萬 紅，許彎彎

(武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223)

武漢機(jī)器蕩子湖藍(lán)藻水華優(yōu)勢藻種和土嗅味藻源鑒定

萬 紅，許彎彎

(武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223)

采用PCR擴(kuò)增、基因測序技術(shù)對湖泊早春季節(jié)爆發(fā)藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種和土嗅味藻源進(jìn)行鑒定研究，實(shí)驗(yàn)室條件下分別測定了不同光強(qiáng)和溫度對優(yōu)勢藻生物量和土嗅素產(chǎn)量的影響,其中，光強(qiáng)和溫度梯度分別為16、26、36 μmol·m-2·s-1和16、26、36 ℃。結(jié)果表明，湖泊藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種為柔細(xì)束絲藻(Aphanizomenongracile),富營養(yǎng)化湖泊中的強(qiáng)烈異味可能來源于柔細(xì)束絲藻的土嗅素。室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)顯示柔細(xì)束絲藻葉綠素含量和土嗅素產(chǎn)量在低溫和高光強(qiáng)時(shí)較高,實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的低溫強(qiáng)光環(huán)境有利于其生長；溫度對柔細(xì)束絲藻生長量和土嗅素產(chǎn)量的影響較光強(qiáng)顯著，適宜條件下土嗅素最高產(chǎn)量達(dá)6 555 ng·mg-1。

藍(lán)藻水華;基因測序;PCR擴(kuò)增;土嗅味

湖泊是一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的生態(tài)系統(tǒng),在調(diào)節(jié)徑流、供應(yīng)水源、水產(chǎn)養(yǎng)殖、調(diào)節(jié)生態(tài)環(huán)境和氣候等多方面具有不可替代的功能。當(dāng)前，湖泊水環(huán)境污染以及富營養(yǎng)化問題發(fā)展迅速、危害大、處理困難、恢復(fù)緩慢,已成為世界范圍內(nèi)最為嚴(yán)重的環(huán)境問題之一[1-3]。據(jù)報(bào)道,我國湖泊爆發(fā)的水華多是藍(lán)藻水華,包括微囊藻(Microcystis)水華、魚腥藻(Anabeana)水華、束絲藻(Aphanizomenon)水華和擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii)水華等[4-5]。藍(lán)藻一般在夏季溫度高于20 ℃、水體pH值偏高、光照強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間長時(shí)易大量繁殖形成水華[6-7]。藍(lán)藻水華通過產(chǎn)生藻毒素、腐爛時(shí)使水體缺氧和破壞正常的水生態(tài)平衡系統(tǒng)而影響湖泊功能并危害人體健康。目前，已有較多報(bào)道闡釋了藍(lán)藻產(chǎn)生藻毒素的機(jī)理和危害[8-10]。對于藍(lán)藻產(chǎn)生的異味物質(zhì)的研究近年來也取得較大進(jìn)展。藍(lán)藻水華爆發(fā)時(shí)經(jīng)常伴隨異味產(chǎn)生[11-12]。異味物質(zhì)是藻類產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其代表物質(zhì)土霉味和草木味異味物質(zhì)因很難從水體中根除而成為水體異味的主要來源。其中，土嗅素是淡水中普遍存在的一種土霉味化合物[13],最早從放線菌中被分離出來[14],隨后在藍(lán)藻、粘細(xì)菌等微生物中被分離出來[15-16]。束絲藻作為藍(lán)藻水華的優(yōu)勢種,由于易產(chǎn)生神經(jīng)毒素和土嗅素異味物質(zhì)等問題,目前已成為藍(lán)藻水華研究的熱點(diǎn)[17]。

