劉文鋒 印大中 湯長發(fā) 唐利花 陳宗平

1湖南師范大學體適能與運動康復湖南省重點實驗室（長沙 410012）

2湖南師范大學蛋白質化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室（長沙 410081）

規(guī)律有氧運動對大鼠紋狀體miRNA207/542及下游靶信號通路的影響

劉文鋒1，2印大中1，2湯長發(fā)1唐利花1陳宗平1

1湖南師范大學體適能與運動康復湖南省重點實驗室（長沙 410012）

2湖南師范大學蛋白質化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室（長沙 410081）

目的：采用規(guī)律有氧運動干預不同年齡大鼠，基于miRNA表達譜芯片技術，旨在尋找運動適應性作用對神經(jīng)退行性病變早期作用的靶標，挖掘關鍵的可解釋運動適應性作用機理的靶標基因的生物功能。方法：選取SPF級健康雄性3月齡（青年，n=20）、13月齡（中年，n=24）和22月齡（老年，n=24）SD大鼠，每個年齡組大鼠按體重隨機分為青年對照組（Y-SED，n=10）、青年運動組（Y-EX，n=10），中年對照組（MSED，n=12）、中年運動組（M-EX，n=12），老年對照組（O-SED，n=12）和老年運動組（O-EX，n=12）。三組對照組安靜飼養(yǎng)；三組運動組進行10周遞增負荷中等強度的規(guī)律有氧跑臺運動。每周進行體重監(jiān)控；采用HE染色觀察大鼠腦紋狀體形態(tài)學變化；采用miRNA微陣列芯片miRCURYTM LNA Array（v.18.0）等方法分析miRNAs差異表達譜，使用qRT-PCR等對篩選重要差異miRNA及其相關通路的mRNA表達進行驗證與研究。結果：大鼠紋狀體的形態(tài)學變化明顯呈現(xiàn)增齡性變化，實施規(guī)律有氧運動后，各年齡組相應地出現(xiàn)線團狀的基質部分明顯緊湊，之間間隙非常緊密，顯微鏡下觀察細胞核排列有序，數(shù)量明顯增加。miRNA微陣列芯片數(shù)據(jù)結果顯示，發(fā)生2倍及以上變化差異的miRNAs有26個，經(jīng)生物信息學分析，最終篩查出規(guī)律有氧運動上調miRNA207和下調miRNA542的表達，miRNA207和miRNA542所作用的下游基因PI3K、Akt和mTOR mRNA表達呈現(xiàn)增齡性下調，與對照組M-SED和O-SED相比較，M-EX和O-EX組PI3K、Akt和mTOR mRNA表達上調（P＜0.05，P＜0.01）。Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性上升趨勢，與各年齡安靜組相比較，運動組CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達上調顯著（P＜0.05）。結論：規(guī)律有氧運動通過上調miRNA207和下調miRNA542的表達而激活大鼠紋狀體的PI3K/Akt/mTOR和CaMKIIα信號通路共同參與調控紋狀體的生物學功能和改善神經(jīng)老化。

有氧運動；紋狀體；老化；miRNA207；miRNA542；PI3K；Akt；mTOR；CaMKIIα

microRNAs（miRNAs）是一種小RNA基因，長度約20～24個核苷酸，為內源性非編碼基因，miRNA廣泛表達并通過多種方式調控轉錄后的一系列基因，參與生命活動的各項重要過程[1-3]。當miRNA與靶mRNA堿基完全互補配對時，miRNA會引起靶mRNA的降解，而當堿基序列不完全互補時，miRNA在蛋白翻譯水平上調控mRNA的表達。研究報道m(xù)iRNA對腦老化和神經(jīng)退行性疾病的形成具有關鍵調節(jié)作用，如miRNA-429調控阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）和亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）兩種疾病，miRNA-743b-3p調節(jié)HD和帕金森病（Parkinson’s disease，PD）兩種疾病，miRNA-141-3p，miRNA-200a-3p，miR?NA-200a-5p和miRNA-499a-5p參與AD和PD這兩種疾病的調控，miRNA-182對這三種疾病都有影響[4-7]。Yin等[8]構建自然增齡性老化模型，取全腦進行miRNA深度測序，進一步采用PANTHER分類系統(tǒng)[9]對靶基因進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)23種差異表達的miRNAs所調控的24種靶基因，分別對AD，HD或PD有直接的作用。

