徐基勝趙炳梓張佳寶

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

長期施有機(jī)肥和化肥對潮土胡敏酸結(jié)構(gòu)特征的影響*

徐基勝1，2趙炳梓1?張佳寶1

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

以河南封丘長期肥料試驗(yàn)為平臺，選擇有機(jī)肥（OM）、化肥NPK（NPK）和不施肥（CK）3種處理，研究了不同施肥措施對潮土胡敏酸（HA）結(jié)構(gòu)特征的影響。HA樣品經(jīng)提取純化后，采用一系列固態(tài)13C核磁共振（NMR）技術(shù)并結(jié)合元素分析和穩(wěn)定碳同位素（δ13C）技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量表征。其中NMR技術(shù)包括高速多重傾斜幅度交叉極化/魔角自旋（multiCP/MAS）、偶極相移、化學(xué)位移各向異性過濾和質(zhì)子碳編輯技術(shù)。結(jié)果表明：長期施有機(jī)肥和NPK肥增加了HA的飽和程度、氧化程度和極性，但縮合程度降低；HA的δ13C值降低，表明有新的有機(jī)碳進(jìn)入HA中。潮土HA以脂肪族化合物為主，烷基比例最高，占全碳的24.1%～26.3%；δ64～44處同時(shí)存在含氮烷基和甲氧基，且含氮烷基比例更高；另外異頭碳和烷氧基中的非質(zhì)子碳比例均很低。HA的芳香族成分中，δ142～113芳香碳以質(zhì)子碳為主，且有少量質(zhì)子芳香碳存在于δ113～93。結(jié)果還表明施肥均降低了HA的羧基和δ142～113芳香碳比例，增加了烷氧基和甲氧基比例；施有機(jī)肥還增加了酚碳和含氮烷基比例，降低了烷基比例。本研究表明長期施用有機(jī)肥和NPK肥使潮土HA結(jié)構(gòu)向著疏水性程度和分解程度降低的方向發(fā)展；OM和NPK處理均使糖類物質(zhì)增加，OM處理還使木質(zhì)素和多肽增加，脂類物質(zhì)降低。不同施肥模式下HA的形成機(jī)制不同。

胡敏酸；高級核磁共振；δ13C；元素分析；有機(jī)肥；NPK肥

腐殖物質(zhì)是土壤有機(jī)質(zhì)的重要組成部分［1］，同時(shí)也是土壤肥力狀況的重要表征［2-3］。胡敏酸（HA）作為土壤腐殖物質(zhì)的堿溶部分［4］，其含量和結(jié)構(gòu)的變化與土壤的保肥和供肥性能密切相關(guān)［5］。長期施肥是提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤肥力的重要農(nóng)業(yè)措施［4，6］，研究長期施肥條件下土壤HA結(jié)構(gòu)特征的變化具有重要的理論和實(shí)踐意義。

部分研究表明，與不施肥對照相比，施用有機(jī)肥或配施化肥情況下，土壤HA的芳香族含量下降，脂肪性增強(qiáng)，HA結(jié)構(gòu)變得更加簡單［2-3，5，7-8］。但Jindo等［9］通過西班牙栗色土培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)成熟堆肥1年后HA的芳香族物質(zhì)增加，疏水性特征更加明顯。孟安華和吳景貴［10］報(bào)道新鮮牛糞和腐解牛糞施入2年后均使植菜土壤HA的脂肪族化合物減少、芳香度增加。Chien等［6］研究發(fā)現(xiàn)施用綠肥堆肥和配施不同化肥8年后，土壤HA的芳香碳比例沒有顯著變化，但烷基比例在堆肥處理中明顯增加。此外趙楠和呂貽忠［11］還比較了長期施用不同有機(jī)肥對河北潮土HA結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物料不同，HA的結(jié)構(gòu)有明顯差異；如餅肥處理的HA含氨基化合物和羧基最多，而綠肥處理的HA含羥基和脂肪烴最多。由此可見，施肥措施、施肥年限以及土壤類型的不同均會對HA的化學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

