楊曉寰

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 汕頭 515041)

松果菊苷對人肝癌細胞HepG2生長和縫隙連接細胞通訊的影響※

楊曉寰

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 汕頭 515041)

目的 觀察松果菊苷(ECH)對人肝癌細胞HepG2生長和縫隙連接細胞通訊(GJIC)的影響。方法 Alamar Blue法繪制HepG2細胞生長曲線，并檢測ECH的細胞毒作用；劃痕標記染料示蹤技術(shù)(SL/DT)法觀察空白對照組、API陽性對照組、AGA陰性對照組和ECH組對GJIC的影響；異硫氰酸熒光素(FITC)間接免疫熒光法觀察ECH對縫隙連接蛋白Cx43表達的影響。結(jié)果 HepG2細胞在20 000個/mL的細胞密度Alamar Blue還原率與時間有線性關(guān)系。ECH(5、10、20、40和80 μM)處理HepG2細胞24 h，細胞存活率分別為(92.69±3.35)%、(88.33±2.12)%、(80.97±2.50)%、(76.95±1.40)%和(69.09±1.11)%(P<0.01)。抑制率最高(80 μM濃度下)為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。SL/DT顯示陽性對照芹黃素和ECH處理24 h后，熒光染料在劃痕外4列細胞出現(xiàn)了明顯熒光(++++)，說明細胞出現(xiàn)染料傳輸?shù)默F(xiàn)象。間接免疫熒光法對Cx43表達進行計分，空白對照組細胞得分為(1.40±0.55)分，ECH組得分為(1.60±0.55)分。結(jié)果表明ECH組的Cx43表達增強不明顯。結(jié)論 ECH對HepG2細胞有細胞毒作用，同時可增強GJIC功能，但Cx43表達不明顯，為ECH抗腫瘤機制提供依據(jù)。

肝腫瘤，實驗性;病理學(xué);皂苷類；基因表達；細胞間通訊

惡性腫瘤是現(xiàn)今全世界最主要的發(fā)病和致死原因，每年癌癥新發(fā)病例約1 400萬，死亡約800萬，2015年因癌癥死亡人數(shù)占全球死亡數(shù)的1/6，造成男性死亡的5種最常見癌癥依次為肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌，造成女性死亡的5種最常見癌癥依次為乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌及胃癌，我國新發(fā)癌癥病例和死亡人數(shù)均居世界首位[1]。如何有效防治惡性腫瘤仍然是當前研究的熱點。縫隙連接(gap junction,GJ)是相鄰細胞間作用的直接通道?？p隙連接細胞通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是指直徑<1.5 nm、分子量<1 kDa的小分子物質(zhì)或水溶性的細胞代謝物能通過縫隙連接通道進行物質(zhì)和能量交換，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等生命活動。腫瘤形成的一個重要原因在于相鄰的腫瘤細胞間及腫瘤細胞與相鄰正常細胞間出現(xiàn)的縫隙連接功能的異?；蛉笔2]。中醫(yī)藥具有毒副作用少的優(yōu)點，肉蓯蓉具有補益機體陽氣，提高腫瘤患者機體免疫力的作用[3]。本研究觀察了肉蓯蓉的主要活性成分松果菊苷(ECH)對HepG2細胞的增殖抑制作用和對腫瘤細胞縫隙連接功能的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 ECH為中國藥品生物制品檢定所的對照品，18-α甘草酸(AGA)和芹黃素(API)為Sigma公司產(chǎn)品，以上純度均>98%(高效液相色譜法)。Alamar Blue為AbD公司產(chǎn)品，細胞培養(yǎng)液RPMI-1640和0.25%含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶的消化液為GIBCO公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。ECH經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)助溶后用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成2 mM，調(diào)pH為7.2，0.22 μm過濾除菌，分裝保存，于1個月內(nèi)使用。以上藥物在培養(yǎng)體系中溶劑濃度不超過1%。HepG2購自中山大學(xué)實驗動物中心細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng) HepG2 37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細胞生長曲線的繪制 收獲對數(shù)生長期的細胞，分別按每孔2 500、5 000、10 000、20 000、25 000和50 000個/mL的細胞濃度接種入96孔板培養(yǎng)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。每孔加入20 μL Alamar Blue，用酶標儀分別測定570、630 nm波長的吸收值，計算Alamar Blue還原率。以還原率為縱坐標，細胞培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.4 細胞毒實驗(Alamar Blue法) 收獲對數(shù)生長期的細胞，按照每孔4 000個細胞接種入96孔板培養(yǎng)24 h后分別加ECH 0、5、10、20、40和80 μM培養(yǎng)。每孔加入20 μL Alamar Blue，24、48和72 h時用酶標儀分別測定570、630 nm波長的吸收值，計算每個濃度及時間段存活率。以存活率為縱坐標，藥物濃度為橫坐標，計算藥物IC50值。

