馮佳佳，吳倩倩，王保強，孫銘艷，陶元勇

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產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的鑒定及微生物學性狀研究

馮佳佳1，吳倩倩1，王保強2，孫銘艷2，陶元勇2

目的 對臨床分離于皮脂腺囊腫標本中的菌株進行表型和基因型鑒定，描述該菌株的生物學特性及致病性，為臨床診斷提供準確地病原學依據(jù)。方法 對分離菌株進行革蘭氏染色等，并使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀進行鑒定。采用K-B法進行藥敏試驗。提取分離菌株DNA，采用通用引物對16S rRNA基因進行PCR擴增并測序，將測序結(jié)果與GenBank中收錄的16S rRNA基因序列進行BLAST同源性對比。結(jié)果 分離菌株經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定為玫瑰色庫克菌，后經(jīng)16S rRNA序列測定方法鑒定，分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。藥敏試驗顯示該菌株對四環(huán)素、萬古霉素、利福平敏感，對青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、頭孢吡肟、亞胺培南、慶大霉素等均耐藥。結(jié)論 對于表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準確的細菌，采用16S rRNA序列測定的方法進行鑒定是最準確的。產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是引起患者疾病的致病菌。在完善產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌生化反應信息的同時，探索出有效可行的生物學鑒定方法。

產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌；生物學特性；16S rRNA

棒狀桿菌屬是革蘭氏染色陽性桿菌，因其一端或兩端呈棒狀膨大而得名。棒狀桿菌屬有103個種和亞種，其中白喉棒狀桿菌、假白喉棒狀桿菌等40余種與人類致病性有關。產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是棒狀桿菌屬的新種，由Tong J等在2006年從美國一所醫(yī)學研究中心采集的一例腹股溝膿腫標本中分離，并根據(jù)其表型特點于2010年正式將其命名為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌[1]。仝佳等認為該菌極有可能為非致病菌[2]。但本研究將皮脂腺囊腫患者的膿液標本進行培養(yǎng)，僅分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌單一菌株。本研究旨在通過表型和基因型鑒定更具體的描述該菌的生物學特性，為臨床實驗診斷提供病原學鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病歷資料 患者，女性，38歲，因“發(fā)現(xiàn)胸骨旁皮膚腫物約1周”來我院就診。患者發(fā)病后，出現(xiàn)腫物進行性腫大，可觸及波動感，疼痛明顯，體溫無明顯增高，診斷為“皮脂腺囊腫”收治入院。后于我院行“膿腫切開引流術”，引流膿液進行細菌培養(yǎng)+鑒定+藥敏試驗。臨床根據(jù)藥敏結(jié)果選用利福平、多西環(huán)素等抗感染治療9 d，患者感染得到有效控制，病情好轉(zhuǎn)出院。

1.1.2 主要儀器與試劑 2720 thermal cycler PCR儀為美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；DYCP-31DN DNA電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；FR980凝膠成像儀為上海復日科技儀器有限公司產(chǎn)品；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，Sanprep DNA柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；Taq酶，dNTPs,SM0337 DNA Ladder Marker為上海生工生物工程股份有限公司；瓊脂糖凝膠為加拿大BBI公司產(chǎn)品。Tween80購自國藥集團化學試劑有限公司。16SrRNA序列通用引物:

27F:AGTTTGATCMTGGCTCAG

1429R:GGTTACCTTGTTACGACTT

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗方法 將患者引流膿液標本接種于哥倫比亞血瓊脂平板，經(jīng)35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取菌落及標本涂片經(jīng)革蘭染色后鏡檢。使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)GPI卡上機鑒定，并根據(jù)儀器SOP文件進行操作。使用微量生化反應管，補做部分生化反應。藥敏試驗采用K-B法。

1.3 需脂培養(yǎng)實驗 分別接種分離菌株于普通肉湯培養(yǎng)基和加有1% Tween 80的肉湯中，培養(yǎng)于37 ℃，72 h，觀察細菌生長情況[3]。

