王少蘋,孫歡歡,張沙沙,高建平,仇麗霞,白云娥(山西醫(yī)科大學藥學院中藥教研室,太原 03000;山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院;通訊作者,E-mail:baiyune@hotmail.com)

不同產(chǎn)地椒目藥材的質(zhì)量評價

王少蘋1,孫歡歡1,張沙沙1,高建平1,仇麗霞2,白云娥1*
(1山西醫(yī)科大學藥學院中藥教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院;*通訊作者,E-mail:baiyune@hotmail.com)

目的 綜合比較10批不同產(chǎn)地椒目藥材的質(zhì)量,為建立椒目質(zhì)量評價體系提供依據(jù)。 方法 建立椒目中α-亞麻酸的氣相色譜(GC)測定方法,同時參照2015版《中國藥典》第四部通則的相關(guān)方法,測定水分、灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、脂肪油的含量,采用聚類分析和t檢驗對10批不同產(chǎn)地椒目藥材進行質(zhì)量評價。 結(jié)果 椒目中水分含量為9.66%-11.55%,灰分含量為5.13%-6.51%,酸不溶性灰分含量為0.11%-0.56%;以干燥品計,椒目浸出物含量為16.77%-24.80%,脂肪油含量為19.82%-28.08%,α-亞麻酸含量為4.06%-6.56%。聚類分析顯示,河南林州、廣西、山西芮城4地及山西盂縣的樣品聚為一類;成都及安徽購買的2批樣品聚為一類。兩類樣品在含水量、灰分、酸不溶性灰及α-亞麻酸含量方面沒有顯著性差異,在浸出物及脂肪油含量方面有顯著性差異,河南林州、廣西、山西芮城4地及盂縣的椒目樣品的浸出物及脂肪油含量較高。 結(jié)論 本次建立的GC測定方法可用于椒目α-亞麻酸的含量測定;椒目多指標的聚類分析結(jié)果,可為合理評價椒目藥材的質(zhì)量提供一定的依據(jù)。

椒目; 聚類分析; 質(zhì)量評價; 氣相色譜法

椒目(Zanthoxyli Semen)為蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)的干燥成熟種子,性寒,味苦、辛,有小毒,入脾、膀胱二經(jīng),具有利水、平喘之功,用于治療水腫脹滿,痰飲喘逆等癥[1]。國內(nèi)外研究表明,椒目仁中富含不飽和脂肪酸,如α-亞麻酸、油酸、亞油酸等[2],其中α-亞麻酸對維持人體生理機能[3]和疾病治療[4,5]有重要作用,結(jié)合山西省藥檢所地方標準提升的要求,以α-亞麻酸作為椒目藥材指標性成分。椒目作為養(yǎng)生保健及醫(yī)藥領(lǐng)域的主要原料,在全國大部分地區(qū)均有分布,但市場上椒目的主流基源為蕓香科植物花椒的干燥成熟種子,本實驗收集的10批椒目均為花椒的干燥成熟種子。椒目的質(zhì)量控制標準僅在山東、上海等地方標準中有關(guān)于性狀、粉末顯微特征及薄層鑒別的收載,徐淑媛等[6]測定了椒目藥材中的浸出物、椒目油總量及α-亞麻酸的含量,但并未對椒目藥材的質(zhì)量進行綜合評價。為了綜合評價市場上椒目藥材的質(zhì)量,本文建立了椒目中α-亞麻酸的氣相色譜測定方法,測定了10批不同產(chǎn)地椒目藥材中α-亞麻酸的含量,同時依據(jù)《中國藥典》[7]方法,測定了水分、灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、脂肪油的含量,并對10批不同產(chǎn)地椒目藥材進行了聚類分析及比較,以期為建立椒目較完善的質(zhì)量評價體系提供依據(jù)。