本研究基于miRNA表達譜芯片技術，旨在尋找運動適應性作用對神經(jīng)退行性病變早期作用的新的靶標，再經(jīng)過實時熒光定量PCR驗證趨勢與miRNA芯片表達結果的一致性，經(jīng)生物信息學分析試圖尋找上調和下調miRNA而調控相關信號通路的mRNA表達，從而挖掘關鍵的可解釋運動適應性作用機理的靶標基因的生物功能。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

健康雄性SD大鼠3月齡（青年，n=20）、13月齡（中年，n=24）和22月齡（老年，n=24），均為SPF（Specific pathogen Free，SPF）級動物，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。以國家標準嚙齒類動物飼料（A級）飼養(yǎng)。室溫保持20～24℃，相對濕度為45%～55%。實驗過程中對動物的處置符合《實驗動物管理條例》、《關于善待實驗動物的指導性意見》等規(guī)定。

每個年齡組大鼠按體重隨機分組，分為青年對照組（Y-SED，n=10）、青年運動組（Y-EX，n=10）；中年對照組（M-SED，n=12）、中年運動組（M-EX，n=12）；老年對照組（O-SED，n=12）和老年運動組（OEX，n=12）。三組對照組靜息，不做跑臺運動；三組運動組進行10周遞增負荷中等強度的規(guī)律有氧跑臺運動。

1.2 規(guī)律有氧運動處方

所有運動組SD大鼠適應性飼養(yǎng)2周后，采用杭州立泰科技有限公司研制的PT動物電動跑臺進行3天5～10 min適應性訓練，坡度0°，速度10 m/min。中等強度規(guī)律有氧運動模型：參考本實驗前期動物實驗等[10]，以及借鑒國內張勇等研究報道[11]，運動強度相當于最大攝氧量（VO2max）60%～65%逐漸遞增到70%～75%，坡度0°，為期10周。青年、中年和老年大鼠的運動負荷均從每天以15 m/min速度跑臺運動15 min開始，第2周速度不變，時間遞增5 min，第3周速度增加3 m/ min，時間延長5 min，第4周速度不變，時間遞增5 min；根據(jù)增齡性因素，第5周從速度和時間兩方面考慮遞增延續(xù)到第6周作為運動負荷固定的過渡運動期，前6周每周運動6天。后4周固定運動強度（隨機抽取3只大鼠，尾部采血測試血乳酸濃度監(jiān)控運動強度）：青年組以25 m/min速度運動45 min，中年組以22 m/min速度運動40 min，老年組以20 m/min速度運動35 min，每周5天（見表1）。

1.3 實驗取材與樣本制備

最后一周運動結束后，腹腔注射10%水合氯醛溶液按0.5 ml/100g麻醉大鼠進行取材。每組隨機選取3只大鼠，進行升主動脈灌注[生理鹽水（37℃）快速灌注5 min（60 ml）左右以移除血液]，然后緩慢點滴4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）（4℃）400～500 ml灌注固定，直到動物的肝臟發(fā)硬與尾巴僵直，取腦，保存在4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液中4°冰箱過夜，經(jīng)石蠟包埋后用于切片制作。其余大鼠直接取腦，參考Glwinski and Iversen[12，13]，諸葛啟釧主譯[14]大鼠腦立體定位圖譜，分離出兩側的新鮮紋狀體，經(jīng)液氮速凍后置于－80°冰箱保存，用于miRNA芯片等測試。

