 取已知含量的樣品(批號：160203)粉末適量，平行稱取6份，每份0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品貯備液25mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.8 樣品測定 取4批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算齊墩果酸和熊果酸含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 (n=4)

3 討論

電噴霧式檢測器(CAD)作為一款質(zhì)量敏感型檢測器，其響應(yīng)值只與進樣質(zhì)量有關(guān)，不依賴于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，可檢測所有非揮發(fā)性化合物和部分半揮發(fā)性化合物。檢測范圍寬，靈敏度高，重現(xiàn)性好，是紫外和質(zhì)譜檢測器的有力補充。

實驗還比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-50mmol/L醋酸銨不同的洗脫系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-50mmol/L醋酸銨系統(tǒng)基線噪音最大，為乙腈-0.1%甲酸系統(tǒng)的3倍，乙腈-水系統(tǒng)的15倍，但乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水系統(tǒng)齊墩果酸與熊果酸峰分離不好，故選用乙腈-50mmol/L醋酸銨系統(tǒng)。

綜上所述，本研究建立了以 HPLC-CAD法同時測定女貞子中齊墩果酸與熊果酸的檢測方法， 結(jié)果表明該方法簡單易行，定量準確，可用于女貞子中齊墩果酸與熊果酸的定量分析，同時也為含女貞子藥材的制劑的質(zhì)量研究提供了參考方法。

[1]孫燕.扶正中藥黃芪、女貞子水提劑促進免疫功能的實驗研究[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,1983, 3(4) :211.

[2]秦紅霖，高月.女貞子化學(xué)成分及藥理研究進展[J].中草藥，2007,18(1) :84.

[3]李芳美，祝晨蔯.女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量測定[J].今日藥學(xué)，2009,19(4):37.

[4]胡魁偉，李曼玲.女貞子炮制工藝及質(zhì)量標準的研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院, 2006.

[5]盧桂英，孫賀略，楊雪瀅，等.正交試驗優(yōu)化HPLC測定齊墩果酸與熊果酸的色譜條件[J].云南民族大學(xué)學(xué)報,2012,21( 4):239-242.

[6]石心紅,郭江寧,翟靜華.HPLC法測定女貞子中齊墩果酸、熊果酸的含量[J].海峽藥學(xué),2005,17(4):41-43.

Content Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait.by HPLC-CAD

YAN Xia HE Songhua XIE Peide

Guangxi Institute for Food ang Drug Control,Nanning 530021，China

Objective To establish an HPLC-CAD method for the determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait.Methods HPLC was performed on the column of AcclaimTM120C18 with mobile phase of acetonitrile-50mmol/L Ammonium acetate solution(70:30)，at flow rate of 1mL/min，the column temperature was 35℃; CAD:nebulization temperature was 35℃ and collection frequency was 10Hz.Results The linear range was 0.321 0-6.420μg(r=0.999 7)for Oleanolic Acid and 0.100 9-2.018μg(r=0.9999)for Ursolic Acid;RSDsof precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 100.21%～104.74%(RSD=1.78%，n=6)and 96.26%～103.38%(RSD=2.55%，n=6),respectively.Conclusion The method is simple，stable and reproducible，and can be used for the content determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait.

LigustriLucidiFructus.；Oleanolic Acid；Ursolic Acid；HPLC-CAD；Content Determination

燕霞(1990-)，女，漢族，本科，藥師，研究方向為藥品質(zhì)量分析與控制。E-mail:357833410@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2017)10-0012-03

2017-03-21 編輯：陶希睿)