機(jī)器蕩子湖是武漢市最深的人工湖,平均水深4 m,面積11.7萬m2。因污染嚴(yán)重,武漢市水務(wù)局于2013年對其實(shí)施“抽水、曬底泥、換自來水、種植水生植物”等水體綜合治理工程,水質(zhì)一度得到很大改善。但在2016年早春季節(jié),該湖泊爆發(fā)了藍(lán)藻水華并散發(fā)出強(qiáng)烈的土腥味。爆發(fā)初期,測得湖水中ρ(總氮)、ρ(總磷)、ρ(氨氮)、ρ(硝酸鹽)和ρ(葉綠素a)分別為3.485、0.235、0.022、0.083和0.145 mg·L-1,其中，總氮、總磷和葉綠素a含量已超過GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的五類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。筆者采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定此次藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種和湖泊土嗅味的來源,研究環(huán)境因子即光強(qiáng)和溫度對優(yōu)勢藻生物量和土嗅素產(chǎn)量的影響,對科學(xué)預(yù)測湖泊中水華的產(chǎn)生以及采取有效措施防治水華和消除異味物質(zhì)具有重要的環(huán)境和生態(tài)學(xué)意義[18]。

1 材料與分析

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD T100 Thermal Cycler)、凝膠圖像分析儀(GI-1)、電泳儀(DYY-8C)、氣相色譜儀(GC-2014C)、分光光度計(jì)(UV-2550)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51、OLYMPUS CKX31)、恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

(1)PCR相關(guān)試劑:引物F1(3′-TTGATCCTGGCTCAGGATGA-5′),引物1480(3′-AGTCCTACCTTAGGCATCCCCCTCC-5′)，引物GsyF1(5′-ATGCAACCMTTTRAACTGCC-3′),引物GGR1(5′-GCCCTCRAATTCGATTTCTTT-3′),引物GGR3(5′-CCCACAMCCAACTDTCAGTCAT-3′)。

(2)PCR預(yù)混液:Es Taq DNA聚合酶、2×Es Taq PCR 緩沖液、3 mmol·L MgCl、400 μmol·L dNTP 混合物以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系。

(3)凝膠電泳相關(guān)試劑

電泳緩沖液:242 g Tris堿、57.1 mL冰乙酸、100 mL 0.5 mol·L-1EDTA,pH值為8.0;DNA凝膠加樣緩沖液:w=0.25%酚藍(lán),w=0.25%二甲苯青FF,w=40%蔗糖;w=1%瓊脂糖凝膠:0.2 g瓊脂糖,20 mL TAE;DNA 標(biāo)記(Marker):DM 5 000。

(4)培養(yǎng)基:含氨芐(Amp)的LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基(添加100 μL 50 mg·mL-1的Amp,用于篩選成功的克隆子),含Amp的LB液體培養(yǎng)基(添加100 μL 50 mg·mL-1的Amp,用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功的克隆子)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水樣采集

2016年3月6日在湖中選取3個(gè)取樣點(diǎn),在各樣點(diǎn)取水樣1 L,將采集水樣等體積混合后取1 L水樣用φ=1.5%的魯哥氏液固定以備定量分析使用。定性樣品以孔徑為64 μm的25號(hào)浮游生物網(wǎng)在各樣點(diǎn)水面下約0.5 m處作“∞”字形來回拖動(dòng)多次,取濃縮水樣2份,一份立即加入w為4%甲醛溶液,另一份不加甲醛用于24 h內(nèi)活體鏡檢和藻類培養(yǎng)。

1.3.2 藻種培養(yǎng)和生長量測定

將純化后的優(yōu)勢藻接種于LB液體培養(yǎng)基,置于恒溫?fù)u床連續(xù)通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25 ℃,t(光)∶t(暗)=12 h∶12 h,初始pH值為6.8左右,光強(qiáng)為22 μmol·m-2·s-1。每隔8～10 d左右轉(zhuǎn)接1次,使藻細(xì)胞能長期處于對數(shù)期備用。為了測定光強(qiáng)和溫度對藻種和土嗅素產(chǎn)量的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度梯度為16、26和36 ℃,光強(qiáng)梯度為16、26、36 μmol·m-2·s-1。藻種產(chǎn)量用葉綠素a表示,土嗅味物質(zhì)的產(chǎn)量用單位質(zhì)量葉綠素a對應(yīng)的土嗅素物質(zhì)的質(zhì)量表示(ng·mg-1)。