然而這種環(huán)境的差異和管理措施的不同是否

一定導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)組分結(jié)構(gòu)的差異尚有爭議。Veum等［12］發(fā)現(xiàn)盡管有機(jī)肥處理增加了土壤中的有機(jī)碳濃度，但并未引起官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化。Yan等［13］認(rèn)為長期不同施肥并不能改變水稻土有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)。作為土壤有機(jī)質(zhì)的惰性組分，腐殖物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特異性更是受到質(zhì)疑［14-15］。盡管竇森等［16］并不認(rèn)可這種質(zhì)疑，但目前的測定技術(shù)大多只能達(dá)到半定量分析，難以準(zhǔn)確認(rèn)識到腐殖物質(zhì)的特異性。這就需要一種更深入的定量分析技術(shù)。固態(tài)13C核磁共振（NMR）是研究有機(jī)質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要手段，其中比較常用的是交叉極化/魔角自旋（CP/ MAS）技術(shù)，但該技術(shù)存在一些不足之處如不同類型碳的交叉極化效率低、自旋邊帶的影響和圖譜峰重疊，因此難以定量［17］。最近發(fā)展出的高速多重傾斜幅度交叉極化/魔角自旋（multiCP/MAS）技術(shù)則能簡單快速定量測定有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)［18］并成功用于秸稈分解［19］、海藻吸附［20］和土壤腐殖物質(zhì)［21］等多個(gè)領(lǐng)域。選擇性碳圖譜技術(shù)的開發(fā)則更加豐富了有機(jī)質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究［7，17］，這些高級NMR技術(shù)包括偶極相移（DD）、化學(xué)位移各向異性過濾（CSA）、CH編輯、CH2編輯和CHn-only編輯技術(shù)等，可分別測定非質(zhì)子碳和可轉(zhuǎn)動碳、異頭碳、次甲基、亞甲基，以及質(zhì)子碳。Mao等［7］利用高級NMR技術(shù)研究了兩種施肥模式對農(nóng)場地土壤鈣結(jié)合HA結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)施用無機(jī)氮肥增加了非質(zhì)子芳香碳比例，而施用糞肥增加了含氮烷基比例。

潮土是黃淮海平原的典型土壤，長期施用有機(jī)肥和化肥對潮土HA結(jié)構(gòu)的定量化研究目前還少見報(bào)道?；诖耍狙芯坎捎迷胤治?、穩(wěn)定碳同位素分析和高級固態(tài)13C NMR波譜法，針對連續(xù)23年不同施肥措施對潮土HA結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了定量深入研究，為土壤肥力提升和腐殖化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地設(shè)置于中國科學(xué)院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站（35°00′N，114°24′E），始于1989年秋。供試土壤為黃河沖積物發(fā)育的輕壤質(zhì)黃潮土，種植制度為冬小麥-夏玉米一年兩熟輪作制。本研究選取3種施肥處理：有機(jī)肥（OM）、化肥NPK（NPK）和不施肥對照（CK）。每個(gè)處理重復(fù)4次，每個(gè)小區(qū)面積為48 m2。試驗(yàn)所用的N、P、K化肥分別為尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。有機(jī)肥以粉碎的小麥秸稈為主，加入適量的大豆餅和棉籽餅，按100∶40∶45的比例混合、堆制發(fā)酵而成。有機(jī)肥施用以等氮量為標(biāo)準(zhǔn)，磷和鉀不足部分用磷肥和鉀肥補(bǔ)足到等量，當(dāng)季有機(jī)肥用量約為2 758 kg hm-2。

土壤樣品于2013年8月在每個(gè)小區(qū)采用五點(diǎn)取樣法采集耕層土壤（0～20 cm），混勻后裝入自封袋。樣品經(jīng)室溫風(fēng)干后磨碎，過2 mm篩備用。土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 不同處理間土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the soil relative to treatment

1.2 HA的分離提取和純化

H A的提取和純化參照國際腐殖物質(zhì)學(xué)會（IHSS）和Preston等［22］的方法。具體如下：按土液比1∶10（w/v）加入提取劑0.1 mol L-1NaOH + 0.1 mol L-1Na4P2O7混合溶液，室溫下浸提16 h，離心收集上清液。多次重復(fù)提取，直到離心液無色。將離心液酸化到pH 為1～2，室溫下靜置12～16 h，離心分離出沉淀。分別用0.5 mol L-1NaOH和6 mol L-1HCl反復(fù)溶解-沉淀，直到離心液無色，最終沉淀即為粗HA。粗HA再用HF∶HCl（1%∶1%）混合溶液處理5次去除礦物質(zhì)，最后經(jīng)去離子水反復(fù)清洗至離心液為中性pH，冷凍干燥后得到純化HA。

