常春龍，王士霞，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛多殺性巴氏桿菌菌影的制備

常春龍，王士霞，翟軍軍，倪宏波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

試驗(yàn)以pHH43質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增含噬菌體PhiX174裂解基因E和CI857-PL-PR溫控系統(tǒng)的溫敏裂解盒CI857-PL-PR-E，再將該裂解盒插入到pPBA1100穿梭載體中，構(gòu)建裂解質(zhì)粒pPBA1100-E。利用細(xì)菌接合轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入牛多殺性巴氏桿菌中，通過溶菌動力學(xué)試驗(yàn)檢測裂解質(zhì)粒pPBA1100-E對牛多殺性巴氏桿菌的裂解效果并計(jì)算裂解效率。結(jié)果表明成功構(gòu)建了裂解質(zhì)粒pPBA1100-E，并將其成功地轉(zhuǎn)入到牛多殺性巴氏桿菌中，溶菌動力學(xué)試驗(yàn)說明裂解質(zhì)粒pPBA1100-E在牛多殺性巴氏桿菌中具有很高的溶菌效率，裂解效率為99.997%。因此，試驗(yàn)成功地制備了牛多殺性巴氏桿菌菌影，為進(jìn)一步成功研制牛多殺性巴氏桿菌菌影疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

牛多殺性巴氏桿菌；菌影；裂解效率

牛巴氏桿菌病是由牛多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P.multocida）感染引起的一種急性、熱性、敗血性傳染病，具有發(fā)病急、傳染快、危害大的特點(diǎn)，是嚴(yán)重危害我國乃至世界養(yǎng)牛業(yè)的重大疾病[1]。疫苗接種是防控該病最好的方法[2]，目前主要的疫苗有滅活苗和弱毒苗，由于弱毒苗在制備過程中某些蛋白的缺失導(dǎo)致免疫原性有所降低，所以傳統(tǒng)的全菌體滅活疫苗存在著免疫效果不理想的問題[3]；活菌苗雖然免疫原性好，免疫力產(chǎn)生快，生產(chǎn)成本低，但免疫期短、容易毒力返祖、安全性差、可引起注射部位局部壞死[4-5]。因此，研制一種安全高效的的巴氏桿菌疫苗一直是科研工作者不懈追求的目標(biāo)，這對控制牛巴氏桿菌病具有極其重要意義。

細(xì)菌菌影技術(shù)是近年來興起的一種新型疫苗技術(shù)，適用于大部分的革蘭氏陰性菌，它利用噬菌體phi X174裂解基因在細(xì)胞膜上形成特異性跨膜孔道，并通過滲透壓作用排出胞質(zhì)內(nèi)含物，從而形成的完整細(xì)菌空殼[6-7]。它完整的保留了細(xì)菌表面抗原的天然結(jié)構(gòu)，可以有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，同時(shí)由于不含有任何的胞質(zhì)內(nèi)容物和核酸，因此比弱毒疫苗和滅活疫苗更安全可靠[8-9]，目前的研究已經(jīng)表明，菌影既可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又可以產(chǎn)生細(xì)胞免疫，因此是一種非常理想的新型細(xì)菌疫苗體系[10-12]。研究擬利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建含有溫敏裂解盒CI857-PL-PR-E的高效轉(zhuǎn)化和裂解的穿梭質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上制備高質(zhì)量的多殺性巴氏桿菌菌影，以期為多殺性巴氏桿菌菌影疫苗的制備和工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行良好的技術(shù)儲備，為牛巴氏桿菌病的防控提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E.coli DH5α購自BM公司，多殺性巴氏桿菌（血清型為B∶2）、pHH43質(zhì)粒（含有裂解基因和溫控原件）、pPBA1100質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、DNA5000Marker、DNA2000 Marker均購自TaKaRa公司；BamH I、ScaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自thermo Scientific公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 裂解盒的擴(kuò)增