1.3.3 藍(lán)藻水華優(yōu)勢藻種鑒定

(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。光學(xué)顯微鏡下從水樣中挑取單根優(yōu)勢藻種藻絲,加入100 μL PCR管中,藻絲樣品離心后放在-80 ℃的冰箱(30 min)和60 ℃的水浴鍋(6 min)中反復(fù)凍融3次破壁,另取2支PCR管制作陽性對照(擬柱孢藻基因)和陰性對照(水);再向樣品內(nèi)加入PCR反應(yīng)體系(8 μL水、10 μL混合酶、0.5 μL引物F1、0.5 μL引物1480)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件是94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,72 ℃反應(yīng)5 min,共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。

(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測。取0.4 g瓊脂糖和40 mL電泳緩沖液制成w=1.0%瓊脂糖凝膠液,置于中度火力微波爐中加熱融化2 min,向冷卻至65 ℃左右的瓊脂糖凝膠液中加入0.4 μL EB,混勻后灌注膠板制膠,待凝固后向膠板中依次加入3 μL PCR產(chǎn)物和DM 5000(Marker),電泳30 min[19]。

(3)目的DNA提取和純化。利用凝膠圖像分析儀檢查目的條帶,將出現(xiàn)目標(biāo)條帶的樣品再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增成功的DNA樣品通過切膠、水浴加熱溶解、離心洗脫雜質(zhì)等純化操作得以純化[20]。

(4)目的DNA克隆測序。0 ℃操作條件下,向100 μL離心管內(nèi)加入2.5 μL純化后的優(yōu)勢藻DNA、2.5 μL酶溶液(Solution I)和0.25 μL PMD18-T(載體),輕彈混勻后在16 ℃條件下反應(yīng)2 h,制取連接產(chǎn)物;取5 μL連接產(chǎn)物和25 μL感受態(tài)大腸桿菌Jml09加入1.5 mL離心管內(nèi),冰浴30 min,42 ℃水浴加熱90 s,冰激5 min,使載體轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌(Ecoli)中[21]。向離心管內(nèi)加入LB液體培養(yǎng)基200 μL,37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h;取培養(yǎng)藻液50 μL涂布于Amp/LB平板,37 ℃條件下培養(yǎng)10～12 h,直至長出菌落。最后，進(jìn)行陽性克隆篩選,將陽性克隆菌液送往生物技術(shù)公司測序。

1.3.4 水樣中土嗅味藻源鑒定

使用氣相色譜分析儀初步檢測優(yōu)勢藻樣品是否產(chǎn)生土腥味[22-23],然后利用表達(dá)土嗅素基因的GsyF1作為引物,擴(kuò)增優(yōu)勢藻種產(chǎn)土嗅味基因,并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序,檢測水樣的土嗅味是否來源于優(yōu)勢藻種。土嗅味物質(zhì)的數(shù)量根據(jù)土嗅素標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。

1.3.5 優(yōu)勢藻藻液土嗅素基因電泳檢測

為了分析土嗅味是否由優(yōu)勢藻種產(chǎn)生,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分子水平的補(bǔ)充鑒定。挑取單根優(yōu)勢藻藻絲在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后,分別取1 μL藻液置于12支PCR管中,經(jīng)凍融破壁操作后,向樣品內(nèi)加入含有引物GGR1的PCR反應(yīng)體系(由8 μL水、10 μL混合酶、0.5 μL GsyF1、0.5 μL GGR1配成),向?qū)φ展軆?nèi)加入含有引物GGR3的PCR反應(yīng)體系(由 8 μL水、10 μL混合酶、0.5 μL GsyF1、0.5 μL GGR3配成)。目的基因的擴(kuò)增以能表達(dá)土嗅味基因的GsyF1作為前引物,以GGR1和GGR3作為后引物。陽性對照為泥濘顫藻DNA(含有產(chǎn)土嗅味的基因,能擴(kuò)增出目的條帶)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢結(jié)果