1.3 分析測定

元素組成：C、N和H含量用元素分析儀（Vario micro cube，Elementar Analysensysteme GmbH，德國）測定，灰分含量在800 ℃加熱4 h測定，O含量用差減法計(jì)算。

δ13C值：用元素分析-同位素質(zhì)譜分析聯(lián)用儀（Flash-2000 Delta V ADVADTAGE，賽默飛世爾）測定穩(wěn)定碳同位素比值，以Pee Dee Belemnite （PDB）為標(biāo)準(zhǔn)。δ13C值可用于判斷土壤有機(jī)質(zhì)組分的來源。

核磁共振：固體13C核磁共振實(shí)驗(yàn)分析在Bruker Avance 400核磁共振儀上完成，采用固體雙共振探頭，4 mm轉(zhuǎn)子。13C的檢測共振頻率為100 MHz。本研究中采用的NMR技術(shù)包括以下幾種。

13C multiCP/MAS NMR：測定所有碳。魔角自旋頻率為14 kHz，接觸時(shí)間0.1 ms，循環(huán)延遲時(shí)間0.35 s，90°13C脈寬4 μs。圖譜旋轉(zhuǎn)邊帶峰面積非常小（＜3%），與中心峰重疊很少。所有樣品的掃描次數(shù)為4 096。

偶極相移（DD）技術(shù)：測定不與氫原子相連的碳（非質(zhì)子碳）和可轉(zhuǎn)動碳（包括甲基和聚亞甲基）。偶極相移時(shí)間為68 μs，其他條件同multiCP/ MAS。所有樣品的掃描次數(shù)為4 096。

CSA技術(shù)：sp3雜化的異頭碳和sp2雜化的芳香碳在δ90～120 區(qū)域內(nèi)均有共振峰，利用五脈沖CSA技術(shù)可以將兩種信號區(qū)分開來，CSA-濾波時(shí)間為35 μs。CSA與DD技術(shù)聯(lián)用后可以進(jìn)一步區(qū)分出非質(zhì)子異頭碳（OCqO），偶極相移時(shí)間為40 μs。所有樣品的掃描次數(shù)為2 400～8 192。

CHn-only圖譜編輯技術(shù)：該圖譜由兩個(gè)交叉極化-總邊帶抑制（CP/TOSS）圖譜差減而得。兩個(gè)圖譜的交叉極化接觸時(shí)間均為50 μs，但第二個(gè)圖譜再配合40 μs偶極相移時(shí)間。兩個(gè)圖譜的差值顯示的為CH2和CH官能團(tuán)即質(zhì)子碳信號，并有少量CH3信號。所有樣品的掃描次數(shù)為1 600～2 048。

烷基和烷氧基比值（A/O-A）、芳香度和疏水性指數(shù)（HI）［17］的計(jì)算公式分別如下：

以上計(jì)算公式中所有積分結(jié)果均由全碳圖譜和偶極相移圖譜給出。

2 結(jié) 果

2.1 長期施肥下HA元素組成和同位素的變化

與CK相比，OM和NPK處理有降低潮土HA的C，增加N和O含量的趨勢（表2），使得OM和NPK處理的H/C、O/C和（N+O）/C比值較對照高，但OM和NPK處理間相差不大。但施肥后HA中H含量變化較小。類似地，OM和NPK處理之間的δ13C值也較為接近，但較CK處理分別降低3.12‰和3.88‰。

表2 不同處理間HA的元素組成（無灰分）、原子比和同位素成分Table 2 Elemental composition（ash-free），atomic ratio and isotopic components of thehumic acids in the soil relative to treatment