根據(jù)pHH43質(zhì)粒的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增裂解盒，即溫控原件和裂解基因E。上游引物CI857-UP：CC GAGCTC TCA GCC AAA CGT CTC TTC AGG，下游引物CI857-DN：CG GGATCC TCA CTC CTT CCG CAC GTA ATT，由Invitrogen（上海）公司合成，并在上、下游引物5'端分別引入了SacⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以pHH43質(zhì)粒為模板擴(kuò)增裂解盒，PCR反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min；94℃熱變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。

1.2.2 穿梭質(zhì)粒pPBA1100-E的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切法將上述擴(kuò)增的裂解盒連接到廣宿主質(zhì)粒pPBA1100中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的平板，37℃培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中增菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，然后送至哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，將測序正確重組質(zhì)粒命名為pPBA1100-E。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPBA1100-E通過接合轉(zhuǎn)入多殺性巴氏桿菌B∶2菌株

按照文獻(xiàn)[13]的方法將制備的含有重組質(zhì)粒pPBA1100-E的大腸埃希菌E.coli DH5α，通過接合生殖的將pPBA1100-E轉(zhuǎn)入牛多殺性巴氏桿菌，通過分別對裂解盒基因和多殺性巴氏桿菌的特異性基因進(jìn)行菌落PCR后，鑒定為陽性的菌落，即為多殺性巴氏桿菌接合子。

1.2.4 裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的溶菌動力學(xué)試驗(yàn)

將含有溶菌質(zhì)粒pPBA1100-E的牛多殺性巴氏桿菌和不含有溶菌質(zhì)粒的牛多殺性巴氏桿菌分別在37℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.4左右，然后將含有溶菌質(zhì)粒的牛多殺性巴氏桿菌菌液分為兩組，一組繼續(xù)留在37℃中培養(yǎng)，作為對照組1，另一組將培養(yǎng)溫度升至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)；將不含溶菌質(zhì)粒的牛多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)溫度也升至42℃，作為對照組2，每隔1 h取樣檢測培養(yǎng)物OD600nm吸光度值，觀察細(xì)菌的裂解水平，直至OD600nm的吸光度值不再下降為止。

1.2.5 菌體裂解率的計(jì)算

將升溫誘導(dǎo)之前和誘導(dǎo)結(jié)束后的菌液分別用無菌PBS進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋，均勻涂布于含有100 μg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，每板100 μL，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，分別計(jì)算誘導(dǎo)前細(xì)菌數(shù)和誘導(dǎo)后細(xì)菌數(shù)。裂解效率=（1－誘導(dǎo)之后CFU/誘導(dǎo)之前CFU）×100%。

2 結(jié)果

2.1 裂解盒CI857-PL-PR-E的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以pHH43質(zhì)粒為模板擴(kuò)增裂解盒，結(jié)果如圖1所示，在1 429 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

裂解盒的PCR擴(kuò)增結(jié)果和酶切鑒定結(jié)果如圖2.2，結(jié)果說明裂解盒CI857-PL-PR-E成功插入pP BA1100載體中。

圖1 裂解盒的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1The result of amplification of lysis cassettes by PCR

圖2 裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2The identify results of lysis plasmid pPBA1100-E by PCR and double digestion

2.3 接合試驗(yàn)鑒定結(jié)果

從接合的多殺性巴氏桿菌B∶2菌株中擴(kuò)增得到約457 bp的多殺性巴氏桿菌特異性片斷和約1 429 bp的裂解盒片段（圖3），證明溶菌質(zhì)粒pPBA1100-E成功轉(zhuǎn)化入多殺性巴氏桿菌B∶2菌株中。

2.4 裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的溶菌動力學(xué)試驗(yàn)

溶菌動力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，含裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的牛多殺性巴氏桿菌在42℃誘導(dǎo)2 h后，菌液OD600nm值達(dá)到最高，隨后逐漸降低；對照組1菌液OD600nm值初期呈上升趨勢，后期趨于平穩(wěn)；對照組2菌液OD600nm值初期呈上升趨勢，后期略有下降。

圖3 接合試驗(yàn)鑒定結(jié)果Fig.3Bonding test identification results

圖4 含裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的牛多殺性巴氏桿菌的裂解曲線Fig.4The lysis curve of bovine P.multocida containing lysis plasmid pPBA1100-E