1 材料

氣相色譜儀(北分瑞利分析儀器有限公司,型號SP-2100);聚乙二醇20000(PEG-20M)毛細管柱(大連市物理化學研究所);電子天平(賽多利斯Sartorius科學儀器(北京)有限公司,萬分之一)。α-亞麻酸標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號:11163-201404);十四酸(上海振譜生物有限公司,克拉瑪爾牌,純度:99.5%);正己烷(天津市大茂化學試劑廠,色譜純);甲苯等均為分析純;椒目藥材10批(各地采集或公司購買),并經(jīng)山西醫(yī)科大學白云娥副教授鑒定均為蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)的干燥種子,樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 水分

分別取椒目粉末(過二號篩)約15 g(n=3),精密稱定,按2015版《中國藥典》四部通則0832中的甲苯法測定椒目含水量，結(jié)果見表2。

表1 椒目藥材采集信息表

Table 1 Information of Zanthoxyli Semen samples

編號產(chǎn)地/購買公司收集時間1河南省林州市2014年9月2四川省成都市2014年9月3廣西2014年9月4山西芮城縣學張鄉(xiāng)2014年9月5山西芮城縣陽城鎮(zhèn)東夭村2014年9月6山西省盂縣2014年9月7安徽精誠本草中藥飲片有限公司2014年12月8安徽精誠本草中藥飲片有限公司2014年12月9山西芮城縣大王鎮(zhèn)坂上村2014年9月10山西芮城縣城關(guān)鎮(zhèn)柴澗村2014年9月

2.2 總灰分及酸不溶性灰分的測定

分別取椒目粉末(過二號篩)4 g(n=3),精密稱定,按2015年版《中國藥典》四部通則2302灰分測定法進行測定，結(jié)果見表2。

2.3 浸出物的測定

分別取椒目粉末(過二號篩)約4 g(n=3),精密稱定,參考文獻[6]及2015版《中國藥典》四部通則2201中的醇冷浸法,以95%乙醇為溶劑進行測定，結(jié)果見表2。

2.4 脂肪油測定

參照2015版《中國藥典》亞麻子質(zhì)量標準及相關(guān)文獻[8-10],分別取椒目粉末(過二號篩)10 g(n=3),精密稱定,置具塞錐形瓶中,加石油醚(60-90 ℃)80 ml,超聲處理30 min,濾過,濾渣再用石油醚60 ml重復處理一次,合并濾液,減壓回收溶劑,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,在水浴上低溫蒸干,于干燥器中干燥24 h,精密稱定,計算,即得。結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地椒目中水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物、脂肪油及α-亞麻酸測定結(jié)果 (%)

Table 2 Contents of water,total ash,acid-insoluble ash,ethanol-soluble extractives,fatty oil and α-linolenic acid in Zanthoxyli Semen from different areas (%)

藥材編號水分灰分酸不溶性灰分浸出物脂肪油藥材中α?亞麻酸110 645 130 1120 4226 035 32211 325 570 1518 3823 295 18310 336 510 5622 2223 314 0649 666 100 4121 9928 085 64510 435 910 2222 9425 275 44610 645 850 2017 7626 505 71711 556 440 2916 7719 824 90810 556 230 1317 0422 836 56911 556 000 2124 0925 875 421011 555 920 1924 8026 605 30

2.5 α-亞麻酸測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

采用聚乙二醇20000(PEG-20 M)毛細管柱(柱長30 m,內(nèi)徑0.25 mm,膜厚度0.5 μm)[11,12],氫氣40 ml/min,空氣400 ml/min,柱溫190 ℃,檢測器溫度250 ℃,進樣口溫度為250 ℃,分流比25 ∶1。在該色譜條件下,分別取空白溶劑、對照品溶液、內(nèi)標[13](十四酸)溶液、供試品溶液進樣,結(jié)果顯示,供試品中α-亞麻酸與內(nèi)標及其他成分分離良好,峰形良好,分離度達到要求(見圖1)。

A．空白溶劑B．對照品C．內(nèi)標D．供試品圖1 空白溶劑、對照品、內(nèi)標、供試品的氣相色譜圖Figure1 GCofblanksolvent，referencesubstance，internalstandardandsamples