1.5 劃痕標記染料示蹤技術(shù)(scrape-loading dye transfer assay,SL/DT)檢測ECH對HepG2細胞GJ功能的影響 細胞按0.8×106個/孔接種到六孔板中，分為空白對照組、API陽性對照組、AGA陰性對照組和ECH組，藥物孵育36 h后用PBS沖洗3遍并吸凈。l mL 0.1%羅氏黃染液加入培養(yǎng)皿后用薄手術(shù)刀片劃痕5道，5 min后吸凈染液并用PBS沖洗3遍吸凈，置于熒光顯微鏡下觀察，通過觀察染色的鄰近細胞距離進行半定量檢測。若熒光僅在劃痕旁1列細胞則為(-)；熒光擴散到劃痕旁2列細胞即為(+)；熒光擴散到劃痕旁3列細胞即為(++)；熒光擴散到劃痕旁4列細胞即為(+++)；熒光擴散到超過劃痕旁4列細胞即為(++++)。

1.6 異硫氰酸熒光素(FITC)間接免疫熒光法檢測ECH對HepG2細胞Cx43的表達 細胞培養(yǎng)于24孔板中，80 μM的ECH作用24 h后固定和染色。具體如下：PBS沖洗3次，4%甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗10次，50 g/L血清白蛋白(BSA)封閉30 min，吸去多余水分，滴加兔抗鼠Cx43 Ⅰ級抗體覆蓋抗原標本，過夜后，PBS沖洗10次，暗室中滴加1∶100稀釋的FITC-兔抗山羊IgG Ⅱ級抗體，濕盒內(nèi)2 h后吸去多余水分。用熒光顯微鏡在藍色激發(fā)光下觀察，200倍視野下每個樣本隨機抽取5～7個進行盲法攝像和盲法評分，根據(jù)熒光是否表達及亮度分為(-)～(++++)，(+)記1分，(++)記2分，以此類推。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 14.0軟件進行分析，多組間的比較用One-Way ANOVA和LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2細胞生長曲線 算出HepG2細胞在不同細胞濃度和時間段的Alamar Blue還原率并做圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2在20 000個/mL的密度培養(yǎng)24～72 h間還原率與時間有線性關(guān)系，得出此體系最優(yōu)化的培養(yǎng)密度和時間是20 000個/mL的密度培養(yǎng)3 d。見表1、圖1。

表1 HepG2不同時間和密度的還原率 mean,n=5

圖1 HepG2生長曲線圖

2.2 ECH對HepG2細胞毒作用 采用Alamar Blue法檢測ECH對HepG2的細胞毒作用。結(jié)果顯示，ECH作用24 h開始鏡下可見40 μM和80 μM組的細胞明顯減少，尤其在80 μM組僅見散在貼壁細胞，存活率為(69.09±1.11)%(P<0.01)。80 μM下ECH對細胞抑制率最高，為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。見表2、圖2、圖3。

表2 ECH對HepG2的作用mean±SD,n=5

圖2 ECH對HepG2細胞毒作用鏡下觀察(24 h)

圖3 ECH對HepG2的細胞毒作用曲線圖

2.3 SL/DT檢測ECH對GJIC的影響 劃痕后羅氏黃負載5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，AGA陰性對照組未見熒光(-)，空白對照組熒光出現(xiàn)在劃痕旁1～2列細胞中且亮度低，說明GJIC功能差；而API陽性對照和ECH處理24 h后，熒光均擴散到劃痕以外的3～4列細胞，熒光強度為強陽性(++++)，說明細胞GJIC明顯增強。見表3、圖4。