2.2 長期施肥下HA偶極相移前后的13C multiCP/ MAS NMR圖譜特征變化

圖1為潮土HA的multiCP/MAS全碳圖譜（黑線）和相應(yīng)的偶極相移圖譜（灰線）。由全碳圖譜可看出潮土HA顯示出如下特征峰：δ173、δ153、 δ129、δ105、δ73、δ56和δ30，對應(yīng)的碳官能團(tuán)分別為羧基（COO/N-C=O）、酚碳（aromatic C-O）、芳香碳（aromatic C）、異頭碳（anomeric C，但也可能顯示芳香碳信號）、烷氧基（O-alkyl）、甲氧基 + 含氮烷基（OCH3/NCH）和烷基（alkyl）；而偶極相移圖譜則顯示出非質(zhì)子碳和可轉(zhuǎn)動碳的共振峰信號，包括羧基、酚碳、非質(zhì)子芳香碳、非質(zhì)子烷氧基（OCq）、非質(zhì)子異頭碳（OCqO）、甲氧基、甲基和聚亞甲基。

圖1 HA的multiCP/MAS13C NMR圖譜（黑線）和偶極相移圖譜（灰線）Fig. 1 Multiple cross-polarization/magic angle spinning13C NMR spectra（black lines）of HAs，combined with their corresponding dipolar dephasing subspectra（gray lines）

潮土HA全碳圖譜的最大共振峰均在δ30處，且均含有較高的羧基峰δ173，而在δ220～188內(nèi)信號強(qiáng)度不明顯，表明存在較少的羰基；δ129處均顯示出較強(qiáng)的芳香碳信號，且OM處理的峰最低，而CK處理的最高，幾乎與羧基峰齊平。與CK相比，施有機(jī)肥后HA在δ153、δ113～93和δ56處的信號增強(qiáng)，而NPK處理則變化不明顯。經(jīng)偶極相移技術(shù)處理后，潮土HA除在δ220～142內(nèi)碳信號基本不變外，其他化學(xué)位移的碳信號均不同程度下降，表明存在較多的質(zhì)子碳。其中δ129處的峰部分降低，顯示出較多的非質(zhì)子芳香碳信號；而δ113～93和δ93～64的信號強(qiáng)度均大大降低，表明這兩個(gè)區(qū)域的碳只有很少的非質(zhì)子碳；烷基區(qū)域內(nèi)δ30和δ23處均有較強(qiáng)的聚亞甲基和甲基峰信號，且施有機(jī)肥后聚亞甲基峰信號減弱，而NPK處理變化較小。

2.3 OM和NPK處理HA的選擇性碳圖譜特征

整體而言，與CK相比，OM處理的HA全碳圖譜變化較大，而NPK處理差異相對較小。全碳圖譜和偶極相移圖譜尚不能區(qū)分δ113～93內(nèi)的異頭碳和芳香碳；異頭碳來源于糖類物質(zhì)［7］，而芳香碳屬于芳香族物質(zhì)。為了進(jìn)一步區(qū)分這兩種結(jié)構(gòu)截然不同的碳，選擇OM和NPK兩種處理，利用CSA 和CHn-only圖譜編輯技術(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2a和圖2e為全碳圖譜，作為其他圖譜的參考對照。由圖2b和圖2f CSA圖譜可知OM和NPK處理的HA在δ105處均顯示出較低的共振峰，表明存在異頭碳；且OM處理的HA經(jīng)CSA測定后δ105峰下降較多，表明此區(qū)域還含有一部分芳香碳；而在NPK處理中該信號峰下降不明顯。由此導(dǎo)致δ105峰高在全碳圖譜中為OM處理高，而在CSA圖譜中二者相當(dāng)。CSA圖譜經(jīng)偶極相移后在δ56、δ30和δ23處殘留有3個(gè)低峰（圖2c和圖2g），分別歸屬為甲氧基、聚亞甲基和甲基；而在δ113～93處顯示出不明顯的寬帶，表明兩種HA均含有很少的非質(zhì)子異頭碳。從圖2d和圖2h上看兩種HA圖譜均含有較多的質(zhì)子碳信號，包括δ142～113質(zhì)子芳香碳、δ113～93質(zhì)子異頭碳、δ93～64質(zhì)子烷氧基、δ56含氮烷基和δ30聚亞甲基。其中OM處理HA的δ56峰要較NPK的高。

圖2 HA的multiCP/MAS NMR圖譜和選擇性官能團(tuán)碳圖譜Fig. 2 MultiCP/MAS NMR spectra of humic acids and selective functional group carbon spectra