2.5.2 溶液的制備 內(nèi)標溶液的制備取十四酸100 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1 ml,置60 ℃水浴加熱30 min,取出,放冷。加入14%三氟化硼甲醇溶液1 ml,置60 ℃水浴加熱20 min,取出,放冷。精密加入正己烷10 ml,充分振搖,加入飽和食鹽水15 ml,搖勻,靜置30 min。取上層續(xù)濾液,作為內(nèi)標溶液。

對照品溶液的制備 取α-亞麻酸對照品150 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1 ml,置60 ℃水浴加熱30 min,取出,放冷。加入14%三氟化硼甲醇溶液1 ml,置60 ℃水浴加熱20 min,取出,放冷。精密加入正己烷10 ml,充分振搖,加入飽和食鹽水15 ml,搖勻,靜置30 min。取上層續(xù)濾液,作為對照品溶液。

供試品溶液的制備取脂肪油70 mg,內(nèi)標10 mg,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液1 ml,置60 ℃水浴中加熱30 min,取出,放冷,加入14%三氟化硼甲醇溶液1 ml,60 ℃水浴中加熱20 min,取出,放冷。精密加入正己烷5 ml,充分振搖,加入飽和食鹽水20 ml,振勻,靜置30 min。取上層續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.5.3 線性范圍考察 精密吸取對照品溶液0.10,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0 ml,內(nèi)標溶液各1.0 ml,分別置5 ml量瓶中,加正己烷稀釋至刻線,充分搖勻,靜置,取1 μl進樣,記錄峰面積。以α-亞麻酸濃度(mg/ml)為橫坐標,以α-亞麻酸峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標,繪制標準曲線。得回歸方程:Y=0.487 1X+0.001 5,r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明,α-亞麻酸在0.304 6-12.184 0 mg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.4 精密度試驗 取樣品1椒目脂肪油70 mg,十四酸10 mg,精密稱定,按2.5.2項供試品溶液的制備,連續(xù)測定6次,記錄峰面積,結(jié)果RSD為0.54%(見表3),表明該儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品1椒目脂肪油70 mg,十四酸10 mg,精密稱定,按照2.5.2項供試品溶液的制備,分別于0,2,4,6,8,10 h時依法測定,RSD為0.83%(見表4),表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 GC法測定α-亞麻酸的精密度試驗結(jié)果

Table 3 Results of precision tests of the determination of α-linolenic acid by GC

序號峰面積α-亞麻酸內(nèi)標比值均值RSD(%)1130919936731 39761 40820 542110841787361 40783130157921381 41264115540822271 40515111450784691 42036119905852901 4058

表4 GC法測定α-亞麻酸的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Table 4 Results of stability tests of the determination of α-linolenic acid by GC

時間峰面積α-亞麻酸內(nèi)標比值均值RSD(%)0h130919936731 39761 41550 832h130157921381 41264h111450784691 42036h125852886561 41968h119478847191 410210h139461973541 4325

2.5.6 重復性試驗 取已知α-亞麻酸含量的脂肪油(樣品1)6份,約70 mg,精密稱定,按2.5.2項供試品溶液的制備,依法測定。結(jié)果顯示,α-亞麻酸含量均值為4.83%,RSD為4.08%(見表5)。表明該方法重復性良好。

表5 GC法測定α-亞麻酸的重復性試驗結(jié)果

Table 5 Results of repeatablilty tests of the determination of α-linolenic acid by GC

序號脂肪油取樣量(g)α-亞麻酸質(zhì)量(g)α-亞麻酸含量(%)均值(%)RSD(%)10 06990 01734 664 834 0820 07000 01744 6830 06980 01865 0240 07000 01854 9850 06980 01865 0260 06990 01714 61

2.5.7 加樣回收率試驗 取已知α-亞麻酸含量的脂肪油(樣品1)5份,約35 mg,精密稱定,采用高、中、低(1 ∶1.2,1 ∶1,1 ∶0.8)的不等量加樣回收率法進行,依次分別精密加入α-亞麻酸對照品及內(nèi)標10 mg。按2.5.2項供試品溶液的制備,依法測定計算,結(jié)果見表6。

