張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

前列腺癌組織緊密連接蛋白-4表達(dá)及與生化復(fù)發(fā)的關(guān)系

張春霆 劉全啟 徐禮臻 余謙 羅榮利 陳良佑 楊慶 朱再生

目的探討緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在前列腺癌中的表達(dá)及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。方法應(yīng)用S-P法檢測(cè)79例前列腺癌和45例前列腺增生組織Claudin-4表達(dá)狀況，分析其與前列腺癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系，對(duì)前列腺癌隨診結(jié)果采用Kaplan-Meier生存分析5年前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)與Claudin-4表達(dá)之間的關(guān)系；結(jié)果前列腺癌組織和前列腺增生組織Claudin-4表達(dá)陽(yáng)性率分別為64.56%（51/79）和33.33%（15/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。Claudin-4陽(yáng)性表達(dá)在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期分別為46.34%和84.21%，在Gleason評(píng)分＜7分≥7分患者分別為57.14%和72.97%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨訪60個(gè)月內(nèi)生化復(fù)發(fā)45例，復(fù)發(fā)率為56.96%，生化復(fù)發(fā)的患者中Claudin-4表達(dá)陽(yáng)性39例，Claudin-4表達(dá)陰性6例，兩組間生化復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01）。前列腺癌患者PSA結(jié)果進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析顯示Claudin-4陽(yáng)性患者5年生化復(fù)發(fā)率高于陰性表達(dá)患者。結(jié)論前列腺癌組織Claudin-4表達(dá)增高，其異常表達(dá)與前列腺癌臨床分期和Gleason評(píng)分及5年生化復(fù)發(fā)相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)Claudin-4可能有助于前列腺癌預(yù)后評(píng)估。

前列腺癌；Claudin-4；免疫組化；生化復(fù)發(fā)

前列腺癌已成為危害我國(guó)男性健康的疾病之一，前列腺癌起病隱匿，病因未明，多種因素參與前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展。緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在多種腫瘤組織中異常表達(dá)[1-4]，但在前列腺癌中的表達(dá)狀況及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系報(bào)道較少。本研究對(duì)Claudin-4在前列腺癌中的表達(dá)狀況及與前列腺癌臨床病理關(guān)系和5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料提取2005年1月—2015年8月浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除或活檢證實(shí)的前列腺癌患者79例，年齡52～82歲，中位年齡68歲，平均病程（2.0±0.75）年。前列腺癌按照2002年AJCC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期38例。分化程度按照Gleason系統(tǒng)，所有病理標(biāo)本經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師再次證實(shí)。所提取的標(biāo)本收取前患者無(wú)內(nèi)分泌治療、放療及化療。收集同期前列腺增生患者45例，年齡51～83歲，中位年齡69歲，平均病程（2.0±0.5）年。兩組患者年齡、一般資料、病程無(wú)明顯差異，兩組資料有可比性（P>0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法采用Claudin-4兔抗人多克隆抗體和DAB顯色劑（均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，批號(hào)140706）。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶染色法（S-P法）。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，石蠟包埋標(biāo)本，3μm厚組織連續(xù)切片，抗原微波修復(fù)，過(guò)氧化氫清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。依次加一抗（1：100工作濃度）、生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)鏈霉親和素，37℃孵育20min，DAB顯色，顯微鏡下觀察，以PBS液替代一抗作陰性對(duì)照，用已知Claudin-4陽(yáng)性的前列腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定所有結(jié)果均由兩位有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲讀片顯示結(jié)果，所有切片進(jìn)行染色細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度觀察，Claudin-4定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性顆粒呈藍(lán)色。高倍鏡下染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行測(cè)定現(xiàn)陽(yáng)性顆粒數(shù)目，5個(gè)高倍視野下染色細(xì)胞計(jì)數(shù)所占比例分為5級(jí)：<5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，>75%為4分。再按染色強(qiáng)度分為3級(jí)：弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。每切片得分=染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，<2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2或fish確切概率法，隨訪臨床資料采用Kaplan-Meier生存分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-4表達(dá)Claudin-4主要分布在前列腺上皮細(xì)胞膜，在胞質(zhì)和胞核上表達(dá)少，見(jiàn)圖1（封二）。

