馬卓婭　張建平　劉萍　王國兵　羅穎　鄭躍杰

【摘要】 目的：探討調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Regulatory B cells，Breg）在兒童哮喘發(fā)病中可能的作用。方法：選取急性期哮喘患兒23例（試驗(yàn)組），同齡健康兒童21例（正常對照組），取血備檢。采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）、Breg比例及Breg細(xì)胞表面CD80、CD86的表達(dá)水平；PCR檢測CD4+ T細(xì)胞中IL-17A、IL-17F IFN-γ、T-bet、GATA3、RORγt、IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)；ELISA檢測B細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10濃度。結(jié)果：（1）試驗(yàn)組患兒急性發(fā)作期外周血中CD24hiCD27+Breg細(xì)胞比例及B細(xì)胞培養(yǎng)上清的IL-10濃度均比正常對照組低（P<0.05）；CD80、CD86表達(dá)水平均低于正常對照組（P<0.05）。（2）試驗(yàn)組患兒CD4+CD25+Foxp3+Treg比例低于正常對照組（P<0.05）；CD4+T細(xì)胞中T-bet、IFNG、RORγt、IL-17A、IL-17F表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；GATA3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（3）CD19+B細(xì)胞中IL-10 mRNA在試驗(yàn)組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而TGF-βmRNA在試驗(yàn)組患兒中升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Breg細(xì)胞數(shù)量及功能異常可能是哮喘發(fā)病機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 哮喘； 兒童； 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞； 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 白介素-10

Changes of Regulatory B Cells in Patients with Acute Asthma and Its Significance/MA Zhuo-ya，ZHANG Jian-ping，LIU Ping，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（14）：012-016

【Abstract】 Objective：To investigate the role of regulatory B cells in the pathogenesis in patients with asthma in children.Method：Twenty-three children with acute asthma（the experiment group） and twenty-one age-matched healthy subjects （the healthy control group）were enrolled in this study.Blood samples were collected and the proportions of Breg and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells（Treg），and the expressions of co-stimulatory molecules（CD80，CD86） were analyzed by flow cytometry.The concentration of IL-10 protein was measured by enzyme-linkedimmunosorbent assay.Real-time PCR was performed to evalevaluate the expressions of T-bet，IFNG，RORγt，IL-17A，IL-17F in CD4+ T cells and IL-10 and TGF-β in CD19+B cells at mRNA level.Result：（1）The proportions of CD24hiCD27+Breg in the experiment group were significantly found to be lower than those of the healthy control group（P<0.05），and its expression levels of CD80 and CD86 were down-regulated（P<0.05），the concentrations of IL-10 protein in culture supernatant of B cells from patients were still lower than those of the healthy control group（P<0.05）.（2）The proportions of CD4+CD25+Foxp3+Treg was significantly decreased in the experiment group compared with those of the healthy control group（P<0.05），and the expressions of T-bet，IFNG，RORγt，IL-17A，IL-17F at mRNA level were significantly increased inpatients compared with those of the healthy control group （P<0.05）.（3）There no significant difference in the expressions of IL-10 at mRNA level in CD19+B cells between two groups and the expressions of TGF-β at mRNA level in CD19+B cells from patients were higher than those of the healthy control group（P<0.05）.Conclusion：Breg cell deficiency and its impaired functiom might be one of the important factors causing immune dysfunction in patients with acute asthma.

【Key words】 Asthma； Child； Regulatory B cells； Regulatory T cells； Interleukin-10

First-authors address：Shenzhen Childrens Hospital，Shenzhen 518026，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.004

支氣管哮喘是一種反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶及呼吸困難為表現(xiàn)的慢性氣道炎癥性疾病，全國城市14歲以下哮喘兒童的累及患病率由2000年的1.97%增至2010年的3.02%[1-3]。兒童哮喘在我國占兒科門診量的3%～5%，是危害兒童健康的一種重要疾病[4]。支氣管哮喘，簡稱哮喘，是由氣道內(nèi)的炎癥細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的慢性炎癥性疾病，但其病因及發(fā)病機(jī)制迄今為止仍未完全闡明。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡是哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)，但是隨著研究的不斷深入，Th1/Th2細(xì)胞平衡理論未能解釋一些實(shí)驗(yàn)及臨床現(xiàn)象[5]。體內(nèi)存在具有免疫調(diào)節(jié)（或免疫抑制）功能的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg），可通過細(xì)胞共刺激分子（CD80、CD86）或細(xì)胞因子（IL-10或TGF-β）抑制自身免疫T細(xì)胞活化，其數(shù)量或功能變化可引起自身免疫功能紊亂，導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生[6-9]。本文探討哮喘患兒急性發(fā)作期外周血Breg改變，為進(jìn)一步揭示哮喘免疫發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 哮喘試驗(yàn)組：選取2015年

