何一波劉永林李曉芳施麗華彭來君楊正東陳益民

Hematoflow技術(shù)用于白血病篩查及化療療效監(jiān)測臨床價值

何一波1劉永林2李曉芳2施麗華2彭來君2楊正東1陳益民2

目的探討Hematoflow技術(shù)在篩查早期白血病及監(jiān)測化療療效的臨床應(yīng)用價值。方法收集血液科門診及住院患者342例共計455份EDTA-K2抗凝的外周血樣本，應(yīng)用血細胞分析儀、形態(tài)學鏡檢、Hematoflow分類計數(shù)外周血白細胞，計算其相關(guān)性；以形態(tài)學鏡檢法為金標準，評價Hematoflow分類計數(shù)原始細胞的特異性和靈敏度;形態(tài)學鏡檢計數(shù)14例初發(fā)白血病化療前后的骨髓原始細胞，觀察與Hematoflow計數(shù)外周血原始細胞的相關(guān)性。結(jié)果與形態(tài)學鏡檢法相比，Hematoflow、血細胞分析儀分類計數(shù)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞呈現(xiàn)明顯正相關(guān)（r=0.821、0.863、0.845、0.690，0.703、0.882、0.802、0.475，P<0.05）；以形態(tài)學鏡檢法為金標準，原始細胞≥1%為臨界值，Hematoflow法檢出原始細胞的靈敏度為100%，特異性為97.3%，準確度為97.8%；急性白血病患者化療前后骨髓原始細胞的變化值與Hematoflow計數(shù)外周血原始細胞的變化值呈正相關(guān)（r=0.704，P<0.01）。結(jié)論Hematoflow分類計數(shù)外周血白細胞準確、可靠，檢測原始細胞方法學快速、特異、靈敏、自動化，尤其對低白細胞總數(shù)的樣本，在白血病篩查及療效監(jiān)測中具有較高的臨床應(yīng)用價值。

白血??；白細胞分類計數(shù)；Hematoflow技術(shù)；流式細胞術(shù)；血細胞形態(tài)學

白血病是一種臨床常見的惡性腫瘤疾病，目前對其早期篩查主要根據(jù)外周血白細胞分類計數(shù)[1]。血細胞分析儀和形態(tài)學鏡檢法是用于外周血白細胞分類計數(shù)最常見的兩類方法，前者可標準化、自動化，但識別異常白細胞的能力較低[2-5]；后者作為“金標準”，但易受主觀因素的影響，結(jié)果提供信息較少，需要技術(shù)嫻熟的專業(yè)人士操作，不能廣泛應(yīng)用[6-9]。近年來，歐美一種基于cytodiff試劑的快速流式細胞術(shù)Hematoflow的出現(xiàn)可彌補這些不足，同時能分類更多白細胞亞群[10-11]，主要應(yīng)用于敗血癥、中性粒細胞減少癥等疾病診斷及異常白細胞的篩查等[11-13]。目前國內(nèi)相關(guān)報道甚少[14]。本研究通過Hematoflow、形態(tài)學鏡檢和血細胞分析儀法分析342例血液病患者455份外周血樣本，對白細胞分類結(jié)果進行比較，驗證Hematoflow技術(shù)分類計數(shù)外周血白細胞尤其是原始細胞的的可靠性，同時探討其在白血病的篩查及療效監(jiān)測的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象入選病例為2014年7—11月浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液科門診及住院患者共342例，其中急性白血?。ˋL）72例，慢性白血?。–L）47例，骨髓增生異常綜合征（MDS）48例，多發(fā)性骨髓瘤（MM）38例，惡性淋巴瘤（ML）58例，其他血液病79例，診斷標準根據(jù)張之南《血液病診斷及療效標準》[15]。男176例，年齡4～87歲，中位年齡51歲；女166例，年齡1～89歲，中位年齡52歲。

1.2 儀器與試劑LH750全自動血細胞分析儀（美國Beckman公司），F(xiàn)C500流式細胞儀（美國Beckman公司），血細胞分析配套試劑和質(zhì)控物、稀釋液（COULTERCLEZ@DILUENT）、清洗液（COULTERCLENZ）、Cytodiff組合試劑、溶血素、校準微球（Flow-SetPro）和質(zhì)控微球（Flow-Check Pro、Flow-Check）均購自美國Beckman公司。

1.3 手工分類計數(shù)由兩名具有3年以上細胞形態(tài)學工作經(jīng)驗的檢驗師操作，制片后計數(shù)200個白細胞，如果樣本細胞數(shù)不足200個，則計數(shù)全片白細胞，如手工法未檢測到原始細胞而用Hematoflow技術(shù)檢測到原始細胞或白細胞總數(shù)低于0.5×109/L，則由兩名高年資（10年以上）具備形態(tài)學經(jīng)驗的檢驗師復(fù)核。