圖4 各藥物處理后HepG2細胞間熒光染料傳輸功能變化(×100)

組 別熒光強度空白對照組±AGA陰性對照組-API陽性對照組++++ECH組++++

2.4 FITC法檢測Cx43表達情況 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白組的熒光強度一般，Cx43的表達評分為(1.40±0.55)，ECH組細胞中熒光主要集中在細胞質(zhì)和細胞膜上，Cx43的表達評分為(1.60±0.55)。結(jié)果表明ECH組的Cx43表達增強不明顯。見表4、圖5。

圖5 ECH對HepG2細胞Cx43表達的影響

組 別++++++++++平均分值對照組32001．40±0．55ECH80μM23001．60±0．55

3 討 論

縫隙連接是細胞間直接進行信息交換的重要通道，GJIC的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。相鄰細胞膜上的連接子(connexon)對接形成跨膜通道，每個連接子由6個連接蛋白(connexin，Cx)組成?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌等多種癌變組織和細胞株中均可檢測到Cx表達的異常?；謴?fù)腫瘤細胞的GJIC功能成為目前研究腫瘤防治的熱點。

中醫(yī)學(xué)認為，癌瘤的病機是本虛標實，機體正氣內(nèi)虛為本，痰濁、氣滯、血瘀等病理產(chǎn)物為標，虛實夾雜，凝聚而為腫塊。因此，腫瘤的治療注重補益藥的應(yīng)用。臨床上常用補益中藥提高患者抵抗力，但是否具有直接抗腫瘤作用及其機制尚未明確。據(jù)報道，一些補陽中藥的提取物如冬蟲夏草[4]、巴戟天[5]等，具有體外抗腫瘤作用。補陽中藥的活性物質(zhì)也有報道對腫瘤細胞有直接細胞毒作用，如補骨脂素[6]、蟲草素[7]、靈芝多糖[8]和淫羊藿苷[9]等。

肉蓯蓉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味甘、咸，歸腎、腸經(jīng)，具有補腎壯陽、潤腸通便的作用。臨床上常用于治療陽氣虛衰所致的腰膝痠軟、陽萎早泄、宮寒不孕以及腸燥便秘等癥?，F(xiàn)代研究表明，肉蓯蓉具有補腎壯陽、改善記憶力、利尿通便、抗疲勞和抗輻射等作用[3]。

ECH是肉蓯蓉的主要活性成分，是一種多酚物質(zhì)。目前報道ECH的藥理作用主要是神經(jīng)保護[10-12]、抗衰老[13-14]、清除自由基[15]、保護血管內(nèi)皮細胞[16-17]、促進造血功能[18]和促進成骨[19-20]等。也有報道ECH誘導(dǎo)胰腺癌等腫瘤細胞凋亡[21-22]，但對腫瘤細胞GJIC的影響研究較少。

Alamar Blue還原法是一種定量檢測細胞活力的新方法，具有敏感、操作簡便、快速及并能連續(xù)監(jiān)測的優(yōu)點。其主要原理是Alamar Blue能被生長良好的細胞攝入，細胞內(nèi)的還原環(huán)境將其變?yōu)榧t色，而生長抑制的細胞維持的氧化環(huán)境則使其保持原有的藍色。檢測2個顏色波長吸光度則可計算出Alamar Blue的還原率，從而定量細胞的活力。由于Alamar Blue對活細胞沒有毒性，因此可用于連續(xù)測定不同時間段各密度細胞的吸光值，根據(jù)其還原率繪制生長曲線。本實驗發(fā)現(xiàn)ECH作用24 h開始鏡下40 μM和80 μM組的細胞明顯減少，尤其在80 μM組僅見散在貼壁細胞，80 μM下ECH對細胞抑制率為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。說明ECH對HepG2有體外細胞毒作用，提示ECH具有體外直接抗腫瘤作用。