1.4 16S rRNA基因測序分析

1.4.1 細菌基因組DNA的提取 取分離株接種于肉湯培養(yǎng)液孵育過夜，加入1.5 mL離心管中，室溫8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體。使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行提取。

1.4.2 PCR擴增基因序列 反應體系(25 μL):基因組DNA 0.5 μL(20～50 ng/μL),10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL， Taq酶0.2 μL,通用引物F(10 μmol/L)0.5 μL，R(10 μmol/L) 0.5 μL，加ddH2O至25 μL，混勻，稍離心，加1滴礦物油。94℃預變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30輪循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA、20 min)，EB染色，采用自動凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.3 PCR產(chǎn)物回收及測序 采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對16S rRNA PCR產(chǎn)物進行純化回收，由上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.4.4 序列同源性比對 將16S rRNA基因片段導入美國NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件，進行BLAST序列對比，獲取與該16S rRNA基因序列同源的序列和對應的細菌名稱。

2 結(jié) 果

2.1 細菌培養(yǎng)與鑒定 分離培養(yǎng)48 h后，在血平板上可見圓形，光滑，中央隆起，透明的小菌落(圖1)。標本及菌落涂片經(jīng)革蘭染色后可見革蘭氏陽性桿菌，棒狀(圖2)。使用VITEK 2 Compact 鑒定，GPI卡鑒定結(jié)果為玫瑰色庫克菌，鑒定值為89%，生化反應編碼為000064100000000。生化反應如下：脲酶(-)，β-葡糖醛酸糖苷酶(+)，β-半乳糖苷酶(-)α-糖苷酶(-)，β-糖苷酶(-)，N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(-)，葡萄糖(-)，核糖(-)，木糖(-)，蔗糖(-)，麥芽糖(-)，甘露醇(-)。后參考《實用臨床微生物學檢驗與圖譜》補做：觸酶(+)，硝酸鹽還原試驗(+)，CAMP試驗(+)，動力(-)，七葉苷水解試驗(-)，O/F 試驗為F。親脂性培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，分離菌株可生長于添加有1% Tween 80的肉湯中，在單純?nèi)鉁囵B(yǎng)基中培養(yǎng)3 d仍無細菌生長，這說明該分離菌株具有親脂性。由于玫瑰色庫克菌為革蘭氏陽性球菌，其鏡下特點與分離菌株明顯不符，故后續(xù)進行16S rRNA檢測來鑒定該菌株。

圖1 菌株分離培養(yǎng)48 h后Fig.1 Isolated strains after 48 h of incubation

圖2 標本及菌落涂片經(jīng)革蘭氏染色后Fig.2 Specimens and colony smear after gram staining

2.2 分離株與06-17730T菌株生化反應比較 見表1。

表1 分離株與06-17730T菌株生化反應比較表
Tab.1 Biochemical reaction of the 06-17730Tstrain of description and the isolated strain

生化反應06-17730T分離菌株CAMP試驗(CAMPreaction)-+硝酸鹽還原(Reductionofnitrates)-+觸酶(Catalase)++產(chǎn)生(Productionof):β-葡糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase)++脲酶(Urease)--α-糖苷酶(α-Glucosidase)--β-糖苷酶(β-Glucosidase)--N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)--發(fā)酵(Fermentationof):核糖(D-Ribose)+-木糖(D-Xylose)+-葡萄糖(D-Glucose)+-麥芽糖(Maltose)+-蔗糖(Sucrose)+-果糖(Fructose)+未做甘露醇(D-Mannitol)--

+:positive; -:negative

2.3 藥敏試驗 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果顯示該菌株對四環(huán)素、萬古霉素、利福平敏感，對青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、頭孢吡肟、亞胺培南、慶大霉素等均耐藥。