10月-2016年5月深圳市兒童醫(yī)院呼吸專科診斷支氣管哮喘急性期患兒23例，其中男17例，女6例，男女比例為2.83∶1；年齡3～12歲，平均（6.58±2.38）歲。診斷均符合2008年由中華醫(yī)學(xué)會兒科分會呼吸學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為首次確診哮喘或規(guī)范吸入激素且停用>3個月后復(fù)發(fā)，沒有其他傳染病和自身免疫病。正常對照組：選取在深圳市兒童醫(yī)院2015年10月-2016年5月體檢的健康兒童21例，其中男7例，女14例，男女比例為2.00∶1；年齡2～10歲，平均（5.43±1.91）歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組年齡、性別組成比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究方案及步驟經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會討論通過，參與研究的受試者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 分離CD4+、CD19+B 淋巴細(xì)胞：無菌采取靜脈血3 mL，肝素抗凝，迅速送檢。聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC）。參照試劑盒（美國LifeTec公司，113.31 D和111.43 D）方法，磁珠分離法分離CD4+、CD19+B淋巴細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力>95%，純度>97%，備用。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測（flow cytometry，F(xiàn)C） 采用全血直接計(jì)數(shù)法，以CD19-eFluro450（流式抗體均購自美國eBioscience公司）設(shè)門，經(jīng)CD24-PerCP-Cy5.5、CD27-PE-Cyanine7、CD80-APC、CD86-FITC、CD1d-PE染色30 min后檢測，分析CD19+CD24+CD27+Bregs比例及CD80、CD86、CD1d平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。另取部分細(xì)胞，以CD4-FITC設(shè)門，固定、破膜，經(jīng)CD25-PE和Foxp3-APC抗體染色30 min，檢測CD4+ CD25+Foxp3+細(xì)胞比例。全部數(shù)據(jù)經(jīng)流式細(xì)胞儀（美國Bection Dickinson公司，CantoII）配套軟件DivaVer6.1.3獲取分析。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR（real-time PCR） （1） 提取、定量總RNA：參照試劑盒方法（美國Ambion公司，AM1912）分離CD4+ T、CD19+ B淋巴細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測定RNA OD260及OD280，評估總RNA質(zhì)量。（2）逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）：參照試劑盒（美國Thermo公司，K1632# ）說明，RT合成cDNA。根據(jù)GenBank中IL-10、TGF-β等mRNA核酸序列合成引物（表1，引物均由廣州Invitrogen公司合成），參照試劑盒（大連寶生物，DRR036A）進(jìn)行PCR。（3）PCR產(chǎn)物鑒定：取PCR產(chǎn)物10 μL在2%瓊脂糖可回收凝膠中，90 V電泳30 min，切膠回收純化，并測序。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中被檢mRNA序列一致。（4）real-time PCR：采用SYBR Green試劑盒（大連寶生物，RR091Q），使用LightCycler 480II real-time PCR儀檢測，并應(yīng)用LCS 1.5軟件分析，mRNA表達(dá)水平以目的基因/β-actin的比值表示。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 取已分離的試驗(yàn)組及對照者外周血B細(xì)胞，經(jīng)DETA CHaBEAD ?CD19（美國LifeTec公司，125.06 D）去除磁珠后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入LPS（美國Sigma公司，L4397）至終濃度為10 ?g/mL的，于37 ℃孵育5 min，獲取上清；ELISA（美國eBioscience公司，BMS215INST）檢測IL-10蛋白水平，具體操作參照試劑說明書。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，F(xiàn)檢驗(yàn)后采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Breg比例及CD80、CD86、CD1d表達(dá)檢測結(jié)果 經(jīng)FC檢測，觀察到試驗(yàn)組外周血中CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞比例明顯低于正常對照組（P<0.05）。CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86表達(dá)水平均明顯低于正常對照組（P<0.05），而CD1d的表達(dá)水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2 B細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10檢測結(jié)果 經(jīng)ELISA法檢測，觀察到試驗(yàn)組患兒B細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10濃度低于正常對照組[（2.60±1.77）pg/mL vs （5.20±4.51）pg/mL，P<0.05]。

2.3 CD19+B細(xì)胞相關(guān)因子mRNA檢測結(jié)果 real-time PCR檢測觀察到試驗(yàn)組患兒外周血CD19+B細(xì)胞中IL-10 mRNA與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而TGF-β mRNA較對照組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)分子檢測結(jié)果 試驗(yàn)組患兒外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明顯低于正常對照組[（4.75±2.26）% vs（7.08±4.47）%，P<0.05]。經(jīng)real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患兒CD4+T細(xì)胞中T-bet mRNA下調(diào)，IFNG、RORγt、IL-17A、IL-17F mRNA上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組GATA3 mRNA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。分析CD19+CD24hiCD27+Breg與CD4+CD25+Foxp3+Treg相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者成正向相關(guān)關(guān)系（r=0.491，P<0.05），見圖1。

3 討論

哮喘是由氣道內(nèi)的炎癥細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的慢性炎癥性疾病，但其病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚。Breg細(xì)胞是一類產(chǎn)生IL-10的B細(xì)胞亞群，參與維持體內(nèi)免疫功能動態(tài)平衡[6-9]。