2.4 長期施肥下HA結(jié)構(gòu)的定量特征變化

由全碳圖譜和偶極相移圖譜可得到HA各官能團(tuán)碳的定量分析結(jié)果（表3），包括非質(zhì)子碳和甲氧基比例。其中δ113～93主要為異頭碳，芳香碳主要集中于δ142～113區(qū)間。

由表3可知HA結(jié)構(gòu)中烷基含量最高，占全碳的24.1%～26.3%，其次為δ142～113芳香碳（18.7%～23.0%）、烷氧基（13.3%～14.6%）、羧基（1 1.0%～1 2.3%）和含氮烷基（10.0%～11.7%），而酚碳、δ113～93碳、甲氧基和羰基含量最低，占全碳的1.4%～7.5%。與不施肥相比，施肥降低了低場化學(xué)位移的碳比例包括羧基和δ142～113芳香碳，提高了高場化學(xué)位移的碳比例包括δ113～93碳、烷氧基和甲氧基+含氮烷基，且除烷氧基外施有機(jī)肥對HA結(jié)構(gòu)的改變要比NPK肥大。δ142～113芳香碳以質(zhì)子化碳為主，其比例的降低主要是由質(zhì)子芳香碳引起，而非質(zhì)子芳香碳比例變化較小。烷氧基比例的增加在OM處理中主要?dú)w因于質(zhì)子烷氧基，而在NPK處理中主要是由于非質(zhì)子烷氧基碳。δ64～44區(qū)域內(nèi)施有機(jī)肥同時(shí)增加甲氧基和含氮烷基的相對比例；而施NPK肥主要增加的是甲氧基。另外，施有機(jī)肥還增加了HA中的酚碳比例，降低了烷基比例，而NPK肥則沒有影響。

表3 HA不同化學(xué)位移區(qū)間碳占總碳的相對比例Table 3 Relative percentages of spectral regions assigned to different functional groups in the humic acids（%）

根據(jù)高級NMR計(jì)算的結(jié)果（表4），OM處理HA的異頭碳相對比例為3.6%，NPK為4.3%，二者含量較為接近，分別占δ113～93碳的47%和69%?？梢娕cNPK相比，施有機(jī)肥使HA在δ113～93內(nèi)有更多比例的芳香碳（分別占該化學(xué)位移內(nèi)碳的31% 和53%），且絕大多數(shù)為質(zhì)子芳香碳。OM和NPK處理HA的δ142～113芳香碳分別占總芳香碳的80% 和89%。

表4 根據(jù)multiCP/MAS13C NMR和CSA技術(shù)計(jì)算的HA芳香碳和異頭碳相對比例Table 4 Relative percentages of aromatic and anomeric in HAs assessed with the multiCP/MAS13C NMR and CSA filter（%）

由于官能團(tuán)相對比例的變化，施肥后HA的A/ O-A、芳香度和疏水性指數(shù)也發(fā)生了變化。由圖3可知，A/O-A和疏水性指數(shù)表現(xiàn)出CK ＞ NPK ＞OM的規(guī)律，說明施肥降低了有機(jī)碳的分解程度和疏水性特征。HA主要偏脂肪性，芳香度較低為0.29～0.33，施肥后芳香度略有降低。

3 討 論

3.1 長期施肥對潮土HA元素組成和δ13C值的影響

元素組成能簡單判別有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性［10］。本研究表明長期施肥尤其是有機(jī)肥降低了HA的C含量，增加了N和O含量（表2），與吳景貴等［2］及孟安華和吳景貴［10］的研究結(jié)果一致。有機(jī)肥和NPK肥的施用相比不施肥對照增加了土壤中的全氮和有效氮含量（表1），這部分增量則可能通過腐殖化過程反映在胡敏酸N含量的增加上。施肥后HA的（N+O）/C比值增加，表明其極性增加，這和施肥后HA疏水性指數(shù)降低是一致的（圖3）；說明施肥后HA的電性增強(qiáng)，保肥能力貢獻(xiàn)更大［11］。同時(shí)HA的H/C增加、O/C增加，表明其飽和程度和氧化程度增加，縮合度減?。?］，暗示施肥后HA的脂肪性增加，這與施肥后芳香度降低是一致的（圖3）；O/C增加與烷氧基和甲氧基官能團(tuán)比例的增加（表3）一致。Dou等［8］向棕壤中添加有機(jī)肥培養(yǎng)180d后HA的H/C增加，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似；而向水稻土中加入有機(jī)肥后H/C則降低?？梢娛┓蕦A元素組成和原子比值的改變反映出土壤有機(jī)質(zhì)腐殖化過程的差異；施肥對胡敏酸H/C比的影響可能因土壤類型而異，旱地和水田中的腐殖化過程存在較大差異。