2.4 分離菌16S rRNA基因序列分析 以提取的分離菌株DNA為模板，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，其大小約為1 400 bp(圖3)。擴增產(chǎn)物回收后測序，顯示16S rRNA基因序列為1 359 bp(圖4)。在NCBI上進行BLAST序列對比，登錄號為KF372873.1，分離菌株的1 359 bp片段序列與棒狀桿菌屬的產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌新種的16S rRNA基因序列100%一致，因此可以確定該分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。

M: DNA marker; 1: The PCR products of isolated strains.圖3 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR products electrophoresis of isolated strains 16S rRNA gene sequences

圖4 分離菌株16S r RNA基因全序列(1 359 bp)Fig.4 16S rRNA gene sequences of isolated strains(1 359 bp)

3 討 論

棒狀桿菌屬是革蘭氏染色陽性桿菌，棒狀，在自然界中分布廣泛，從致病性角度可以將其分為三類：人類致病菌，動植物致病菌，非致病性土壤源菌。目前，對人類致病棒狀桿菌以白喉棒狀桿菌為代表，其余多被報道為條件致病菌，對棒狀桿菌的研究也主要集中在白喉棒狀桿菌致病方面[4]及棒狀桿菌應用于工業(yè)生產(chǎn)方面[5-7]，而對于較為少見的條件致病性棒狀桿菌的報道相對較少[8]。因此，在臨床分離到相關致病菌株時，可能因為參考的文獻較少以及缺乏準確的鑒定手段而造成漏診。

從皮脂腺囊腫患者的膿液標本中分離得到的菌株，經(jīng)鑒定為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。在仝佳等[1]的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌細胞壁內(nèi)不含有結(jié)核硬脂酸，不產(chǎn)生白喉毒素，并且在標本中除分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌外還有其他伴隨菌株，且三者濃度相同，故認為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌極有可能為非致病性棒狀桿菌。但在本研究獲得的膿液標本中僅分離得到產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，無其他相關伴隨菌，并且臨床根據(jù)本次試驗的藥敏結(jié)果用藥后，患者感染得到有效控制，病情好轉(zhuǎn)出院。因此認為，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是引起該患者皮脂腺囊腫的致病菌，其具體致病機制有待于進一步研究。目前，僅有少數(shù)與產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌相關的研究[9-11]，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌可以引起疾病還沒有相關報道。通過本次報道引起臨床醫(yī)生重視，并為臨床疾病的診斷提供病原學依據(jù)即為本次研究的意義所在。

在本研究中，分離菌株及標本經(jīng)革蘭氏染色后見到革蘭氏陽性的棒狀桿菌，這與使用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定的玫瑰色庫克菌的結(jié)果不相符。為準確鑒定該菌株，后進行16S rRNA序列測定。16S rRNA序列測定屬于基因型鑒定，相較于常規(guī)的表型鑒定更穩(wěn)定，受環(huán)境影響較小[12-13]，并且16S rRNA序列測定重復性好，可以用于所有的病原細菌。對于表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準確的細菌，可以采用16S rRNA序列測定的方法進行準確的鑒定[14]。經(jīng)16S rRNA序列測定，該分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，屬于棒狀桿菌新種。目前，還沒有在國內(nèi)分離到該菌的相關報道，對其開展的研究也相對較少，缺乏可以準確鑒定該菌的表型鑒定方法，所以采用16S rRNA序列測定方法進行鑒定是最準確的。

為更加全面的描述該分離菌株的生物學性狀，探索出有效可行的生物學鑒定方法，在此將該菌株與Tong J等報道的06-17730T菌株的生化反應進行了比較(表1)。發(fā)現(xiàn)06-17730T菌株的觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶試驗為陽性，脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶陰性，與分離菌株結(jié)果相同；CAMP試驗、硝酸鹽還原反應試驗為陰性，發(fā)酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、核糖，而分離菌株的CAMP試驗、硝酸鹽還原反應試驗為陽性，不發(fā)酵木糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、核糖，說明雖然經(jīng)16S rRNA序列測定鑒定這兩種菌株均為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌，其部分生化反應結(jié)果并不一致，具有多樣性。但二者在觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶試驗、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶試驗的結(jié)果表現(xiàn)出的一致性說明產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的這部分生化反應相對穩(wěn)定。此外，分離菌株的需脂性培養(yǎng)試驗說明分離菌株具有親脂性，與06-17730T菌株結(jié)果相同。因此在進行生物學性狀鑒定時，若根據(jù)其菌落特點、革蘭氏染色結(jié)果判定分離菌株為革蘭氏陽性的棒狀桿菌，則可進一步根據(jù)本研究描述的觸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、脲酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶試驗這些相對穩(wěn)定的生化反應及需脂性培養(yǎng)試驗，考慮標本分離菌株為產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌。

