陳樹(shù)兵，劉忠義，李露青，周虹玲，李 雙，3

(1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，浙江 寧波 315012；2.寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，浙江 寧波 315012；3.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定雞肉組織中氯羥吡啶殘留量

陳樹(shù)兵1*，劉忠義2，李露青2，周虹玲2，李 雙2，3

(1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，浙江 寧波 315012；2.寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司，浙江 寧波 315012；3.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定雞肉組織中的氯羥吡啶殘留，樣品經(jīng)乙腈-水提取，冷凍脫脂后，直接以丙酸酐衍生，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS) 進(jìn)行分析，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 模式檢測(cè)。結(jié)果表明，氯羥吡啶在 0.5～40 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，方法的定量下限為5.0 μg/kg，回收率為101.5%～111.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 小于7.7%。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于雞肉組織中氯羥吡啶的快速確證檢測(cè)。

氯羥吡啶；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雞肉

氯羥吡啶(Clopidol)屬吡啶類(lèi)化合物，因其對(duì)球蟲(chóng)病具有較強(qiáng)的抑制作用，而在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用[1-9]。研究表明，在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中貿(mào)然停用該類(lèi)藥物，往往會(huì)導(dǎo)致球蟲(chóng)病爆發(fā)，而連續(xù)或過(guò)量的用藥則會(huì)造成氯羥吡啶在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，并會(huì)隨著食物鏈進(jìn)行蓄積和傳遞[1,6]。氯羥吡啶具有致畸性，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了極大的威脅。隨著人們對(duì)食品安全的日益重視，禽肉產(chǎn)品中藥物殘留的限量要求也日益嚴(yán)格。歐盟以及美國(guó)、日本、中國(guó)均已規(guī)定并不斷修訂各種動(dòng)物組織中氯羥吡啶殘留的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)、加拿大、日本和中國(guó)規(guī)定禽肉組織中氯羥吡啶的殘留限量為5 μg/kg[7-8]。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于氯羥吡啶殘留量的檢測(cè)方法逐漸從難以滿(mǎn)足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外法規(guī)限量要求的、靈敏度低的氣相色譜法、液相色譜法[9-11]，發(fā)展到抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-6,8-9 ]。該類(lèi)方法能夠通過(guò)碰撞能量產(chǎn)生二級(jí)碎片離子，更好地避免了假陽(yáng)性樣品的出現(xiàn)，使檢測(cè)結(jié)果更可靠。現(xiàn)有報(bào)道采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測(cè)定動(dòng)物組織中的氯羥吡啶時(shí)，雖然可以通過(guò)衍生化反應(yīng)增加衍生產(chǎn)物在色譜柱上的保留時(shí)間，但存在前處理過(guò)程復(fù)雜、檢測(cè)效率低等問(wèn)題。如陳迪等[7-8]采用甲醇提取雞肉中氯羥吡啶，需經(jīng)中性氧化鋁柱凈化、氮吹濃縮后，再用丙酸酐衍生?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 9699—2013雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》同樣需堿性氧化鋁柱凈化、氮吹濃縮，然后再用N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷進(jìn)行衍生化處理[12]。

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)不受共流出物的影響，特征母離子和子離子的一一對(duì)應(yīng)性使其具有極強(qiáng)的抗干擾能力，可有效去除其他碎片離子的干擾，提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)通量，解決了GC-MS選擇離子掃描模式(SIM)下存在的離子信息少、靈敏度不高、定性不準(zhǔn)及檢測(cè)通量較低的問(wèn)題，大幅提高了對(duì)殘留分析，特別是復(fù)雜基質(zhì)中殘留物分析的準(zhǔn)確性和檢測(cè)能力。

本研究中樣品采用乙腈-水提取后經(jīng)冷凍除脂，無(wú)需濃縮和固相萃取處理，直接以丙酸酐衍生，結(jié)合GC-MS/MS快速檢測(cè)雞肉中的氯羥吡啶殘留量。與采用固相萃取凈化的方法相比，本方法更加簡(jiǎn)單、快速、靈敏，可以滿(mǎn)足禽類(lèi)產(chǎn)品中該類(lèi)藥物殘留的高通量快速檢測(cè)和確證的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:Agilent 7890/7000C(配EI源,美國(guó)安捷倫公司)。DB-5MS色譜柱( 30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)安捷倫公司)。渦旋混合器(韓國(guó) VisionScientific 公司)。分析天平(德國(guó) Sartorius ME 公司,0.1 mg和0.01 g)。Sigma 33K高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。Milli-Q 高純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore 公司)。