表6 α-亞麻酸加樣回收率結(jié)果

Table 6 Results of recovery tests of α-linolenic acid

實驗序號加入α-亞麻酸量(g)脂肪油取樣量(g)測得α-亞麻酸量(g)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)10 00840 03550 0085101 19100 642 7520 00740 03500 007297 3030 00760 03480 0078102 6340 00600 03490 005998 3350 00530 03550 0055103 77

2.5.8 樣品含量的測定 分別取椒目脂肪油70 mg(n=3),內(nèi)標10 mg,精密稱定,按2.5.2項供試品溶液的制備,依法測定,計算藥材中α-亞麻酸含量。結(jié)果見表2。

由表2可知,椒目中水分含量為9.66%-11.55%,灰分含量為5.13%-6.51%,酸不溶性灰分含量為0.11%-0.56%;以干燥品計,椒目中浸出物含量為16.77%-24.80%,脂肪油含量為19.82%-28.08%,α-亞麻酸含量為4.06%-6.56%。

2.6 聚類分析 采用軟件SPSS 22.0,對不同產(chǎn)地的10批樣品中水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物、脂肪油及α-亞麻酸的測定結(jié)果進行聚類分析,結(jié)果見圖2。由系統(tǒng)聚類樹形圖可見,10批樣品可聚為兩類,河南林州、廣西、山西芮城4地、山西盂縣的樣品(編號為1,3,4,5,9,10,6)間的距離較小,質(zhì)量相近,聚為一類(即第一類);成都及安徽購買的2批樣品(編號為2,7,8)間距離較小,質(zhì)量相近,聚為一類(即第二類)。第一類中雖然河南、廣西的椒目與山西的聚為一類,但山西芮城4地(樣品編號為4,5,9,10)間距離更近,表明產(chǎn)地相近的樣品,在水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物、脂肪油及α-亞麻酸方面相近,進一步說明了地域性對椒目質(zhì)量的影響。

對聚類分析結(jié)果的兩大類椒目樣品,進行t檢驗,結(jié)果見表7。結(jié)果顯示,含水量、灰分、酸不溶性灰分及α-亞麻酸含量按α=0.05水準,P>0.05,說明在含水量、灰分、酸不溶性灰分及α-亞麻酸含量方面,兩類樣品沒有顯著性差異;脂肪油和浸出物含量按α=0.05水準,P<0.05,說明在脂肪油和浸出物含量方面,兩類樣品有顯著性差異。綜合表2、圖2、表7結(jié)果可知,從水分、灰分、酸不溶性灰分及α-亞麻酸含量四方面考慮,不同產(chǎn)地的10批椒目樣品的均一性較好;從浸出物及脂肪油含量兩方面考慮,山西芮城4地、盂縣、林州及廣西的椒目樣品(第一類)的浸出物及脂肪油含量較高,而成都、安徽2批的椒目樣品(第二類)較低。

圖2 不同產(chǎn)地椒目的聚類分析Figure 2 Clustering analysis of Zanthoxyli Semen from different areas

表7 兩類椒目各成分含量的t檢驗結(jié)果

Table 7 Comparison of contents between two types of Zanthoxyli Semen by thet-test

指標n x±stP水分含量-1 0260 335 第一類710 68±0 68 第二類311 14±0 52灰分含量-0 5590 592 第一類75 92±0 41 第二類36 08±0 45酸不溶性灰分含量0 830 431 第一類70 27±0 16 第二類30 19±0 09浸出物含量 3 2070 012 第一類722 03±2 37 第二類317 40±0 86脂肪油含量 3 6570 006 第一類725 95±1 46 第二類321 98±1 88α-亞麻酸含量-0 6120 557 第一類75 27±0 56 第二類35 55±0 89

3 討論

3.1 對脂肪油提取工藝的優(yōu)化

采用單因素實驗,分別對脂肪油的提取溶劑(正己烷、石油醚)、料液比(1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10)、提取時間(20，30，40 min)進行了考察,結(jié)果以石油醚為溶劑,料液比為1 ∶8,超聲提取30 min,提取率較高。

