燕霞++何頌華++謝培德

【摘要】目的：建立高效液相-電霧式檢測(cè)器（HPLC-CAD）方法測(cè)定女貞子藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為AcclaimTM 120 C18；流動(dòng)相為乙腈-50mmol/L醋酸銨（70：30）；流速為10mL /min；柱溫為35℃；電霧式檢測(cè)器，霧化溫度35℃，采集頻率10Hz。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為03210～6420、01009～2018μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2%；加樣回收率分別為10021%～10474%、9626%～10338%，RSD分別為178%、255%（n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于女貞子中齊墩果酸和熊果酸含量的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 女貞子；齊墩果酸；熊果酸；HPLC-CAD；含量測(cè)定

【中圖分類(lèi)號(hào)】R2842【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）10-0012-03

Content Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits

of Ligustrum lucidum Aitby HPLC-CAD

YAN XiaHE SonghuaXIE Peide

Guangxi Institute for Food ang Drug Control，Nanning 530021，China

Abstract：Objective To establish an HPLC-CAD method for the determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait Methods HPLC was performed on the column of AcclaimTM 120C18 with mobile phase of acetonitrile-50mmol/L Ammonium acetate solution（70：30），at flow rate of 1mL/min，the column temperature was 35℃； CAD：nebulization temperature was 35℃ and collection frequency was 10HzResults The linear range was 0321 0-6420μg（r=0999 7）for Oleanolic Acid and 0100 9-2018μg（r=09999）for Ursolic Acid；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 20%；recoveries were 10021%～10474%（RSD=178%，n=6）and 9626%～10338%（RSD=255%，n=6），respectivelyConclusion The method is simple，stable and reproducible，and can be used for the content determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Fruits of Ligustrum lucidum Ait

Keywords：Ligustri Lucidi Fructus；Oleanolic Acid；Ursolic Acid；HPLC-CAD；Content Determination

女貞子系木犀科（Oleaceae）植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的果實(shí)，具有補(bǔ)腎滋陰、養(yǎng)肝明目的功效，臨床用于肝腎不足、頭暈耳鳴、頭發(fā)早白及兩目昏糊等病癥。研究表明女貞子中主要含有三萜類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯乙醇類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)等化合物，具有抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抗血栓形成、抗衰老及抗疲勞的作用[1]，能調(diào)節(jié)免疫，提高腫瘤患者的免疫功能[2]，是目前抗衰老、抗腫瘤方劑中的主要藥物之一，其中三萜類(lèi)化合物齊墩果酸與熊果酸是具有抗變異活性的主要成分。2015版《中國(guó)藥典》一部收載了女貞子以特女貞苷做為含量測(cè)定指標(biāo)，并未對(duì)齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行定量控制。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[3-5]，研究者多用TLC和HPLC- ELSD法對(duì)齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行定量測(cè)定。本文采用HPLC-CAD方法同時(shí)測(cè)定女貞子藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量，建立了一種準(zhǔn)確、快速、高效的含量測(cè)定方法，對(duì)女貞子藥材及女貞子制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定具有參考價(jià)值，對(duì)其類(lèi)似化合物的測(cè)定提供了參考依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器Dionex Ultimate 3000 系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；DGP-3600RS雙三元液相色譜泵；WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器；TCC-3x00（RS）柱溫箱；Corona Veo RS 檢測(cè)器 Chromeleon Chromatography Data System 72 SR4 色譜軟件；Sartorius BP211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ-600VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-100型中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國(guó)Millipore公司）。

12材料齊墩果酸（批號(hào)：110709-200304）、熊果酸（批號(hào)：110742-200516）對(duì)照品中國(guó)食品藥品檢定研究院；女貞子（批號(hào)：160203，廣西桂林三金藥業(yè)有限公司；批號(hào)：16071201，廣西康全藥業(yè)；批號(hào)：151001，廣西一心藥業(yè)；批號(hào)：20150901，廣西南寧朝陽(yáng)大藥房）經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所中藥室謝培德主任鑒定均為木犀科植物女貞子Ligustrum lucidum Ait 的干燥成熟果實(shí)；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