隨著Breg在哮喘中的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)Breg在支氣管哮喘中的發(fā)病中起重要的負(fù)向調(diào)節(jié)作用[10-13]。有研究報(bào)道，通過將局限性吸入耐受（local inhaltional tolerance，LIT）小鼠的肺門淋巴結(jié)B細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠，發(fā)現(xiàn)OVA致敏小鼠的組織炎癥明顯減輕，支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量減少和氣道高反應(yīng)減輕[12-13]。van der Vlugt等[10]通過對13例過敏性哮喘患者的外周血檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-10的CD24hiCD27+Breg不僅數(shù)量減少而且在受LPS刺激后分泌的IL-10也減少。

Kamekura等[11]在過敏性鼻炎和支氣管哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎患者和過敏性鼻炎合并哮喘的患者外周血中發(fā)現(xiàn)Breg的數(shù)量比健康對照人群減少，且過敏性鼻炎合并哮喘比過敏性鼻炎Breg的數(shù)量減少程度更大。這些研究提示Breg細(xì)胞可能在哮喘發(fā)病的免疫機(jī)制中起著重要作用。近幾年在人類Breg細(xì)胞的研究主要集中于CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞[14-15]。本組研究在未加任何絲裂原體外刺激培養(yǎng)，真實(shí)反映體內(nèi)免疫活性細(xì)胞活化狀態(tài)的情況下，觀察到試驗(yàn)組急性發(fā)作時外周血CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞比例比正常對照組顯著降低（P<0.05）。提示CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞可能與哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

Breg細(xì)胞主要通過分泌IL-10和表達(dá)CD80、CD86發(fā)揮直接免疫調(diào)節(jié)功能。IL-10可抑制樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）、MC等細(xì)胞的抗原提呈功能、降低MHCⅡ類分子表達(dá)及炎性細(xì)胞因子分泌，從而抑制T細(xì)胞活化[16-17]。應(yīng)用抗CD80、CD86單克隆抗體可逆轉(zhuǎn)Breg的抑制作用，而預(yù)先刪除Treg細(xì)胞并不影響B(tài)reg抑制效果，表明細(xì)胞間接觸機(jī)制可能是Breg介導(dǎo)抑制功能的主要方式之一，但不完全依賴于Treg間接作用[6，8，18]。本組研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒急性發(fā)作期外周血Breg細(xì)胞上清IL-10及細(xì)胞表面CD80、CD86表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），提示Breg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)可能是導(dǎo)致哮喘患兒急性發(fā)作機(jī)制之一。除直接發(fā)揮免疫抑制作用外，Breg細(xì)胞還可以通過IL-10，和CD80、CD86促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞增殖、活化，間接發(fā)揮抑制作用[7，18-19]。本研究觀察到，試驗(yàn)組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例明顯降低，與CD19+CD24hiCD27+Breg細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，提示CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量及功能異?？赡苁荁reg細(xì)胞間接介導(dǎo)急性期哮喘患兒免疫功能紊亂的重要途徑。

IL-10可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activatorsof transcription 3，STAT-3）的磷酸化，導(dǎo)致維甲酸相關(guān)孤兒核受體（retinnoid-relatedorphan nuclear receptor，ROR）-γt的表達(dá)水平降低，從而抑制了Th-17的分化；IL-10也可以抑制DC分泌IL-6和IL-12，抑制Th-17的分化，阻止抗原提呈，抑制單核細(xì)胞及巨噬胞產(chǎn)生促炎因子[20]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞中Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及IL-17A、IL-17F表達(dá)均上調(diào)的。提示急性期哮喘患兒的Breg比例下降，導(dǎo)致IL-10分泌減少，減少抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT-3的磷酸化，導(dǎo)致RORγt的表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)了Th-17的分化。間接發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

新近的研究認(rèn)為Breg也可通過表達(dá)TGF-β直接或間接介導(dǎo)部分免疫抑制功能[21]，但對于B細(xì)胞中產(chǎn)生的TGF-β到底是來源于Breg還是其他亞群目前仍有爭議。本研究發(fā)現(xiàn)CD19+B細(xì)胞中TGF-βmRNA表達(dá)上調(diào)，與Breg細(xì)胞比例下降的結(jié)果相反。推測可能是分泌TGF-β的其他亞群細(xì)胞在急性期哮喘增加。文獻(xiàn)[22]報(bào)道人類CD5+Breg亞群可以大量分泌TGF-β，遺憾的是本研究未涉及到該群細(xì)胞的分析。因此TGF-β在哮喘患兒Breg功能異常中發(fā)揮的作用還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，Breg細(xì)胞可通過分泌IL-10和表達(dá)共刺激分子直接或間接的抑制效應(yīng)性T細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，維持機(jī)體免疫平衡。Breg細(xì)胞比例降低和功能異?？赡苁菍?dǎo)致急性期哮喘患兒免疫功能異?；罨脑蛑?。

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（收稿日期：2017-03-07） （本文編輯：程旭然）