1.4 體重監(jiān)控

所有大鼠采用體重計每周一開始隔天測量體重，將每周測得3次體重求均值進行統(tǒng)計學處理。

1.5 HE染色

按照大鼠腦立體定位圖譜定位點：對耳線10 mm左右，前鹵0.7 mm左右，進行切片，即可切到紋狀體部位。常規(guī)步驟：脫臘水化、蘇木素染色10～15 min、1%的鹽酸酒精分色、5%伊紅染色1 min、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。采用美國Simple PCI Version 6.0生物顯微鏡系統(tǒng)采集圖像。每組至少選片5張，每張切片鏡下（×200）隨機取5個視野進行分析。

1.6 miRNA基因芯片基因芯片

采用丹麥Exiqon公司研發(fā)的第7代產(chǎn)品miRNA表達譜芯片miRCURYTMLNA Array（v.18.0）（Exiqon），包含3100個微探針，覆蓋人類、小鼠和大鼠以及除病毒之外的等所有已發(fā)現(xiàn)的microRNAs（參考miRBase 18.0），另外還包含25 miRPlusTM人類 miRNAs。

1.6.1 總RNA的提取

稱大鼠腦紋狀體60 mg左右，采用TRIzol法提取總RNA。采用紫外分光光度計（ND-1000，Nanodrop Technologies）檢驗RNA樣品完整性。采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA經(jīng)甲醛變性膠電泳完整性。由圖1可見RNA樣品質量符合miRNA芯片實驗要求。

圖1 增齡大鼠樣本抽提RNA的電泳情況

1.6.2 miRNA的芯片技術

使用試劑盒TRIzol（Invitrogen）and miRNeasy mini kit（QIAGEN）和miRCURY?Hy3?/Hy5?Pow?er labeling kit等抽提總RNA、量化RNA和進行雜交，處理好的Exiqon’s miRCURY LNA?miRNA Array（miRNA芯片）采用儀器Axon GenePix 4000B microar?ray scanner掃描等；最后采用軟件miRCURY?LNA Array（v.18.0）、GenePix Pro 6.0 software（Axon）和Ingenuity Pathway Analysis等進行RNA芯片修正、分析和生物信息學分析。經(jīng)過步驟：抽提RNA；RNA質量檢測；總RNA的純化和濃縮；RNA反轉錄和擴增；標記miRNA；miRNA芯片雜交；洗片與掃描等。

1.6.3 miRNA芯片的掃描與數(shù)據(jù)分析

從圖2芯片掃描圖可見，圖像清晰，無背景信號，無劃痕，信號點規(guī)則，邊緣清晰雜交信號均一，表明芯片雜交反應成功。

圖2 M-SED組（上）和M-EX組（下）的芯片掃描圖

采用中位數(shù)據(jù)歸一化方法（Median Normalization Method）得到標準值（Normalized Data）：Normalized Data=修正值（Foreground-Background）/medi?an，即為各個miRNA的修正值除以各張芯片的中位數(shù)做標準化后的數(shù)值，進行樣本比較時采用的數(shù)值[15，16]。為了檢測集合中的miRNAs的差異化表達水平，我們通過 Bioconductor DESeq package[17]（http：//www.biocon?ductor.org/），來對miRDeep2中已知的miRNAs的表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.6.4 miRNAs生物信息學分析：靶點預測和功能分析

采用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析工具以及靶標預測數(shù)據(jù)庫TargetScan[18]中的所有miRNA靶標數(shù)據(jù)。通過GO（Gene Ontology）分析可得到分子功能、生物過程和細胞組成三方面信息[19]。蛋白質或者基因可以通過ID對應或者序列注釋的方法找到與之對應的GO號，從而得到功能類別或者細胞定位等。

通過miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/）數(shù)據(jù)庫來預測差異性表達的已知miRNAs的靶點——預測得分≥60[20，21]。借助DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）生物信息學資源（6.7版本）對每個測到的靶點基因進行功能學注釋，包括一個整合的生物學知識庫和分析工具，可以系統(tǒng)地從大基因/蛋白系列中提取生物學意義[22，23]。通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫[24，25]了解代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程和人類疾病等信息[26]。