3.2 對甲酯化條件的優(yōu)化

在參照2015版《中國藥典》亞麻子質(zhì)量標準及文獻[14-16]的基礎(chǔ)上,對甲酯化的皂化劑量、酯化劑量、酯化時間進行了考察。比較了皂化劑量(1，2，3 ml),酯化劑量(1，2，3 ml)和酯化時間(15，20 min)的甲酯化效果,結(jié)果以0.5 mol/L KOH甲醇溶液1 ml,60 ℃水浴加熱30 min;14%三氟化硼甲醇溶液1 ml,60 ℃水浴加熱20 min為最佳甲酯化條件。

本文建立的GC色譜法,線性、精密度、準確度良好,可以用于椒目藥材中α-亞麻酸的測定,為椒目質(zhì)量標準的建立提供一定的依據(jù)。椒目多指標的聚類分析及t檢驗結(jié)果提示,在含水量、灰分、酸不溶性灰分含量較一致的情況下,從浸出物、脂肪油及α-亞麻酸三方面綜合評價不同產(chǎn)地椒目藥材的質(zhì)量較合理,多指標聚類分析可以為椒目藥材質(zhì)量評價提供參考。評價椒目藥材的質(zhì)量應從多個影響因素綜合考慮,僅考慮一種或幾種有效成分含量的藥材質(zhì)量評價方式,需進一步探討。

致謝:山西醫(yī)科大學藥學院李建寬、張曉霞、張忠鵬老師及2015屆畢業(yè)生張敏、鄒文雋、蔡晶晶、李立文同學;山西藥科職業(yè)學院蔡翠芳老師;山西省食品藥品檢驗所張彬、史憲海、張俊鳳、崔宇宏等老師在實驗中給予的幫助,在此一并表示感謝!

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Quality evalution of Zanthoxyli Semen from different areas

WANG Shaoping1,SUN Huanhuan1,ZHANG Shasha1,GAO Jianping1,QIU Lixia2,BAI Yune1*
(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SchoolofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:baiyune@hotmail.com)

ObjectiveTo compare the quality of 10 batches of Zanthoxyli Semen from different areas roundly,and to provide the basis for establishing the quality evaluation system.MethodsThe gas chromatography(GC) method was established to determine the content of α-linolenic acid.The contents of water,ash,acid-insoluble ash,alcohol-soluble extractives and fatty oil were determined according to the methods in the General Principle of the Fourth Part of Chinese Pharmacopeia(2015 edition).Meanwhile,the determination results were used for cluster analysis.ResultsThe contents of water,total ash and acid-insoluble ash of 10 batches of samples varied in the range of 9.66%-11.55%,5.13%-6.51%,0.11%-56%,respectively.The contents of ethanol-soluble extractives,fatty oil and α-linolenic acid in dried Zanthoxyli Semen varied in the range of 16.77%-24.80%,19.82%-28.08%,4.06%-6.56%,respectively.The hierarchical-cluster analysis showed that samples were clustered into two groups.Samples from Linzhou in Henan,Ruicheng and Yuxian in Shanxi were clustered into one class,and the other samples from Chengdu and Anhui were clustered into the other class.Thet-test showed that the contents of water,total ash,acid-insoluble ash and α-linolenic acid had no statistical difference between two groups,but the contents of ethanol-soluble extractives and fatty oil showed statistical difference.The contents of ethanol-soluble extractives and fatty oil in samples from Linzhou in Henan,Ruicheng and Yuxian in Shanxi were higher.ConclusionThe GC method established in this study can be used to determine the contents of α-linolenic acid.Multi-index cluster analysis can provide a certain basis for comprehensive evaluation of the quality of Zanthoxyli Semen.

Zanthoxyli Semen; cluster analysis; quality evaluation; gas chromatography

山西省中藥材、中藥飲片地方標準研究(2014001A)

王少蘋,女,1989-05生,在讀碩士,E-mail:wsp519289866@163.com

2017-02-21

R927.11

A

1007-6611(2017)05-0445-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.009