1.4 血細胞分析儀分類計數(shù)應(yīng)用全自動血細胞分析儀（LH750）測定樣本，測定樣本前使用配套質(zhì)控物進行室內(nèi)質(zhì)控以保證檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，存貯全血細胞計數(shù)和WBC分類計數(shù)的結(jié)果。儀器報警為“原始細胞”或“異常淋巴細胞”的樣本依舊納入此研究。

1.5 Hematoflow分類計數(shù)操作參考廠商的說明書，將Cytodiff組合試劑10μL與全血100μL混勻，室溫避光孵育15～20min，加入溶血素1mL混勻，室溫避光孵育15min，上機。流式細胞儀開機后先使用Flow-Check上機測試，觀察熒光強度FL1-FL5的變異系數(shù)（CV）在要求范圍內(nèi)，如符合要求可檢測樣本。將樣本放入32管進樣轉(zhuǎn)盤中，打開自動分析軟件，調(diào)整設(shè)門策略，設(shè)門策略參考說明書，根據(jù)外周血中各種白細胞表面抗原表達類型不同及熒光強度的差異，結(jié)合不同細胞光散射特點采用多重邏輯設(shè)門的方法將其分開。

1.6 骨髓形態(tài)學與外周血Hematoflow結(jié)果的一致性收集14例急性白血病患者首次就診骨髓常規(guī)結(jié)果，同時收集患者骨髓穿刺當天外周血樣本行Hematoflow檢測。常規(guī)化療后3～4個月，復(fù)檢骨髓常規(guī)及外周血Hematoflow分析。

1.7 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。對三種分類計數(shù)法分別做雙變量Pearson相關(guān)性分析。率的比較用配對四格表資料的χ2檢驗，雙變量對比應(yīng)用配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hematoflow、形態(tài)學鏡檢、全自動血細胞分析儀用于外周血白細胞分類計數(shù)相關(guān)性分析與形態(tài)學鏡檢法相比，計數(shù)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞，Hematoflow法、血細胞分析儀法均呈現(xiàn)明顯正相關(guān)（P<0.05）；計數(shù)嗜堿性粒細胞，Hemato-flow法呈正相關(guān)，而血細胞分析儀法無明顯相關(guān)性；計數(shù)原始細胞，Hematoflow法呈高度相關(guān)（r= 0.953，P<0.05），見表1。

表1 Hematoflow法、血細胞分析儀法（Y）與形態(tài)學鏡檢法（X）相關(guān)性分析

2.2 Hematoflow技術(shù)檢測外周血原始細胞的靈敏度和特異性以原始細胞≥1%為臨界值，形態(tài)學鏡檢為標準，455例樣本共檢出86例原始細胞，陽性率18.9%；Hematoflow檢出原始細胞96例，敏感度為100%，特異性97.3%，準確度為97.8%。見表2。Hematoflow發(fā)現(xiàn)原始細胞而形態(tài)學鏡檢未能發(fā)現(xiàn)共有10例樣本，經(jīng)兩名高年資（10年以上）醫(yī)師復(fù)核，證實其中有7例樣本有原始細胞，另有3例為成熟淋巴細胞。形態(tài)學鏡檢漏檢的7例樣本有5例細胞數(shù)低于0.5×109/L，另2例原始細胞比例分別為2%、3%，提示Hematoflow技術(shù)在白細胞缺乏癥患者中發(fā)現(xiàn)原始細胞有很高的價值，尤其在原始細胞比例較低的情況下更優(yōu)于一般的形態(tài)學鏡檢。

2.350 例WBC<0.5×109/L樣本Hematoflow法、手工鏡檢法檢測原始細胞比較以原始細胞≥1%為臨界值，形態(tài)學鏡檢為“金標準”，50例WBC<0.5×109/L樣本中共檢出原始細胞19例，用Hematoflow法共檢出20例，靈敏度100%，特異性96.78%；手工法共檢出14例，靈敏度73.68%，特異性100%。

2.4 Hematoflow技術(shù)在評估白血病化療療效中的作用對14例急性白血病患者化療前后行骨髓常規(guī)及外周血Hematoflow分析，見表3。化療前后骨髓原始細胞變化值與Hematoflow法檢測外周血原始細胞變化值呈正相關(guān)（r=0.704，P<0.01），見圖1。

表2 Hematoflow法檢測外周血原始細胞靈敏度及特異性分析（例）

3 討論

圖1 白血病患者化療前后骨髓、外周血原始細胞變化值的相關(guān)性

Hematoflow技術(shù)主要用于外周血白細胞分類計數(shù)，可對白細胞進行16亞群分型，對原始細胞及不成熟中性粒細胞有較高的診斷效率，但國內(nèi)相關(guān)報道很少。本研究通過Hematoflow、手工鏡檢、血細胞分析儀法分別對455例外周血白細胞進行分類計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，三種方法檢測結(jié)果呈明顯的正相關(guān)，與手工鏡檢法相比，Hematoflow技術(shù)較血細胞分析儀在各類白細胞分類中相關(guān)性更顯著，尤其原始細胞（r= 0.953，P<0.01），提示Hematoflow在發(fā)現(xiàn)異常白細胞中的作用，這與Jo等[11]報道的結(jié)論一致。由于手工鏡檢操作繁瑣、不易自動化，Hematoflow可彌補這方面的不足，這也使得Hematoflow技術(shù)在白血病的篩查方面有著無限應(yīng)用的前景。在三種方法的比對中，本研究發(fā)現(xiàn)對嗜堿性粒細胞分類，血細胞分析儀法與手工鏡檢法相比無明顯相關(guān)；盡管Hematoflow法結(jié)果有相關(guān)性，但相關(guān)性較弱（r=0.445，P<0.05），可能與外周血嗜堿性白細胞數(shù)量少、比例低有關(guān)。