1.7 miRNA207和miRNA542表達的qRT-PCR驗證

1.7.1 qRT–PCR miRNA引物

表2 qRT-PCR miRNA引物設計

1.7.2 目的基因miRNA的相對定量

每組隨機3個樣本，每個樣品3個復管進行實時熒光定量PCR，確認實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，記錄各個基因miRNA的Ct（cycle threshold）值。以β-actin作為內參，采用2－△△Ct法，對目的基因miRNA表達進行相對定量。

1.8 下游靶信號通路mRNA的qRT-PCR檢測

表3 qRT-PCR mRNA引物設計

1.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行處理。所有數(shù)據(jù)均采用平均值 ±標準差（±s）表示；各組間顯著性差異采用方差分析、組內顯著性差異用雙側t檢驗；本實驗使用LSD法和SNK法進行多重比較；P＜ 0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重監(jiān)控情況

從圖3可以得出，健康雄性SD大鼠3.0月齡（青年組）體重481.25±22.17 g、13月齡（中年組）體重547.75±21.94 g和23月齡（老年組）體重693.21± 68.85 g。各年齡安靜組的大鼠體重隨著實驗時間而出現(xiàn)比較穩(wěn)定的緩慢增加趨勢，體重增加的變化無統(tǒng)計學意義。而各年齡運動組從第2周開始體重有下降趨勢，趨勢一直延續(xù)到實驗結束，其中第3周中年安靜組與運動組的大鼠體重相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第4周開始到第10周，青年、中年和老年安靜組與相應的運動組相比較，體重差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 增齡大鼠及運動干預對大鼠體重的監(jiān)控

2.2 紋狀體HE染色結果

從圖4可以看出，Y-SED組大鼠紋狀體的線團狀的基質部分很明顯，之間間隙明顯，M-SED組則基質部分能明顯分別出來，之間間隙比Y-SED組明顯減小，而O-SED組難以辨出基質部分，之間間隙非常小?？梢姲察o組明顯呈現(xiàn)年齡增齡性變化。實施規(guī)律有氧運動后，各年齡組相應的出現(xiàn)線團狀的基質部分明顯緊湊，之間間隙非常緊密，顯微鏡下觀察細胞核排列有序，數(shù)量明顯增加，表明規(guī)律有氧運動改善了紋狀體的形態(tài)結構。

圖4 增齡大鼠紋狀體HE染色（其中CPu即為紋狀體）

2.3 差異miRNAs的結果

本實驗通過miRNA微陣列芯片數(shù)據(jù)篩選出發(fā)生2倍及以上變化差異的miRNAs 26個（見表4和5）。其中規(guī)律有氧運動上調2倍及以上大鼠紋狀體的15個miRNAs：miR-207、miR-3593-3p和miR-106b-3p等；而下調2倍及以上的11個miRNAs：miR-542-3p、miR-363-5p和miR-141-5p等。

本實驗對上述26個miRNAs分別進行生物信息學分析：靶點預測及其功能分析。通過表達量趨勢配對、亞細胞定位篩選、靶標基因在已知疾病中的作用、通路篩選等提煉可能調控的靶基因對；使用轉錄因子預測、分子活性預測等模塊，從靶標數(shù)據(jù)庫中篩選出最可信的miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡；結果發(fā)現(xiàn)miRNA207和miRNA542符合本實驗的研究需要，值得進一步研究。