21色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：AcclaimTM 120C18柱（46mm×250mm， 5μm） ；流動(dòng)相：乙腈-50mmol/L醋酸銨（70∶[KG-*3/5]30）；流速：10mL /min；檢測(cè)器為電噴霧檢測(cè)器，霧化溫度為35℃；載氣：N2，壓力635psi；柱溫：35℃。進(jìn)樣量：混合對(duì)照品：5、15μL，供試品：10μL。在此條件下，齊墩果酸與熊果酸峰完全達(dá)到基線(xiàn)分離（R>15），理論板數(shù)以齊墩果酸峰計(jì)在10000以上。色譜見(jiàn)圖1。

22溶液的制備

221混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品適量，分別置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述貯備液適量，置于同一10mL量瓶中，加甲醇制成每1mL含齊墩果酸03210mg，熊果酸01009mg的溶液，即得。

222供試品溶液取樣品粉末（過(guò)40目篩）10g，精密稱(chēng)定，置于50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：320W，頻率：40KHz）處理30min，取出放冷后再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用045μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[6]。

23線(xiàn)性關(guān)系考察分別精密吸取“221”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、5、7、10、15、20μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果得齊墩果酸回歸方程為：Y=08898X+08262（r=09997）、熊果酸回歸方程為：Y=08194X+08884（r=09999）。結(jié)果表明齊墩果酸在進(jìn)樣量為03210～6420μg時(shí)，進(jìn)樣量與齊墩果酸峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好；熊果酸在進(jìn)樣量為01009～2018μg時(shí)，進(jìn)樣量與熊果酸峰面積的線(xiàn)性關(guān)系良好。

24精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：160203）適量，按“21”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為031%、078%（n=6），表明儀器精密度良好。

25穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品（批號(hào)：160203）粉末適量，按“222”項(xiàng)下方法制備供試品供試品溶液，分別于放置0、2、6、8、10、14、20、24h時(shí)按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為105%、125%（n=8），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

26重復(fù)性試驗(yàn)取樣品（批號(hào)：160203）粉末適量，按“222”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，再按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果齊墩果酸含量平均值為8046mg/g，RSD 為191%（n=6），熊果酸含量平均值為3288mg/g，RSD為154%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

27加樣回收率測(cè)定

271混合對(duì)照品貯備液的制備精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品4065mg，熊果酸對(duì)照品1571mg，置250mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液。

272回收率的測(cè)定取已知含量的樣品（批號(hào)：160203）粉末適量，平行稱(chēng)取6份，每份05g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對(duì)照品貯備液25mL，按“222”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

28樣品測(cè)定取4批樣品各適量，分別按“222”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算齊墩果酸和熊果酸含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

電噴霧式檢測(cè)器（CAD）作為一款質(zhì)量敏感型檢測(cè)器，其響應(yīng)值只與進(jìn)樣質(zhì)量有關(guān)，不依賴(lài)于化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，可檢測(cè)所有非揮發(fā)性化合物和部分半揮發(fā)性化合物。檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，重現(xiàn)性好，是紫外和質(zhì)譜檢測(cè)器的有力補(bǔ)充。

實(shí)驗(yàn)還比較了乙腈-水、乙腈-01%甲酸、乙腈-50mmol/L醋酸銨不同的洗脫系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-50mmol/L醋酸銨系統(tǒng)基線(xiàn)噪音最大，為乙腈-01%甲酸系統(tǒng)的3倍，乙腈-水系統(tǒng)的15倍，但乙腈-01%甲酸、乙腈-水系統(tǒng)齊墩果酸與熊果酸峰分離不好，故選用乙腈-50mmol/L醋酸銨系統(tǒng)。

綜上所述，本研究建立了以 HPLC-CAD法同時(shí)測(cè)定女貞子中齊墩果酸與熊果酸的檢測(cè)方法， 結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單易行，定量準(zhǔn)確，可用于女貞子中齊墩果酸與熊果酸的定量分析，同時(shí)也為含女貞子藥材的制劑的質(zhì)量研究提供了參考方法。

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（收稿日期：2017-03-21編輯：陶希睿）