SL/DT的原理在于通過劃痕法使單層培養(yǎng)的細胞膜上出現(xiàn)短暫的裂痕(這種裂痕既不影響細胞的存活，亦不影響其分化能力)，熒光染料羅氏黃可通過裂痕進入細胞，在熒光顯微鏡下觀察羅氏黃染液所發(fā)出的黃色熒光向鄰近細胞間的傳遞而用于表示間隙連接細胞間通訊功能。API為GJ增效劑，AGA為GJ的長效抑制劑。SL/DT結(jié)果顯示，空白對照組細胞的熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕旁1～2列細胞中而且亮度低(±)，細胞間染料傳輸功能差；經(jīng)陽性對照API和ECH處理24 h后，熒光染料不僅出現(xiàn)在劃痕的附近細胞內(nèi)，而且在劃痕以外的3～4列細胞內(nèi)也出現(xiàn)了明顯熒光(++++)。說明出現(xiàn)了細胞間染料傳輸?shù)默F(xiàn)象，說明細胞的間隙連接通訊功能獲得增強。HepG2細胞分別經(jīng)陰性對照AGA處理24 h后，熒光染料出現(xiàn)在劃痕旁1列細胞且亮度比對照組低(-)。說明無細胞間染料傳輸?shù)默F(xiàn)象，細胞的間隙連接通訊功能得到抑制。

鏡下觀察，各組均有Cx43的表達的陽性細胞，但其中空白對照組的熒光強度一般，各用藥組細胞中熒光主要集中在細胞核外的胞漿或胞膜上。本實驗在盲法攝取圖象后，采用盲法評分，根據(jù)熒光表達的亮度分為(+)、(++)、(+++)、(++++)4個等級，具體標準由觀察者掌握，其中(+)記1分，(++)記2分，如此類推。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照組細胞得分為(1.40±0.55)，ECH組得分為(1.60±0.55)。結(jié)果表明ECH的Cx43表達增強不明顯，其中的Cx43部分錯誤定位在細胞質(zhì)上。其明顯的GJIC功能可能是通過其他Cx的表達形成的縫隙連接通道實現(xiàn)的，關(guān)于ECH體外直接抗腫瘤是否通過凋亡實現(xiàn)及其增強GJIC的機制均有待進一步實驗證明。

[1] McGuire S. World Cancer Report 2014. Geneva,Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015[J].Adv Nutr,2016,7(2):418-419.

[2] Cronier L, Crespin S, Strale PO, et al.Gap junctions and cancer: new functions for an old story[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(2):323-338.

[3] 胡佳琦，馮佳媛.肉蓯蓉的化學(xué)成分和藥理作用[J].中醫(yī)臨床研究，2012，4(15)：26-28.

[4] 陳家念，張璇，蔡豪斌，等.冬蟲夏草菌絲體水提醇沉物體外抗腫瘤活性研究[J].藥物評價研究，2014，37(2)：108-112.

[5] 張學(xué)新，肖柳英，潘競鏘.巴戟天對小鼠腫瘤細胞增殖及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響[J].中藥材,2011,34(4):598-601.

[6] 譚敏，孫靜，趙虹，等.補骨脂素對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞體外作用的比較研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,26(4):359-362,427.

[7] 蔡偉，葉青，唐亮，等.蟲草素對結(jié)腸癌細胞體外增殖、遷移能力的影響及其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2011,5(14):4048-4054.

[8] Liang ZE，Yi YJ，Guo YT，et al. Inhibition of migration and induction of apoptosis in LoVo human colon cancer cells by polysaccharides from Ganoderma lucidum[J].Mol Med Rep,2015,12(5):7629-7636.

[9] Fan C, Yang Y, Liu Y, et al. Icariin displays anticancer activity against human esophageal cancer cells via regulating endoplasmic reticulum stress-mediated apoptotic signaling[J].Sci Rep,2016,6:21145.

[10] Zhao Q, Yang X, Cai D, et al. Echinacoside Protects Against MPP(+)-Induced Neuronal Apoptosis via ROS/ATF3/CHOP Pathway Regulation[J]. Neurosci Bull,2016,32(4):349-362.

[11] 馬婧怡，張萬鑫，陳虹，等.松果菊苷對血管性癡呆大鼠氧化應(yīng)激損傷的保護作用[J].中國藥理學(xué)通報,2014,30(5):638-642.

[12] Zhang J, Zhang Z, Xiang J, et al.Neuroprotective Effects of Echinacoside on Regulating the Stress-Active p38MAPK and NF-κB p52 Signals in the Mice Model of Parkinson's Disease[J].Neurochem Res,2017,42(4):975-985.