表4 篩選出大鼠紋狀體運動組比安靜組上調2倍及以上的miRNAs

表5 篩選出大鼠紋狀體運動組比安靜組下調2倍及以上的miRNAs

2.4 miRNA207和miRNA542的生物信息學分析與下游靶基因預測

2.4.1 GO分析

根據(jù)GO生物信息學分析，預測miRNA207和miR?NA542所作用的靶標相關蛋白的功能等，靶標相關蛋白主要涉及到蛋白結合的蛋白質有122個、催化結合蛋白105個和陽離子結合蛋白61個等，主要參與AMP結合、神經(jīng)遞質轉運活動、ATP合成和谷氨酸結合等生物學功能（圖5）。96個蛋白參與生物合成、93個蛋白為氮有關活動蛋白、86個蛋白為轉運蛋白、84個蛋白參與能量代謝、84個蛋白參與發(fā)育過程等。蛋白相關的生物功能涉及嘌呤核苷酸信號、Ca2+依賴的細胞外分泌正調控、細胞凋亡負調控、大腦行為應答和P53參與調控的DNA損壞應答調控等（圖6）。

圖5 GO分析得出大鼠紋狀體miRNA的分子功能分類

2.4.2 KEGG生物學通路分析

由KEGG生物學通路分析可知miRNA207與鈣信號依賴蘇氨酸激酶（Cask）、突觸素、1433蛋白和Bcl-2等蛋白有著密切關系；而miR-542-3p與谷氨酸結合蛋白、ATP結合蛋白和核內不均一核糖蛋白3等有著密切關系。經(jīng)過KEGG生物學通路分析，對可能富集的生物學通路進行了預測，對符合P值者（EASE-score，F(xiàn)isher-P value or Hypergeometric-P value）進行相關通路的預測，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通 路 （Neuroactive ligand- receptor interaction，rno04080）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway，rno04020）和γ-氨基丁酸突觸信號通路（GABAergic synapse，rno04727）等。這些統(tǒng)計學意義的生物學信號通路可能與神經(jīng)老化或者神經(jīng)退行有著密切關系。GO和KEGG生物學通路分析結果顯示，運動對增齡大鼠紋狀體的細胞死亡、突觸結構重塑、氨基酸代謝、糖代謝和DNA損傷等的影響是本研究中miRNAs靶基因生物信息學分析的主要方向。

圖6 GO分析得出大鼠紋狀體miRNA的生物學功能分類

2.5 差異篩選miRNA207和miRNA542的驗證

采用qRT-PCR驗證差異表達的miRNA，根據(jù)前面靶基因預測與分析，選擇上調miRNA207和下調miR?NA542進行驗證，驗證結果與芯片結果基本一致。

由圖7可以看出，miRNA207表達呈現(xiàn)增齡性上升趨勢。與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的miR? NA207表達上調顯著（P＜0.05），但是M-SED和O-SED之間沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各年齡安靜組與運動組相比較，miRNA207表達上調顯著（P＜0.01）。

圖7 qRT-PCR測定miRNA207擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

從圖8可以看出，miRNA542表達的變化呈現(xiàn)不明顯的增齡性上升或下降趨勢。與Y-SED相比，M-SED的miRNA542表達稍上調（P＞0.05），而O-SED上調顯著（P＜0.01）；與Y-SED相比，Y-EX的 miRNA542表達略增高（P＞0.05）；與M-SED相比，M-EX的miRNA542表達有所下降（P＞0.05）；與O-SED相比較，O-EX的miRNA542表達顯著下調（P＜0.01）。

圖8 qRT-PCR測定miRNA542擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

圖9 qRT-PCR測定PI3K擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

圖10 qRT-PCR測定Akt擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

圖11 qRT-PCR測定mTOR擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

2.5 下游靶信號通路PI3K/Akt/mTOR表達水平

從圖9-11可以看出，PI3K、Akt和mTOR mRNA表達呈現(xiàn)增齡性下調，與Y-SED相比較，O-SED的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達下調顯著（P＜0.05）。與Y-SED相比，Y-EX的Akt和mTOR mRNA表達稍上調，而PI3K出現(xiàn)下調趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與M-SED相比較，M-EX的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達上調（P＜0.05）；與O-SED相比較，O-EX的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達上調顯著（P＜0.01）。