鏡檢顯示優(yōu)勢藻藻絲直或稍彎曲,藻絲單生。圖1(a)所示的單根藻絲含有1個(gè)異形胞和2個(gè)厚壁孢子,圖1(b)所示的單根藻絲含有1個(gè)異形胞。優(yōu)勢藻營養(yǎng)細(xì)胞呈圓柱形,異形胞近似呈圓球狀,厚壁孢子橢圓形,比營養(yǎng)細(xì)胞略大。對照藻譜圖分析,這些特征與束絲藻屬的柔細(xì)束絲藻特征相似。顯微鏡定性分析結(jié)果表明樣品中只含有單一優(yōu)勢藻種,優(yōu)勢藻細(xì)胞密度為8 810 mL-1。

圖1 優(yōu)勢藻單根藻絲200倍鏡檢圖Fig.1 Microscopic figure of single filament magnified 200 times

2.2 優(yōu)勢藻PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

優(yōu)勢藻PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜如圖2所示。

圖2 優(yōu)勢藻PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 The PCR amplified products electrophoresis of preponderant algae

使用含異形胞和厚壁孢子的藍(lán)藻特異性引物F1和引物1480,擴(kuò)增出優(yōu)勢藻的目的條帶,進(jìn)一步說明優(yōu)勢藻種中可能含有異形胞和厚壁孢子。將以上出現(xiàn)目的條帶的第2、5、8、12、13、15泳道的PCR產(chǎn)物作為模板DNA再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只有第2泳道出現(xiàn)1 500 bp條帶,且條帶亮度大,可對其進(jìn)行切膠純化操作得到目的DNA。

2.3 目的DNA克隆測序結(jié)果

將初步鑒定有陽性克隆子的培養(yǎng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測,檢測圖譜見圖3。對比Marker可知泳道1、4、7、11對應(yīng)的4個(gè)樣品在1 500 bp出現(xiàn)條帶,說明克隆培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功。選擇條帶清晰明亮的泳道1和4對應(yīng)的藻液測序,測序結(jié)果見圖4。

將優(yōu)勢藻株的16S rDNA基因序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫資源上進(jìn)行同源性比對,結(jié)果表明序列與柔細(xì)束絲藻(AphanizomenongracileACCS 111)、魚腥藻(Anabaenasp. 86)、水華束絲藻(Aphanizomenonflosaquae)的相似性都為99%。根據(jù)形態(tài)特征可知,魚腥藻營養(yǎng)細(xì)胞為圓球形而非圓柱形;水華束絲藻藻絲平行排列,細(xì)胞聚集一起形成肉眼可見的葉片狀或鐮刀形群體,細(xì)胞質(zhì)絲伸展至全細(xì)胞,與顯微鏡觀察的優(yōu)勢藻形態(tài)不符;柔細(xì)束絲藻具有圓球形異形胞和橢圓形厚壁孢子,與顯微鏡下觀察的優(yōu)勢藻株的形態(tài)特征一致,由此可確定水體中的優(yōu)勢藻株為柔細(xì)束絲藻。

圖3 優(yōu)勢藻純培養(yǎng)藻液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 The PCR amplified products electrophoresis of preponderant algae pure culture

圖4 優(yōu)勢藻種16S rDNA序列Fig.4 Gene sequence diagram of preponderant algae 16S rDNA

2.4 水樣土嗅味檢測結(jié)果

配制150 ng·μL-1土嗅素標(biāo)準(zhǔn)樣品[24],氣相色譜分析見圖5。

圖5 土嗅素標(biāo)準(zhǔn)樣品氣相色譜分析Fig.5 Gas chromatogram of geosmin standard sample

4號(hào)和15號(hào)波峰明顯,都可能是土嗅素的對應(yīng)波峰。將標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)成不同濃度梯度進(jìn)行氣相色譜分析,觀察峰面積和標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為20.887 min的波峰峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.999 4,且保留時(shí)間與15號(hào)峰對應(yīng)一致,因此可確定15號(hào)峰為土嗅味物質(zhì)的對應(yīng)波峰。取10 mL藻液樣品進(jìn)行氣相色譜檢測,檢測結(jié)果顯示藻液樣品在20.825 min時(shí)出現(xiàn)波峰,與標(biāo)準(zhǔn)樣品15號(hào)峰保留時(shí)間吻合,可確定藻液樣品中產(chǎn)生了土嗅味。