乙腈、正己烷(色譜純，德國(guó) Merck 公司)。丙酸酐(純度≥98%)、吡啶(分析純)、四硼酸鈉(分析純)均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg(精確至0.1 mg) 氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水(3∶2) 溶解并定容至10.0 mL，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光于-20 ℃保存。準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈定容，配成10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，置于4 ℃冰箱保存。

分別準(zhǔn)確移取一定體積的氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，使氯羥吡啶的質(zhì)量為7.5，15.0，30.0，75，150，300，600 ng，添加至稱(chēng)樣后的空白樣品中，按本方法進(jìn)行樣品前處理和衍生后，制得濃度為 0.5，1.0,2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

稱(chēng)取5 g試樣(精確至0.1 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(3∶2)提取溶液，渦旋混勻后定容至15 mL，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，取10 mL上清液于15 mL離心管中，將離心管置于-20 ℃冰箱冷凍15 min，于4 ℃以下15 000 r/min離心5 min，取上清液待衍生。

移取0.50 mL上清液，依次加入4 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、0.50 mL正己烷、25 μL吡啶和50 μL丙酸酐；渦旋混合1 min，4 500 r/min離心5 min，將上層正己烷移入進(jìn)樣小瓶中，供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 GC-MS/MS測(cè)定

1.4.1 色譜條件 色譜柱：毛細(xì)管柱DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度:250 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以 30 ℃/min 升溫至130 ℃，再以8 ℃/min 升溫至300 ℃，保持10 min；載氣：高純氦氣，純度≥99.999%，流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積為1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式為 EI，電離能量 70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線(xiàn)溫度280 ℃；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 正離子模式檢測(cè)，監(jiān)測(cè)離子對(duì)(母離子/子離子)：定量離子對(duì)m/z為191.0/156.09，定性離子對(duì)m/z為191.0/128.0；定量離子對(duì)和定性離子對(duì)的碰撞能量均為15 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

提取雞肉組織中的氯羥吡啶多采用乙腈作為提取溶劑[1-4,6,9]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取溶液僅采用乙腈時(shí)，樣品容易結(jié)團(tuán)，不利于提?。欢崛∪軇┲杏兴嬖跁r(shí)可以有效分散樣品組織。為有效地提取雞肉組織中殘留的氯羥吡啶，分別比較了不同水相比例的乙腈溶劑的提取效果，包括0%，5%，10%，20%，30%，40%和50%水相組成。結(jié)果表明,水相比例在10%～40%時(shí)的提取效率較高且相近，但提取溶劑的乙腈比例較高時(shí)，提取液中脂肪等雜質(zhì)的含量相對(duì)較高，不利于儀器和色譜柱的保護(hù)。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用含有40%水相比例的乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇

經(jīng)乙腈-水(3∶2)提取后的雞肉樣品中含有大量抑制離子化的油脂。已報(bào)道的凈化方法主要采用固相萃取法[1，6，8-9 ]，如氧化鋁柱、硅膠柱等。陳迪等[7-8]采用自裝填氧化鋁層析柱(≥15 g)凈化提取試液，回收率滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，但柱子的填充和整個(gè)凈化過(guò)程繁瑣耗時(shí)。因此，本文采用低溫冷凍除脂，既能有效地去除提取液中的油脂，又大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。實(shí)驗(yàn)分別比較了不同冷凍處理時(shí)間(5，10，15，20，25，30 min)下的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冷凍時(shí)間在15～30 min時(shí)的提取回收率相近，考慮到提高實(shí)驗(yàn)效率和節(jié)約時(shí)間成本，本實(shí)驗(yàn)最終采用低溫冷凍15 min完成除脂。

圖1 氯羥吡啶丙酯的色譜圖及子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Chromatogram and mass spectra of clopidol propyl