2.2 Claudin-4蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系Claudin-4蛋白在前列腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，在79例前列腺癌中Claudin-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)51例，陽(yáng)性表達(dá)率為64.56%，在45例前列腺增生組織中陽(yáng)性表達(dá)為15例，陽(yáng)性率33.33%。Claudin-4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與Gleason分級(jí)有關(guān)，在Gleason評(píng)分≤7分和＞7分患者中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.14%（24/ 42）和72.97%（27/37）；在前列腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者Claudin-4蛋白表達(dá)率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），Claudin-4蛋白表達(dá)隨著分化程度加深呈現(xiàn)表達(dá)率上升（P<0.05），見(jiàn)表l。

表1 79例前列腺癌患者Claudin-4表達(dá)與臨床病理及5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系（例）

2.3 Claudin-4蛋白表達(dá)與隨訪前列腺癌患者5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系79例前列腺癌患者60個(gè)月PSA隨訪中，60個(gè)月內(nèi)生化復(fù)發(fā)45例，復(fù)發(fā)率為56.96%，生化復(fù)發(fā)患者中Claudin-4表達(dá)陽(yáng)性39例；Claudin-4表達(dá)陰性28例中60個(gè)月生化復(fù)發(fā)6例，生化復(fù)發(fā)率為21.43%，見(jiàn)表1。兩組間生化復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果可見(jiàn)Claudin-4陽(yáng)性表達(dá)的前列腺癌患者復(fù)發(fā)高于Claudin-4表達(dá)陰性者，見(jiàn)圖2（封二）。

3 討論

Claudins蛋白是構(gòu)成緊密連接的重要組成部分。Claudins在多種上皮來(lái)源的惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，并且與這些腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及生存率有關(guān)[5-7]。研究顯示，Claudins表達(dá)存在差異，Claudins家族中與腫瘤有關(guān)蛋白在同一組織中有的表達(dá)上調(diào)，有的則是表達(dá)下調(diào)或缺失，例如，Claudin-3和Claudin-4在卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，Claudin-7在乳腺癌和頭頸部腫瘤中表達(dá)下降，但是在胃癌中高表達(dá)[8-10]，我們前期基因篩查發(fā)現(xiàn)Claudin-4在前列腺癌中表達(dá)增高，因此，進(jìn)一步研究它是否與前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展及臨床病理相關(guān)以及與前列腺癌5年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫組化方法對(duì)前列腺癌Claudin-4表達(dá)狀況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，在前列腺癌中Claudin-4陽(yáng)性表達(dá)率64.56%，在增生的前列腺組織中Claudin-4陽(yáng)性表達(dá)率33.33%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Claudin-4在前列腺癌中異常表達(dá)可能與前列腺癌發(fā)生有關(guān)；國(guó)外研究[11]顯示，緊密連接蛋白在腫瘤中的作用使E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，引起B(yǎng)-catenin在細(xì)胞內(nèi)聚集，B-catenin/Tif信號(hào)通路激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞黏附力下降，易脫離原發(fā)灶，致周?chē)g質(zhì)、血管、淋巴管及廣泛轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)張曉波等[12]對(duì)雄激素依賴性和非依賴性前列腺癌細(xì)胞差異表達(dá)膜蛋白表達(dá)差異進(jìn)行了研究，對(duì)前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和PC-3中膜蛋白進(jìn)行Western印跡檢測(cè)、串聯(lián)質(zhì)譜分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Claudin-4在LNCaP和PC-3細(xì)胞存在明顯差異，陽(yáng)性表達(dá)率分別為34.3%和72.4%，推測(cè)Claudin-4異常表達(dá)可能在雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Meng等[13]對(duì)睪酮缺乏后小鼠前列腺內(nèi)免疫炎癥因子變化狀況與前列腺疾病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)睪酮通過(guò)調(diào)節(jié)前列腺內(nèi)Claudin-4膜蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響前列腺中炎癥因子繼發(fā)的前列腺疾病，包括前列腺癌；但是在前列腺癌中Claudin-4是否存在上述機(jī)制，Claudin-4蛋白表達(dá)增高如何參與前列腺癌發(fā)生進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程，尚無(wú)充分的證據(jù)報(bào)道。