2.5 柔細(xì)束絲藻藻液土嗅素基因電泳檢測

柔細(xì)束絲藻純培養(yǎng)藻液土嗅素基因的電泳檢測圖譜如圖6所示,泳道1、2、4、5、7、9、10出現(xiàn)目的條帶,將泳道1、2對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序。將柔細(xì)束絲藻純藻液基因測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫資源上進(jìn)行同源序列比對,發(fā)現(xiàn)與已知柔細(xì)束絲藻(WH-1菌株)土嗅素合成酶基因(AphanizomenongracileWH-1 putative geosmin)的相似性為99%。因氣相色譜分析表明藻液中產(chǎn)生了土嗅味,定性分析顯示樣品只含有單一優(yōu)勢藻種,由此推測柔細(xì)束絲藻中土嗅素基因得到了表達(dá),水樣中土嗅味來源于柔細(xì)束絲藻的土嗅素。

圖6 柔細(xì)束絲藻純培養(yǎng)藻液土嗅素基因電泳圖譜Fig.6 The geosmin gene electrophoresis of the Aphanizomenon gracile pure culture

2.6 溫度和光強(qiáng)對優(yōu)勢藻葉綠素a含量和土嗅素產(chǎn)量的影響

設(shè)置溫度梯度為16、26、36 ℃,光強(qiáng)為22 μmol·m-2·s-1,每隔5 d取樣測定葉綠素a濃度和土嗅素產(chǎn)量(圖7)。不同溫度對優(yōu)勢藻葉綠素a的含量和土嗅素產(chǎn)量均有較大影響。優(yōu)勢藻生長量隨溫度的升高而降低。特別是過了生長適應(yīng)期(第16天)以后,16 ℃生長條件下的藻類生長量明顯高于其他2組,而在36 ℃培養(yǎng)條件下藻類增長速率比較緩慢。3種溫度條件下土嗅素產(chǎn)量先升高后降低,在培養(yǎng)15 d時(shí)產(chǎn)量最高。16 ℃生長條件下土嗅素產(chǎn)量明顯高于其他2組。

設(shè)置光強(qiáng)梯度為16、26、36 μmol·m-2·s-1,溫度為20 ℃,每隔5 d取樣測定葉綠素a濃度和土嗅素產(chǎn)量(圖8)。光強(qiáng)為16 μmol·m-2·s-1時(shí),藻類生長量明顯低于其他2組;光強(qiáng)為26和36 μmol·m-2·s-1時(shí),藻種生長量無顯著差異。可見，優(yōu)勢藻生長量隨光強(qiáng)的增大而增加,顯示出喜強(qiáng)光的特征。3種光強(qiáng)條件下土嗅素產(chǎn)量先升高后降低,在培養(yǎng)10 d時(shí)產(chǎn)量都達(dá)最高,最高產(chǎn)量達(dá)6 555 ng·mg-1。在培養(yǎng)前期(5～20 d),低光強(qiáng)條件下土嗅素產(chǎn)量明顯低于其他組;30 d后3種光強(qiáng)條件下土嗅素產(chǎn)量無明顯差異。對比圖7和圖8可知,對于柔細(xì)束絲藻生長量和土嗅素產(chǎn)量來說,溫度的影響比光強(qiáng)要顯著一些,可能是因?yàn)樗{(lán)藻含有氣泡,在不利情況下能夠調(diào)節(jié)自身浮力以便能最大程度地獲得光照,從而減少不利光強(qiáng)的影響。

綜上可知,在低溫和高光強(qiáng)條件下柔細(xì)束絲藻葉綠素含量較高,其有利生長條件(低溫、強(qiáng)光)恰好解釋了柔細(xì)束絲藻水華在溫度較低的早春季節(jié)大量暴發(fā)的現(xiàn)象。2001年,TSUJIMURA等[25]研究發(fā)現(xiàn)水華束絲藻在氣溫8 ℃的冬季仍可生長良好,而CARMICHAEL等[26]報(bào)道水華束絲藻在水溫較高的夏季爆發(fā)。