圖3 不同處理間HA的A/O-A、芳香度和疏水性指數(shù)變化Fig. 3 Variations of A/O-A，aromaticity and HI of humic acids under different treatments

長期施肥后潮土HA的δ13C值降低（表2），說明在C3作物小麥和C4作物玉米交替條件下，施肥導(dǎo)致HA的同位素組成出現(xiàn)差異。張晉京等［23］報(bào)道C3和C4植物交替條件下，田間施用有機(jī)肥以及有機(jī)肥配施化肥同樣也使HA的δ13C值呈下降趨勢。δ13C值的變化一方面與有機(jī)物料本身的δ13C值有關(guān)，另一方面也可能與HA的量和結(jié)構(gòu)相關(guān)，但尚不能證明二者之間存在顯著的相關(guān)性［23］。本研究由于施用的麥稈為C3植物（δ13C值范圍為-40‰～-23‰［24］）較對照組HA的δ13C （-22.11‰）低，說明有機(jī)肥中的碳有可能進(jìn)入到HA中，由此導(dǎo)致OM處理HA的δ13C值較不施肥對照更低。此外NPK和OM處理相對不施肥對照均顯著增加了小麥和玉米產(chǎn)量［25］，而作物產(chǎn)量一般能影響到土壤HA含量；但本研究中HA具有典型的C3特征，而非C4特征，說明來源于C4植物玉米的有機(jī)質(zhì)對δ13C值的影響有限。果膠、半纖維素、糖類和氨基酸一般富13C，而纖維素、脂類和木質(zhì)素等則虧13C［26］。NMR結(jié)果表明施肥后HA的糖類含量增加，OM處理的脂類降低，但同時(shí)施有機(jī)肥后木質(zhì)素比例也增加（表3），說明HA的結(jié)構(gòu)變化能一定程度上反映出δ13C值的變化趨勢，但δ13C值并不能完全反映HA的結(jié)構(gòu)，這印證了HA結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和非均一性［16］。

3.2 長期施肥對潮土HA結(jié)構(gòu)的影響

HA結(jié)構(gòu)與其生物活性相關(guān)，對其結(jié)構(gòu)的了解能進(jìn)一步認(rèn)識HA在土壤中的功能［27］。本研究中潮土HA的羰基比例很低（表3），說明很少有酮類物質(zhì)，與前人研究類似［8，28］。羧基比例在長期施肥后降低，朱青藤等［5］研究施有機(jī)肥后白土HA的羧基含量也降低，說明施肥后潮土的腐殖化過程發(fā)生變化［1］。Mao［7］和吳景貴［2］等的研究表明施用有機(jī)肥后土壤HA芳香族含量下降。相應(yīng)地，張奇春和王光火［3］及朱青藤［5］等報(bào)道不同配施化肥或有機(jī)肥使土壤HA的脂肪族含量增加。本研究也得到同樣的結(jié)果，施肥后芳香度和芳香族物質(zhì)比例降低、脂肪族物質(zhì)增加（表3），說明施肥后潮土HA脂肪性增強(qiáng)、分子結(jié)構(gòu)更加簡單［8，23］。長期施肥后HA芳香族比例的降低一方面是因?yàn)橹咀灞壤脑黾?，另一方面與土壤有機(jī)質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的變化也有關(guān)系。研究表明長期施肥可能導(dǎo)致土壤酶活性和微生物活性增強(qiáng)，加速大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體中芳香族物質(zhì)的氧化分解從而使潮土OM和NPK處理的全土有機(jī)質(zhì)芳香族比例降低［29］；該結(jié)果和本研究中HA芳香族物質(zhì)的減少是吻合的。Mao等［7］也發(fā)現(xiàn)無論是游離HA還是鈣結(jié)合HA，長期施用糞肥后其芳香族物質(zhì)均降低，其原因可能是微生物活性的增加加劇了類木質(zhì)素物質(zhì)的降解。