本研究還對(duì)前列腺癌分化程度和臨床分期與Claudin-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在Gleason評(píng)分＜7分和≥7分患者中Claudin-4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.14%（24/42）和72.97%（27/ 37），在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期Claudin-4蛋白表達(dá)率分別為46.34%（19/41）和84.21%（32/38），表明它的異常表達(dá)可能參與了前列腺癌的進(jìn)展和異常分化；文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)Claudin-4轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)甲基化調(diào)節(jié)減低組蛋白酶H3乙?；饔茫墒菇M蛋白酶H3失活，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。Claudin-4也可經(jīng)蛋白激酶PKC8作用于189蘇氨酸／194絲氨酸位點(diǎn)，使其發(fā)生磷酸化作用而表達(dá)下降，并由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞漿。使得緊密連接蛋白出現(xiàn)松散破壞[15]。因此推測(cè)前列腺癌進(jìn)展中Claudin-4異常表達(dá)可能經(jīng)多種調(diào)節(jié)途徑，引起緊密連接骨架蛋白結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞極性和滲透性改變，瘤細(xì)胞侵襲力增加，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)Claudin-4異常表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，隨訪中C1audin-4陽(yáng)性表達(dá)與前列腺癌5年生化復(fù)發(fā)之間存在相關(guān)性，但是Claudin-4在前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中確切的作用機(jī)制以及以哪種作用方式參與了前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展，尚需要進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-06-22修回：2016-11-03）

Relationships of Expressionof Claudin-4 and Biochemical Recurrence in Prostate Cancer

ZHANG Chunting, LIU Quanqi,XU Lizhen,YU Qian,LUO Rongli,CHEN Liangyou,YANG Qing,ZHU Zaisheng.Department of Urology,Zhejiang University Jinhua Hospital,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the expression of Claudin-4 in prostate cancer tissue and its relationship with biochemical recurrence of prostate cancer.MethodsS-P method was used to detect the expression of Claudin-4 in 79 cases with prostate cancer and 45 cases with benign prostatic hyperplasia,then the relationship between its expression withthe clinical and pathological features was analyzed.Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze 5-year biochemical recurrence in patients and the follow-up results was assessed with the expression of Claudin-4.ResultsThe positive rate of Claudin-4 expression in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was64.56%（51/79）and 33.33%（15/45）,respectively,with a significant different between them（P<0.01）.The positive expression rates of Claudin-4 in tissues at TNM stage I～I(xiàn)I and III～I(xiàn)V were 46.34%and 84.21%and intissues from the Gleason score<7 and≥7 were 57.14%and 72.97%,both with a significant difference（P<0.05）.In a follow-up of 60 months,45 cases hadbiochemical recurrence,with a recurrence rate of 56.96%;among them,39 cases had positive expression of Claudin-4,4 cases with negative Claudin-4 expression;the difference in recurrence rate was statistically significant（P<0.01）.Kaplan-Meier survival analysis showed that Claudin-4-positive expression patients had a higher 5-year biochemical recurrence rate than patients with Claudin-4 negative expression.Conclusion

Claudin-4 expression was increased in prostate cancer,the increase was related to the clinical stage and Gleason score and biochemical recurrence of prostate cancer.Detection of Claudin-4 may contribute to prognosis of prostate cancer.

prostate cancer;Claudin-4;immunohistochemistry;biochemical recurrence

浙江省金華市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013-3-043）

浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科（金華321000）

朱再生，Tel：18267028028；E-mail：zaishengzhu@126.corn