2.5 裂解率的計(jì)算結(jié)果

將升溫誘導(dǎo)之前和誘導(dǎo)結(jié)束后的菌液分別用無菌PBS進(jìn)行105和102倍稀釋，均勻涂布于含有100 μg·mL-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，每板100 μL，重復(fù)涂3個(gè)平板，計(jì)算cfu平均值。37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，分別計(jì)算誘導(dǎo)前細(xì)菌數(shù)和誘導(dǎo)后細(xì)菌數(shù)。裂解效率=（1－6×102CFU/2.17×107CFU）×100%= 99.997%，就是菌液經(jīng)高溫誘導(dǎo)后有99.997%的細(xì)菌成功的被裂解。

3 討論

研究構(gòu)建了裂解質(zhì)粒pPBA1100-E，并通過接合轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入牛多殺性巴氏桿菌中。含有裂解質(zhì)粒pPBA1100-E的牛多殺性巴氏桿菌，在誘導(dǎo)初期其菌液OD600nm值呈上升趨勢，在誘導(dǎo)后2 h時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸降低，在誘導(dǎo)后10 h左右趨于平穩(wěn)所需誘導(dǎo)時(shí)間較國內(nèi)外報(bào)道的制備其他革蘭氏陰性菌菌影所需誘導(dǎo)時(shí)間要長[14-16]，具體原因還有待進(jìn)一步探討。

試驗(yàn)制備的牛多殺性巴氏桿菌菌影裂解率為99.997%，盡管能夠達(dá)到較高的水平，但在誘導(dǎo)過程中細(xì)菌并沒有全部打孔，仍有活菌存在，為了達(dá)到完全滅活，采用凍干法，將制備的菌影凍干兩次，每次置于凍干機(jī)中凍干12 h，經(jīng)過檢測細(xì)菌已被完全滅活，其原因可能是細(xì)菌在凍干的過程中會有一部分活菌死亡，在不加保護(hù)劑的情況下死亡的細(xì)菌數(shù)量會更多，而且菌影中存留的活菌數(shù)量本身很低，導(dǎo)致菌影在凍干過程中存留的少量活菌被全部滅活，但是在此過程中，抗原可能由于反復(fù)凍融而遭到破壞，導(dǎo)致其免疫原性降低。由于金黃色葡萄球菌的核酸酶A基因?qū)怂嵊休^強(qiáng)的降解能力，能夠?qū)⒓?xì)菌的核酸降解成小的片段。Haidinger等[17-18]將葡萄球菌核酸酶A與噬菌體phiX174裂解基因E聯(lián)合表達(dá)來提高裂解效率。此方法能夠使打孔效率提高，但是此方法仍然不能達(dá)到100%的打孔。因此，在提高菌影的打孔效率方面還需要進(jìn)一步的研究。

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Preparation of Cattle Pasteurella multocida Ghosts

Chang Chunlong，Wang Shixia，Zhai Junjun，Ni Hongbo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The temperature-sensitive lysis cassettes containing phage PhiX174 lytic gene E and start repressor system CI857-PLPR was amplified from plasmid pHH43 by PCR，the lysis cassettes CI857-PL-PR-E was inserted into shuttle vector pPBA1100，the recombinant plasmid pPBA1100-E was conjugated into cattle P.multocida by the experiment of conjugation，the lysis efficiency in P.multocida were detected by lysis dynamics test.The results showed that the lysis plasmid pPBA1100-E was successfully constructed，and it was transferred into P.multocida.The result of lysis dynamics test indicated that the lysis plasmid pPBA1100-E in Cattle P.multocida had a high lysising efficiency，the lysising efficiency was 99.98%.The cattle P.multocida ghosts was successfully prepared in this experiment，which laid the foundation for the further development of the cattle P.multocida ghost vaccine.

cattle Pasteurella multocida；ghost；lysis efficiency

Q78

A

1002-2090（2017）03-0020-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.005

2016-03-20

黑龍江省博士后科研啟動金資助（LBH-Q14134）。

常春龍（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2013級碩士研究生。

倪宏波，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：nihongbo@sina.com；翟軍軍，男，講師，E-mail：359143753@qq.com。