表3 14例急性白血病患者化療前后Hematoflow及骨髓常規(guī)結(jié)果

以原始細胞≥1%為臨界值，本研究中455例樣本形態(tài)學鏡檢共檢出86例原始細胞，Hematoflow法檢出原始細胞96例，靈敏度為100%。對于該結(jié)果，推測形態(tài)學鏡檢法可能難以計數(shù)到足夠的細胞數(shù)，且白細胞形態(tài)異常明顯，聚集情況嚴重，分類難度高，容易造成原始細胞漏檢及誤判；而Hematoflow技術(shù)是基于細胞免疫標志進行的，在不降低靈敏度的前提下增加對白細胞識別的特異性，并能識別出難以辨認的原始細胞和幼稚細胞。Hematoflow法錯誤分類的3例樣本均為慢性淋巴細胞白血病患者，原因可能與淋巴細胞CD45表達異常減弱有關(guān)，導(dǎo)致CD45 V SS雙參數(shù)圖中淋巴細胞群左移，被錯誤分類為原始細胞。

骨髓常規(guī)檢查是應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病尤其是白血病的重要檢查項目，其原始細胞數(shù)目的變化可以很大程度上反映患者的病程發(fā)展，但骨髓常規(guī)檢查具有創(chuàng)傷性且有諸多禁忌證，無法短期內(nèi)多次檢測。本研究顯示化療前后骨髓原始細胞變化值與外周血Hematoflow檢測的原始細胞變化呈正相關(guān)，提示白血病患者外周血Hematoflow技術(shù)檢測可作為骨髓檢查的一種補充檢驗手段，可適當?shù)販p少骨髓穿刺的次數(shù)，用于化療療效監(jiān)測，但本次研究樣本數(shù)有限仍有待進一步研究證實。

總之，Hematoflow技術(shù)用于分類計數(shù)外周血白細胞穩(wěn)定可靠，檢測原始細胞方法學快速、特異、靈敏度高，且對白細胞減少的標本具有更高的診斷效率，在白血病篩查及療效監(jiān)測具有較高的臨床應(yīng)用價值，在值得進一步推廣和應(yīng)用。

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（收稿：2016-11-10修回：2017-01-13）

Clinical Application of Hematoflow Method to Screening Leukemia and Monitoring Efficacy of Chemotherapy

HE Yibo1,LIU Yonglin2,LI Xiaofang2,SHI Lihua2,PENG Laijun2,YANG Zhengdong1,CHEN Yinmin2.
1 The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310002),China;2 Clinical Laboratory,the First Hosptial Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006)

ObjectiveTo investigate the clinical application of Hematoflow method to screening leukemia and monitoring the effect of chemotherapy.MethodsA total of 455 peripheral blood samples through EDTA-K2 anticoagulation from 342 inpatients and outpatients in Department of Hematology were collected in this study.Leukocytes in these samples were counted with automated hematology analyzer,morphology observation and Hematoflow method,separately,then the correlation among these results was calculated.The specificity and sensibility of Hematoflow method were analyzed and compared to morphology observation as a reference method.Blast cells from 14 patientswith primary leukemia before and after chemotherapy were collected to make a comparison with Hematoflow method.ResultsThe correlation between Hematoflow method,hematology analyzer and morphological observation was good for neutrophils,lymphocytes,monocytes,basophils and eosinophils（r=0.821,0.863,0.845, 0.690,0.703,0.882,0.802,0.473,P<0.05）.When the cutoff value of blast count by Hematoflow method was set at 1%,the sensitivity was 100%,the specificity was 97.3%,and the accuracy was 97.8%,referred to morphological observation（P<0.05）.The correlation between Hematoflow method and bone marrow examination for blasts variation was good in 14 patients undergoing chemotherapy（r=0.704,P<0.01）.ConclusionHematoflow method is accurate and available for leukocyte differential count and has high sensitivity and specificity for blasts differential count, especiallyhaving excellent diagnostic efficiency in the sample of leukopenia.

leukocyte;WBC differential count;Hematoflow method;flow cytometry;morphology

國家中醫(yī)藥管理局科研基金（No.JDZX2015111）

1浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（杭州310002）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院檢驗科（杭州310006）

陳益民，Tel：13906533683；E-mail：cym3338@163com