2.3 MRM條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)表明氯羥吡啶衍生物氯羥吡啶丙酯的母離子m/z為 191，其特征碎片離子包括：失去1個(gè)Cl離子后的碎裂片段m/z156，以及開(kāi)環(huán)后失去乙烯分子的碎裂片段m/z128[8]。碰撞能量為 15 eV時(shí)響應(yīng)值最高，故以此條件采用 MRM 模式對(duì)氯羥吡啶丙酯進(jìn)行定性和定量分析。子離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

精密量取氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)工作液，使氯羥吡啶的質(zhì)量為0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮?dú)獯蹈珊螅尤?.5 mL乙腈，按照“1.3”部分進(jìn)行衍生化處理，制得濃度分別為0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)工作液，使氯羥吡啶的質(zhì)量為0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮?dú)獯蹈珊螅尤?.5 mL經(jīng)“1.3”方法處理過(guò)的雞肉空白基質(zhì)溶液，按照“1.3”進(jìn)行衍生化處理，制得濃度為 0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。在相同的儀器條件下檢測(cè)，以前者的信號(hào)值為基準(zhǔn)，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)信號(hào)值。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其信號(hào)值的比值均低于80%，說(shuō)明雞肉樣品基質(zhì)對(duì)離子化有明顯的抑制作用。因此，本方法采用基質(zhì)加標(biāo)作工作曲線(xiàn)，樣品的提取和凈化程序能保證雞肉組織中目標(biāo)物質(zhì)氯羥吡啶穩(wěn)定的提取效率，同時(shí)也能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2 雞肉樣品的GC-MS/MS色譜圖Fig.2 GC-MS/MS chromatograms of chicken samplesa:blank sample；b:blank sample spiked at 5.0 μg/kg

2.5 方法的線(xiàn)性范圍、定量下限、回收率及精密度

分別進(jìn)樣測(cè)定濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氯羥吡啶衍生物的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，氯羥吡啶在0.5～40.0 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r2=0.999 4)，其回歸方程為Y=79.07X+0.44。

用空白基質(zhì)加標(biāo)方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。對(duì)雞肉樣品分別進(jìn)行5.0，10，20 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，3個(gè)添加水平的平均回收率為101.5%～111.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～7.7%。本方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，以實(shí)際最低加標(biāo)濃度5.0 μg/kg作為定量下限，能夠滿(mǎn)足動(dòng)物組織中氯羥吡啶殘留監(jiān)控的定量分析要求。雞肉樣品空白基質(zhì)和5.0 μg/kg 水平加標(biāo)的圖譜見(jiàn)圖2。

3 結(jié) 論

本文建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定雞肉組織中氯羥吡啶殘留量的方法，無(wú)需濃縮和固相萃取處理，更加簡(jiǎn)單、快速，且方法靈敏度高，可以滿(mǎn)足日常進(jìn)出口禽類(lèi)產(chǎn)品中該類(lèi)藥物殘留的高通量快速檢測(cè)和確證的要求。

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Determination of Clopidol Residues in Chicken Muscle by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Shu-bing1*,LIU Zhong-yi2,LI Lu-qing2，ZHOU Hong-ling2,LI Shuang2,3

(1.Technical Center of Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningbo 315012,China；2.Ningbo Zhongsheng Product Testing Company，Ningbo 315012,China；3.School of Marine Sciences, Ningbo University，Ningbo 315211,China)

A rapid method was established for the determination of clopidol in chicken by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile-water.The extract was frozen to remove the lipid within,and derivated with propionic anhydride.Then,it was analyzed by GC-MS/MS under MRM mode.The calibration curve for clopidol was linear in the concentration range of 0.5-40 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 4.The limit of quantitation for this method was 5.0 μg/kg.The average recoveries at spiked concentrations of 5.0,10,20 μg/kg ranged from 101.5% to 111.8%,with relative standard deviations less than 7.7%.The method is simple,quick and high sensitive,and could be applied to detect clopidol residues in real samples.

clopidol；gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；chicken

2016-12-12；

2017-01-20

國(guó)家質(zhì)檢總局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.020

O657.71；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0689-04

*通訊作者：陳樹(shù)兵，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：食品農(nóng)產(chǎn)品中污染物分析，Tel：0574-87022808,E-mail:shubingchen@126.com