雖然長期施肥后HA芳香族物質(zhì)整體上減少而脂肪族物質(zhì)增加，但本研究發(fā)現(xiàn)施有機(jī)肥后酚碳比例增加，降低的主要是δ142～113的芳香碳；脂肪族物質(zhì)中增加的主要是烷氧基和甲氧基，而烷基比例降低（表3）。酚碳和甲氧基是木質(zhì)素的顯著特征［7］，而植物組織中含有較多的木質(zhì)素［30］；結(jié)果表明有機(jī)肥處理下的木質(zhì)素特征在腐殖化過程中更加明顯。烷基同木質(zhì)素一樣難以被微生物分解［29］，而OM處理的HA中烷基比例更低，說明施有機(jī)肥降低了HA中難分解物質(zhì)的比例。這可能是因?yàn)槭┯袡C(jī)肥提高了微生物的活性［31］，加劇了有機(jī)物的分解；另一方面還與有機(jī)肥中較多烷氧基引起的“稀釋效應(yīng)”有關(guān)。烷基的降低和烷氧基的增加導(dǎo)致施有機(jī)肥后HA的A/O-A降低（圖3），一定程度上證實(shí)了施有機(jī)肥降低了潮土有機(jī)質(zhì)的分解程度［29］。施用NPK肥也降低了HA的A/O-A，但不如OM處理明顯，說明NPK肥的施用對HA結(jié)構(gòu)的影響較小。

由于常規(guī)CP/MAS半定量技術(shù)［6，9，27］對HA結(jié)構(gòu)的分析受限，一些官能團(tuán)如異頭碳和芳香碳的吸收峰存在重疊現(xiàn)象，若籠統(tǒng)歸結(jié)為某一種官能團(tuán)有可能誤導(dǎo)對HA結(jié)構(gòu)和腐殖化過程的認(rèn)識。Cao等［28］利用高級NMR技術(shù)研究了美國愛荷華州農(nóng)田土壤HA的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HA中含有大量的質(zhì)子碳，異頭碳和烷氧基中碳非質(zhì)子化的比例較低，且δ64～44處主要為含氮烷基而非甲氧基，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均比較類似。本研究中還發(fā)現(xiàn)潮土HA 在δ113～93處除了異頭碳外，還含有一定的芳香碳，施有機(jī)肥能增加該區(qū)域的芳香碳比例，且主要以質(zhì)子化芳香碳為主（表3和表4）；一方面說明不同處理的HA在腐殖化過程中形成的途徑有所差異，另一方面也說明在今后的分析中有必要通過CSA技術(shù)來識別出真正的異頭碳。Mao等［7］研究發(fā)現(xiàn)長期施用無機(jī)肥較有機(jī)肥更能增加土壤鈣結(jié)合HA中的非質(zhì)子芳香碳，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同（表3），說明NPK處理的HA中可能有更多的碳源于黑炭［21］。OM處理較NPK處理的HA含有更多的含氮烷基，與Mao等［7］的結(jié)果也類似，說明施有機(jī)肥能增加HA中的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)等物質(zhì)［19］。本研究利用高級NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)的非質(zhì)子芳香碳不屬于Kelleher和Simpson［14］提出的生物大分子，不同施肥處理下HA的信號也存在諸多差異，因此否認(rèn)腐殖物質(zhì)特異性的依據(jù)并不充分［16］。

4 結(jié) 論

通過潮土上23年施有機(jī)肥和NPK肥的研究表明，施肥增加了土壤HA的N和O含量，降低了C含量，使HA飽和程度、氧化程度和極性增加，縮合度減小。施肥后δ13C值降低，且OM處理的HA更貧

13C，表明HA中新進(jìn)入了有機(jī)碳。高級NMR技術(shù)結(jié)果表明潮土HA以脂肪族化合物為主，含有大量的質(zhì)子化碳。芳香碳主要為質(zhì)子化碳，且在δ113～93處分布有少量質(zhì)子化芳香碳，施有機(jī)肥使該化學(xué)位移內(nèi)有更多比例的芳香碳。潮土HA中異頭碳和烷氧基的非質(zhì)子化比例很低，δ64～44處則主要?dú)w屬為含氮烷基而非甲氧基。施肥降低了HA羧基和δ142～113的芳香碳比例，但增加了烷氧基和甲氧基比例，施有機(jī)肥還增加了酚碳和含氮烷基比例，降低了烷基比例。整體上，施有機(jī)肥和NPK肥降低了HA的疏水性程度和分解程度。