2.6 下游靶信號通路CaMKIIα的影響

從圖12和13可以看出，Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性上升趨勢，與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達均顯著上調（P＜0.05），但M-SED和O-SED之間比較沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各年齡安靜組與運動組相比較，CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達上調顯著（P＜0.05），其中與M-SED相比較，M-EX明顯上調（P＜0.01）。

圖12 qRT-PCR測定CaMKIIα擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

圖13 qRT-PCR測定Vdac1擴增曲線和溶解曲線及其表達水平

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)規(guī)律運動上調2倍及以上的大鼠紋狀體的15個miRNAs，如miR-207等；而下調2倍及以上的11個miRNAs，如miR-542-3p等。Tan等[27]研究發(fā)現(xiàn)miRNA207調控下游靶基因Akt3作用于DNA損傷與細胞凋亡的過程。PI3K/Akt/mTOR通路通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)，參與調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和代謝等一系列重要的生理活動，也與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、化療耐藥性及血管生成密切相關[28]。本實驗結果顯示PI3K、Akt和mTOR mRNA表達呈現(xiàn)增齡性下調，表明增齡過程中，生存信號轉導通路PI3K/Akt/mTOR隨年齡的增長而下調；運動對各年齡大鼠PI3K、Akt和mTOR mRNA表達總體性上調，除青年運動組PI3K出現(xiàn)下調趨勢（P＞0.05），表明規(guī)律有氧運動能激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。Fujita和Sato等[29，30]研究發(fā)現(xiàn)在抗凋亡途徑PI3K/Akt激酶通路中，Akt激酶等一系列激酶均屬于HSP90底物蛋白，HSP90及輔助伴侶分子Cdc37與Akt結合，使其活化發(fā)揮抗凋亡作用。Tao等[31]報道側腦室注射miR-207激動劑后，神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積被減弱，同時線粒體棘結構被改善；此外，miR-207模擬物可以減少溶酶體和自噬體數(shù)量，增加自噬泡的數(shù)量；他們的研究結果提示miR-207可能影響自噬—溶酶體信號通路和線粒體誘導的凋亡。Long等[32]報道m(xù)iR542-3p抑制癌細胞的增長與擴散并促進其凋亡。說明miR-207和miR542-3p都可能是研究運動改善神經(jīng)老化的新的靶標分子，亟待進一步研究。

本實驗結果表明運動上調增齡大鼠紋狀體的miR?NA207表達和下調miRNA542表達；miRNA207和miR?NA542所作用的下游信號通路主要有：神經(jīng)老化或者神經(jīng)退行有著密切關系的神經(jīng)活性配體—-受體相互作用信號通路、鈣信號通路和γ-氨基丁酸突觸信號通路等12條通路。同時，本實驗通過生物學通路分析，得知miRNA207與鈣信號依賴蘇氨酸激酶（Cask）、突觸素、1433蛋白和Bcl-2等蛋白表達有著密切關系，提示運動有利于改善腦老化，可能與突觸蛋白相關聯(lián)。CaMKII是腦內最為豐富的蛋白激酶之一，是調控鈣信號等多條信號轉導通道的重要分子，在突觸可塑性、學習和記憶中具有關鍵作用[33，34]。本實驗發(fā)現(xiàn)CaMKIIα和Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性趨勢，與各年齡安靜組相比較，運動組CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達上調顯著。已有實驗證實CaMKII-α缺乏的轉基因小鼠表現(xiàn)出顯著的突觸可塑性缺陷和記憶形成障礙[35]。CaM?KII-α被發(fā)現(xiàn)同時存在于突觸前和突觸后部位，突觸前的CaMKII-α主要參與了突觸小泡群集和神經(jīng)遞質釋放的調控，位于突觸后部位的CaMKII-α則參與調節(jié)NMDA受體的表達水平及其向突觸后膜的定位。Foster等[36]將老化腦中鈣調神經(jīng)素（Calcineurin，CN）活性變化與胞內Ca2+濃度的變化聯(lián)系了起來，他們證明其在學習記憶中有重要作用，參與了大腦神經(jīng)元突觸效應的去增強、多種不同機制的長時程增強、長時程抑制、認知記憶、短期記憶向長期記憶的轉換、腦老化等過程[37]。