圖7 溫度對優(yōu)勢藻生長量和土嗅素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of temperature on the growth and geosmin production of preponderant algae

圖8 光強(qiáng)對優(yōu)勢藻生長量和土嗅素產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of light intensity on the growth and geosmin production of preponderant algae

該研究結(jié)果表明柔細(xì)束絲藻在16 ℃時(shí)生長量顯著高于其他高溫條件,這種對溫度敏感的差異性可能是由于束絲藻的種類不同導(dǎo)致。同樣,低溫和高光強(qiáng)條件也有利于土嗅素的產(chǎn)生,即合適條件下土嗅素產(chǎn)量可達(dá)最高,室內(nèi)模擬培養(yǎng)條件下土嗅素產(chǎn)量同柔細(xì)束絲藻葉綠素產(chǎn)量表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性。NAES 等[27]研究發(fā)現(xiàn)不同光強(qiáng)下顫藻土嗅素產(chǎn)量和葉綠素a含量呈正相關(guān)關(guān)系。但是,關(guān)于溫度和光強(qiáng)對不同種類藻株異味物質(zhì)的影響也有相反的結(jié)論,如BLEVINS等[28]研究發(fā)現(xiàn)魚腥藻葉綠素含量和土嗅素產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

對湖泊爆發(fā)藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻種和土嗅味藻源進(jìn)行了鑒定研究,優(yōu)勢藻種基因測序結(jié)果表明優(yōu)勢藻與柔細(xì)束絲藻的基因相似性為99%,結(jié)合鏡檢結(jié)果，優(yōu)勢藻珠的藻絲含有圓球形異形胞和橢圓形厚壁孢子,可鑒定出優(yōu)勢藻種為念珠藻科束絲藻屬的柔細(xì)束絲藻。根據(jù)優(yōu)勢藻藻液土嗅素氣相色譜分析和優(yōu)勢藻土嗅素基因測序結(jié)果,可推測水樣中土嗅味可能來源于柔細(xì)束絲藻。室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)條件下,低溫和高光強(qiáng)時(shí)純培養(yǎng)柔細(xì)束絲藻葉綠素含量和土嗅素產(chǎn)量較高,且溫度對柔細(xì)束絲藻生長量和土嗅素產(chǎn)量的影響較光強(qiáng)顯著。

[1] J?RGENSEN S E.State-of-the-Art of Ecological Modelling With Emphasis on Development of Structural Dynamic Models[J].Ecological Modelling,1999,120(2/3):75-96.

[2] 國家環(huán)境保護(hù)總局.2007中國環(huán)境狀況公報(bào)[R].北京:國家環(huán)境保護(hù)總局,2008:6.[State Environmental Protection Administration.The State of Environment in China in 2007[R].Beijing:State Environmental Protection Administration,2008:6.]

[3] 金根東.我國湖泊富營養(yǎng)化研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(16):334-336.[JIN Gen-dong.Research Status of Lake Eutrophication in China[J].Modern Agricultural Science and Technology,2008(16):334-336.]

[4] 黃睿,沈烽,羅娟,等.藍(lán)藻水華消亡對湖泊表層沉積物中氨氧化細(xì)菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào),2015,31(3):334-339.[HUANG Rui,SHEN Feng,LUO Juan,etal.Effects of Withering of Cyanobacteria Bloom on Abundance and Community Composition of Ammonia-Oxidizing Bacteria in Surface Lake Sediments[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2015,31(3):334-339.]

[5] 錢奎梅,劉霞,段明,等.鄱陽湖藍(lán)藻分布及其影響因素分析[J].中國環(huán)境科學(xué),2016,36(1):261-267.[QIAN Kui-mei,LIU Xia,DUAN Ming,etal.Distribution and Its Influencing Factors of Bloom-Forming Cyanobacteria in Poyang Lake[J].China Environmental Science,2016,36(1):261-267.]

[6] 黃煒,商兆堂.藍(lán)藻水華輕度的顯著相關(guān)環(huán)境因素識(shí)別模型[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào),2013,29(6):804-810.[HUANG Wei,SHANG Zhao-tang.Model for Identifying Environmental Factors Significantly Associated With Cyanobacterial Bloom Intensity[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2013,29(6):804-810.]