綜上所述，產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌是導致該患者皮脂腺囊腫的主要致病菌。目前針對產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌開展的研究較少，本研究通過描述該分離菌株的生化反應，為以后的表型鑒定工作提供更加全面的鑒定依據(jù)。此外，臨床上采用全自動微生物分析儀對細菌進行鑒定，方便且易于操作，但對于臨床表現(xiàn)型不易鑒定或鑒定不準確的細菌缺乏特異性，容易造成漏診，利用16S rRNA序列測定方法進行鑒定更為可靠。目前，對產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌致病機制不是十分明確，有待于進一步的研究，可以通過進一步分析該菌的生化反應特點、生長條件、菌體成分及毒力等方面進行探究，還可以通過構(gòu)建動物疾病模型，觀察分離菌株對動物的致病性，間接探究其與人類疾病的關系，這對于臨床疾病的發(fā)生與發(fā)展，預防、診斷及治療均具有深遠意義。

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Identification and microbiological characteristics ofCorynebacteriumpyruviciproducens

FENG Jia-jia1,WU Qian-qian1,WANG Bao-qiang2,SUN Ming-yan2,TAO Yuan-yong2

(1.InstituteofNanomedicineTechnology,DepartmentofLaboratoryMedicine,WeifangMedicalUniversity/InstitutionalKeyLaboratoryofClinicalLaboratoryDiagnostics,12th5-yearProjectofShandongProvince,WeifangMedicalUniversity/KeyDisciplineofClinicalLaboratoryMedicineofShandongProvince,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China; 2.ClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China)

The phenotype and genotype of the strains isolated from the sebaceous cysts were identified,and the biological characteristics and pathogenicity of the strains were described,which provided accurate etiological evidence for clinical diagnosis. Isolated strains were Gram stained and identified with VITEK 2 compact automatic microorganism analyzer. Antimiocrobial susceptibility testing was performed by K-B method. DNA was extracted from the isolated strains. The 16S rRNA fragment was amplified by universal primers PCR and sequenced. BLAST was used to compare the homology of the sequences to the 16S rRNA gene sequence in GenBank. Results showed that the isolated strain was identified asKocuriaroseusby VITEK 2 Compact,and then identified by 16S rRNA sequencing method asCorynebacteriiumpyruviciproducens. Drug sensitive testing indicated that the isolates was sensitive to tetracycline,vancomycin,rifampin but resistant to penicillin,erythromycin,clindamycin,ciprofloxacin,levofloxacin,and compound new Ming,cefepime,imine pei south,gentamicin resistance. It is concluded that the phenotype of bacteria is not easy or inaccurate to identify; the 16S rRNA sequence is the most accurate determination method of identification. TheCorynebacteriumpyruviciproducensis a pathogenic bacterium causing the disease of the patient. At the same time,to improve the biochemical reaction information ofCorynebacteriumpyruviciproducens,the effective and feasible method of biological identification is also explored.

Corynebacteriumpyruviciproducens; biological characteristics; 16S rRNA

Tao Yuan-yong,Email: taoyuanyong@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.006

陶元勇，Email:taoyuanyong@163.com

1.濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系納米醫(yī)學技術研究所，濰坊 261053; 2.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科,濰坊 261053

R372

A

1002-2694(2017)05-0418-05

2017-01-03 編輯：劉岱偉