4 結論

規(guī)律運動通過上調miRNA207和下調miRNA542的表達而激活大鼠紋狀體的PI3K/Akt/mTOR和CaM?KIIα信號通路共同參與調控紋狀體的生物學功能和改善神經(jīng)老化。

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The Effect of Regular Aerobic Exercise on the Expression of miRNA207 and miRNA542 and Downstream Target Signal Transduction in the Striatum of Rats

Liu Wenfeng1，2，Yin Dazhong1，2，Tang Changfa1，Tang Lihua1，Chen Zongping1
1 Hunan Provincial Key Laboratory of Physical Fitness and Sports Rehabilitation，Hunan Normal University，Changsha 410012，China
2 The Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of Ministry of Education，Hunan Normal University，Changsha 410081，China Corresponding Author：Liu Wenfeng，wfliu@hunnu.edu.cn

ObjectiveTo explore the new targets of the impact of exercise on the striatal in the ear?ly neurodegeneration among rats of different ages with regular aerobic exercise by means of the miR?NA expression profile chip technology，and explain the key biochemical and molecular regulation mech?anism of the new target genes.MethodsThree，13 and 22-month-old specific pathogen free（SPF）male Sprague-Dawley Rat（SD）rats were randomly divided into a young（Y-SED，n=10），a middleaged（M-SED，n=10）and an old-aged（O-SED，n=12）sedentary control group，and the correspond?ing Y-EX（n=10），M-EX（n=10）and O-EX（n=12）in the aerobic exercise group.The rats in the sedentary control groups didn’t exercise，while those in the aerobic exercise groups underwent a 10-week regular moderate-intensity aerobic exercise on treadmill.The rats’body weight was measured ev?ery week.HE staining was used to present the morphological changes in the striatum.The miRNA mi?croarray of miRNA miRCURYTM LNA Array（v.18.0）（Exiqon，Danish）was employed to analyze the expression profile of miRNAs.The qRT-PCR was performed to screen and to verify the related signal pathways for the biochemical mechanisms.ResultsThe morphology of the rats’striatum changed clear?ly with ages.The nuclei in the striatum were arranged orderly and the number of nuclei increased sig?nificantly in each group undergoing regular aerobic exercise.miRNA microarray data showed that 26 miRNAs increased to no less than twice of the original level.The expression of miRNA207 was found up-regulated while that of miRNA542 was down-regulated after regular aerobic exercise through screen?ing the bioinformatics of miRNA.The expression of PI3K，Akt and mTOR mRNA，downstream genes of miRNA207 and miRNA542，was also found down-regulated with the increase of age.However，com?pared with the sedentary groups，the expression of PI3K，Akt and mTOR was higher in the exercise groups.The Vdac1 mRNA was observed an increasing tendency with age.Compared with all the seden?tary groups，significant upregulation was observed in the expression of CaMKIIα and Vdac1 in the aer?obic exercise groups.ConclusionRegular aerobic exercise can regulate the biological function of rats’striatum and alleviate the aging process through upregulating the expression of miRNA207 and downreg?ulating that of miRNA542 to activate the PI3K/Akt/mTOR and CaMKIIα signaling pathway.

aerobic exercise，striatum，aging，miRNA207，miRNA542，PI3K，Akt，mTOR，CaM?KIIα

2016.08.10

湖南師范大學青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃（ET1507）；國家自然科學基金（31271257）；國家高科技 863計劃（2008AA02Z411）；湖南省自然科學基金（11JJ6082）；湖南教育廳優(yōu)秀青年基金（12B088）

劉文鋒，Email：wfliu@hunnu.edu.cn