[7] 范裕祥,金社軍,周培,等.巢湖藍(lán)藻水華分布特征和氣象條件分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(4):19l-193,198.[FAN Yu-xiang,JIN She-jun,ZHOU Pei,etal.Analysis on the Distributions and Meteorological Conditions of Cyanobacteria Bloom in Chaohu Lake[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2015,43(4):19l-193,198.]

[8] NEILAN B A,PEARSON L A,MUENCHHOFF J,etal.Environmental Conditions That Influence Toxin Biosynthesis in Cyanobacteria[J].Environmental Microbiology,2012,15(5):1239-1253.

[9] PAERL H W,HALL N S,CALANDRINO E S.Controlling Harmful Cyanobacterial Blooms in a World Experiencing Anthropogenic and Climatic-Induced Change[J].Science of the Total Environment,2011,409(10):1739-1745.

[10]BALLOT A,FASTNER J,WIEDNER C.Paralytic Shellfish Poisoning Toxin-Producing CyanobacteriumAphanizomenongracileinNortheast Germany[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(4):1173-1180.

[11]鄧緒偉,陶敏,張路,等.洞庭湖水體異味物質(zhì)及其與藻類和水質(zhì)的關(guān)系[J].環(huán)境科學(xué)研究,2013,26(1):16-21.[DENG Xu-wei,TAO Min,ZHANG Lu,etal.Relationships Between Odors and Algae and Water Quality in Dongting Lake[J].Research of Environmental Sciences,2013,26(1):16-21.]

[12]PETER A,K?STER O,SCHILDKNECHT A,etal.Occurrence of Dissolved and Particle-Bound Taste and Odor Compounds in Swiss Lake Waters[J].Water Research,2009,43(8):2191-2200.

[13]SAADOUN I M K,SCHRADER K K,BLEVINS W,etal.Environmental and Nutritional Factors Affecting Geosmin Synthesis byAnabaenasp.[J].Water Research,2001,35(5):1209-1218.

[14]GERBER N N,LECHEVALIER H A.Geosmin,an Earthy-Smelling Substance Isolated From Actinomycetes[J].Applied Microbiology,1965,13(6):935-938.

[15]LAWTON L A,ROBERTSON P K J,ROBERTSON R F,etal.The Destruction of 2-Methylisobomeol and Geosmin Using Titanium Dioxide Photocatalysis[J].Applied Catalysis B:Environmental,2003,44(1):9-13.

[16]SCHULZ S,FUHLENDORFF J,REICHENBACH H.Identification and Synthesis of Volatiles Released by the MyxobacteriumChondromycescrocatus[J].Tetrahedron,2004,60(17):3863-3872.

[17]施軍瓊,吳忠興,馬劍敏,等.水華束絲藻對磷的生理響應(yīng)研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2011,35(5):857-861.[SHI Jun-qiong,WU Zhong-xing,MA Jian-min,etal.Physiological Response to Phosphorus inAphanizomenonflos-aquae[J].Acta Hydrobiological Sinica,2011,35(5):857-861.]

[18]馬健榮,鄧建明,秦伯強(qiáng),等.湖泊藍(lán)藻水華發(fā)生機(jī)理研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2011,33(10):3020-3030.[MA Jian-rong,DENG Jian-ming,QIN Bo-qiang,etal.Progress and Prospects on Cyanobacteria Bloom-Forming Mechanism in Lakes[J].Acta Ecologica Sinica,2011,33(10):3020-3030.]

[19]朱英,陶剛,劉作易,等.瓊脂糖凝膠電泳操作中值得注意的幾個(gè)問題[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,32(6):27-28.[ZHU Ying,TAO Gang,LIU Zuo-yi,etal.Several Problems Worthy of Being Noticed During Agarose Gel Electrophoresis[J].Guizhou Agricultural Sciences,2004,32(6):27-28.]

[20]彭加平,田錦.基因操作技術(shù)[M].北京:化學(xué)工出版社,2013:44-47.[PENG Jia-ping,TIAN Jin.Gene Manipulation Technology[M].Beijing:Chemical Industry Press,2013:44-47.]