[13] 李媛，宋媛媛，張洪泉.松果菊苷對衰老小鼠免疫功能和線粒體DNA相對含量的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2010,26(6):810-813.

[14] Xie H, Zhu H, Cheng C, et al. Echinacoside retards cellular senescence of human fibroblastic cells MRC-5[J].Pharmazie,2009,64(11):752-754.

[15] 劉春麗，陳虹，姜勇，等.松果菊苷對血管性癡呆大鼠行為學(xué)、氧自由基以及膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)代謝速率的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2013,29(7):1035-1036.

[16] 王毓杰，康云雪.松果菊苷和麥角甾苷對血管內(nèi)皮細胞EA.hy926的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用[J].中成藥,2016,38(10):2244-2248.

[17] 李歡，宋安齊，薛嘉虹，等.松果菊苷對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2013,34(3):387-392.

[18] Wang S, Zheng G, Tian S，et al. Echinacoside improves hematopoietic function in 5-FU-induced myelosuppression mice[J].Life Sci,2015,123:86-92.

[19] 田原，邸陽，包翠芬，等.松果菊苷含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及BMP2表達的研究[J].中藥藥理與臨床,2015,31(4):60-64.

[20] Yang X, Li F,Yang Y,et al. Efficacy and safety of echinacoside in a rat osteopenia model[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013:926-928.

[21] Wang W, Luo J, Liang Y，et al. Echinacoside suppresses pancreatic adenocarcinoma cell growth by inducing apoptosis via the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Mol Med Rep,2016,13(3):2613-2618.

[22] Dong L, Wang H, Niu J，et al. Echinacoside induces apoptotic cancer cell death by inhibiting the nucleotide pool sanitizing enzyme MTH1[J].Onco Targets Ther,2015,8:3649-3664.

(本文編輯：董軍杰)

Effects of echinacoside on growth and gap junctional intercellular communication in HepG2 of human hepatoma carcinoma cell

YANGXiaohuan.

DepartmentoftraditionalChinesemedicine,theFirstHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShantouUniversity,Guangdong,Shantou515041

Objective To observe the effects of echinacoside (ECH) on growth and gap junctional intercellular communication (GJIC) in HepG2 of human hepatoma carcinoma cell. Methods The cytotoxicity of ECH was detected through draw the growth curve of HepG2 cells by Alamar Blue method. The effects of blank group, API positive control group, AGA negative control group and ECH group on GJIC were observed by scrape-loading dye transfer assay(SL/DT). The effect of EHC on expression of Cx43 protein was observed by flourescein isothiocyanate(FITC)indirect immunofluorescence assay. Results There was a liner correlation in alamar blue reduction rate and time of HepG2 cells under 20 000/mL cell density. The HepG2 cells were conducted by EHC (5,10,20,40 and 80 μM)for 24 h ,and the survival rates of cells were (92.69 ± 3.35)%, (88.33 ± 2.12)%, (80.97 ± 2.50)%, (76.95±1.40)% and (69.09±1.11)%(P<0.01). The highest inhibition rate (under 80 μM concentration) was 30.91%. IC50 was 467.8 μM (368.3 μg/mL). The apigenin and ECH were conducted after treatment 24 h, the SL/DT showed positive control, and fluorescent dyes showed obvious fluorescence (++++) in the scratches outside four cells, which indicated the cells appear the phenomenon of dye transfer. The expression of Cx43 was scored by indirect immunofluorescence assay. The score of blank control group was (1.40 ± 0.55) and the score of ECH group was (1.60 ± 0.55). Conclusion ECH had cytotoxic effect on HepG2 cells, and can enhance GJIC function, but the expression of Cx43 was not obvious, which provide the basis for the anti-tumor mechanism of ECH.

Liver tumor; Experimental; Pathology; Saponins class; Gene expression; Intercellular communication

※ 項目來源：汕頭大學(xué)(醫(yī)學(xué)院)創(chuàng)新強校工程人才培育項目

楊曉寰(1979—)，女，副主任中醫(yī)師，博士。從事中醫(yī)內(nèi)科臨床及基礎(chǔ)研究。

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.04.024

R-332;R282.710.5;R735.7；R329.25

A

1002-2619(2017)04-0579-06

2017-01-17)