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Effects of Long-term Application of Organic Manure and Chemical Fertilizer on Structure of Humic Acid in Fluvo-aquic Soil

XU Jisheng1，2ZHAO Bingzi1?ZHANG Jiabao1
（1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China）
（2 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

【Objective】Fertilization has become increasingly common to increase soil organic matter（SOM）content and improve soil fertility. Research suggests that fertilization promotes production of humic acids（HAs），one of the most important component of SOM. However little is known about the quantitative effects of fertilization on structural characteristics of HAs. Based on the long-term field fertilization experiment in Fegnqiu of Henan，effects of application of organic manure（OM），chemical fertilizer（NPK）and nothing（CK）on structure of HAs in fluvo-aquic soil were assessed.【Method】Soil samples were collected from the surface soil layers of three treatment plots，i.e. OM，NPK and CK，of a long-term winter wheat （Triticumaestivum L.）-summer maize（Zea mays L.）rotation experiment in Fengqiu，China. HAs were exhaustively extracted from the soil samples with a combined 0.1 mol L-1NaOH and 0.1 mol L-1Na4P2O7solution and obtained through precipitation after acidification with 6 mol L-1HCl. HF∶HCl（1%∶1%）solution was then used to purify the HAs obtained. In the end，the purified HAs were characterized with advanced solid-state13C nuclear magnetic resonance（NMR）spectroscopy coupled with elemental analysis and isotopic analysis（δ13C）. The NMR techniques included multiple cross-polarization/magic angle spinning （multiCP/MAS），dipolar-dephasing（DD），chemical-shift-anisotropy（CSA）filter and spectral editing of immobile CH2and CH.【Result】Results show that long-term fertilization changed the element compositions，δ13C ratios and carbon functional groups of HAs，particularly significant in Treatment OM，and increased saturation degree，oxidation degree and polarity of HAs，but decreased condensation degree of HAs. The decrease of HAs in δ13C values indicated incorporation of new organic carbon into HAs. Advanced NMR techniques revealed that HAs in fluvo-aquic soil were composed predominantly of aliphatic compounds with alkyl being the highest in percentage（24.1%～26.3%）. OCH3and NCH signals both resonated around δ64～44，while the latter was prominent in proportion. Besides，the proportion of nonprotonated carbon was very low in anomeric and O-alkyl. Among the aromatics of HAs，they were dominated with protonated carbon in δ142～113，while only a little aromatic carbon existed in δ113～93，which cannot be detected with the routine cross-polarization/magic angle spinning（CP/MAS）NMR. It was also found that long-term fertilization reduced the percentages of COO/N-C=O and aromatic carbon of δ142～113，but increased the percentages of O-alkyl and OCH3. Moreover，application of organic manure also increased the proportions of aromatic C—O and NCH，but decreased that of alkyl.【Conclusion】In conclusion，all the findings in this study indicate that HA structure tends to be less hydrophobic with decreasing degree of decomposition. The application of either OM or NPK increases the content of carbohydrates in HAs. The application of OM also increases the contents of lignin and peptides，but decreases the content of lipids. The study also suggests that the advanced NMR techniques could provide great insight into HA structure and mechanisms of HA formation relative to fertilization pattern.

Humic acid；Advanced nuclear magnetic resonance；δ13C；Elemental analysis；Organic manure；NPK fertilizer

S153.6

A

（責(zé)任編輯：盧萍）

* 國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0200107，2016YFD0300802）和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-03）共同資助 Supported by the National Key Research and Development Program（Nos. 2016YFD0200107，2016YFD0300802）and the Earmarked Fund for China Agriculture Research System（No. CARS-03）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：bzhao@issas.ac.cn

徐基勝（1987—），男，安徽安慶人，博士研究生，主要從事土壤有機(jī)質(zhì)研究。E-mail：jsxu@issas.ac.cn

2016-11-23；

2017-01-05；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2017-01-25

10.11766/trxb201611230392