[21]鐘衛(wèi)鴻.基因工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:化學(xué)工出版社,2007:45-56.[ZHONG Wei-hong.Experimental Guidance of Genetic Engineering Technology[M].Beijing:Chemical Industry Press,2007:45-56.]

[22]WATSON S B,BROWNLEE B,SATCHWILL T,etal.Quantitative Analysis of Trace Levels of Geosmin and Mib in Source and Drinking Water Using Headspace SPME[J].Water Research,2000,34(10):2818-2828.

[23]LI L,WAN N,GAN N Q,etal.Annual Dynamics and Origins of the Odorous Compounds in the Pilot Experimental Area of Lake Dianchi,China[J].Water Science and Technology,2007,55(5):43-50.

[24]馬杰,方赤光,李青,等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定生活飲用水中的土臭素和2-甲基異莰醇[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(1):23-25.[MA Jie,FANG Chi-guang,LI Qing,etal.Determination of Geosmin and 2-Methylisoborneol in Drinking Water by Gas Chromatography-Mass Spectrometry[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2016,26(1):23-25.]

[25]TSUJIMURA S,ISHIKAWA K,TSUKADA H.Effect of Temperature on Growth of the CyanobacteriumAphanizomenonflosaquaeinLake Biwa and Lake Yogo[J].Phycological Research,2001,49(4):275-280.

[26]CARMICHAEL W W,DRAPEAU C,ANDERSON D M.Harvesting ofAphanizomenonflos-aquaeRalfs Ex Born. and & Flah. var.Flos-aquae(Cyanobacteria) From Klamath Lake for Human Dietary Use[J].Journal of Applied Phycology,2000,12(6):585-595.

[27]NAES H,AARNES H,UTKILEN H,etal.Effect of Photon Fluence Rate and Specific Growth Rate on Geosmin Production of the CyanobacteriumOscillatoriabrevis(Kütz.) Go[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,49(6):1538-1540.

[28]BLEVINS W T,SCHRADER K K,SAADOUN I.Comparative Physiology of Geosmin Production byStreptomyceshalstediiandAnabaenasp.[J].Water Science and Technology,1995,31(11):127-133.

(責(zé)任編輯：陳 昕)

Identification on Preponderant Algae of Cyanobacteria Bloom and Geosmin Odor Source of Wuhan Jiqidangzi Lake.

WANHong,XUWan-wan

(School of Life Science, Wuchang University of Technology, Wuhan 430223, China)

Research indicates cyanobacteria blooms not only endanger water quality，but also produce neurotoxins and odorous matter. In order to scientifically predict water bloom, and then provide fundamental knowledge on the prevention and control of water bloom and odor, preponderant algae species of cyanobacteria bloom and geosmin odor source multiplied in early spring were identified by means of PCR amplification and gene sequencing technology. The effects of different temperature and light intensity on preponderant algae biomass and geosimin odor yield were also measured respectively under laboratory conditions. The preponderant algae were cultured at three temperatures (16， 26 and 36 ℃) and three light intensities[16， 26， 36 μmol·m-2·s-1]. The preponderant algae of cyanobacteria bloom was identified asAphanizomenongracile, and the strong smell of the eutrophicated lake might come from the geosmin ofAphanizomenongracile. Laboratory simulation study indicate that the content ofAphanizomenongracilechlorophyll-a and the yield of geosmin odor became higher at low temperature and high light intensity, indicating low temperature and strong light environment were favorable growth conditions. It was found that the effect of temperature was more significant than light intensity onAphanizomenongracile, and the highest yield of the geosmin odor was 6 555 ng·mg-1under favorable conditions.

cyanobacteria bloom; gene sequencing; PCR amplification; geosmin odor

2016-07-18

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃(B2015282)

X171

A

1673-4831(2017)06-0539-07

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.06.008

萬紅(1976—),女,湖北隨州人,講師,碩士,從事水污染控制與生態(tài)修復(fù)方面的研究。E-mail: 19786630@qq.com