盛 慧，杜偉玲

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

黃瓜Ca2+家族序列特征及其表達(dá)特性分析

盛 慧，杜偉玲

（哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

通過黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法獲得15個(gè)黃瓜Ca2+家族序列，并對(duì)其染色體位置、基因組位置、氨基酸長度、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和Pfam匹配結(jié)構(gòu)域數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用RT-PCR方法對(duì)所有搜索到的Ca2+家族基因進(jìn)行組織特異性分析；對(duì)黃瓜植株進(jìn)行低溫處理，分析黃瓜Ca2+基因家族的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：15個(gè)基因中除Csa021245未定位以外，其余均勻分布在1～6號(hào)染色體上，一致性為47.67%；Csa001688、Csa009857和Csa009360 等3個(gè)基因的5′區(qū)出現(xiàn)CpG島結(jié)構(gòu)；組織表達(dá)特異性分析結(jié)果顯示，Csa001688、Csa006826、Csa010172和Csa016434在葉中表達(dá)量最高，Csa003758、Csa010172 和Csa018949在根中表達(dá)量最高；進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，只有Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關(guān)系最近，這些基因可能在Ca2+家族信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著主要作用；實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析表明，Ca2+基因家族參與黃瓜對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答。

黃瓜；Ca2+家族；組織特異性；信號(hào)傳導(dǎo)

植物感受外界逆境反應(yīng)的傳導(dǎo)途徑和傳導(dǎo)方式一直備受關(guān)注。Ca2+作為胞內(nèi)的第二信使，參與許多細(xì)胞的調(diào)控和基因轉(zhuǎn)錄［1-3］，在植物對(duì)各種逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［4-7］中起著重要作用。董先平等［8］認(rèn)為，在生物進(jìn)化過程中，真核細(xì)胞形成了一套包括離子通道、離子泵和離子交換體等復(fù)雜的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，用來維持胞質(zhì)中的Ca2+平衡。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)主要是通過鈣結(jié)合蛋白將信息傳遞給下游基因。孫存華等［9］研究表明，逆境脅迫如干旱、低溫、熱激等都可誘發(fā)植物細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+信號(hào)及相應(yīng)的生理生化反應(yīng)。Roberto等［10］認(rèn)為在寄主植物中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化是一個(gè)組成部分的信號(hào)機(jī)制。Christoph［11］也證實(shí)在植物體內(nèi)，細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞最快、最有效的途徑是電信號(hào)，這與瞬間改變的Ca2+濃度是緊密相連的。植物對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)依賴于定位在不同細(xì)胞器和質(zhì)膜上的Ca2+通道、Ca2+泵和Ca2+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)子的活性［12-13］。Lourido等［14］研究表明，在細(xì)胞中與鈣離子結(jié)合的信號(hào)元件主要包括響應(yīng)元件和傳感元件兩類蛋白。響應(yīng)元件與鈣離子結(jié)合后能直接產(chǎn)生信號(hào)效果，因此既是鈣信號(hào)的感應(yīng)器又是鈣信號(hào)的效應(yīng)器，主要是一些鈣依賴蛋白激酶類蛋白［15-16］。它們既含有類似于鈣調(diào)蛋白的與鈣離子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，也含有蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域。傳感元件與鈣離子結(jié)合后還必須與目標(biāo)蛋白相互作用才能產(chǎn)生信號(hào)效果，目前已經(jīng)鑒定出包括鈣調(diào)素、鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白等多類鈣結(jié)合蛋白家族［17］?？傊?，Ca2+在植物生長發(fā)育、器官分化以及生理代謝方面都起到至關(guān)重要的作用。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個(gè)Ca2+泵基因，但大部分功能還不清楚。

目前，黃瓜基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但后續(xù)的功能驗(yàn)證及基因之間的相互作用關(guān)系尚不完善。為了鑒定黃瓜基因組中Ca2+家族成員，本研究根據(jù)擬南芥Ca2+泵基因ACA2的完整序列搜索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫，以期得到黃瓜基因組中與Ca2+有關(guān)的所有基因；對(duì)獲得的所有Ca2+家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)特異性分析，并分析低溫處理下黃瓜Ca2+基因家族的表達(dá)情況，為后續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

密刺型黃瓜品種M801-3，由哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃瓜育種試驗(yàn)室提供。黃瓜總RNA 的提取使用TaKaRa公司的RNAiso Plus and RNAisomate for Plant Tissue 試劑盒，mRNA 的分離、純化使用A.P mRNA Purification Kit。SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。LineGene 9620型實(shí)時(shí)熒光PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及mRNA分離 選取經(jīng)低溫處理［18］的黃瓜根、莖和葉組織樣，液氮處理后置于-70℃中保存?zhèn)溆??？俁NA 的提取、mRNA的分離、純化按照試劑盒說明書操作，mRNA純化后檢測(cè)樣品的濃度及純度。

1.2.2 黃瓜Ca2+基因家族搜索及其生物信息學(xué)分析 依據(jù)擬南芥Ca2+家族蛋白質(zhì)序列，反復(fù)檢索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.icugi.org/ cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi），經(jīng)過BLASTX篩選共得到15個(gè)黃瓜Ca2+家族序列。利用黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫確定基因在染色體上的位置，并利用DNAman 6.0 軟件對(duì)上述基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 組織表達(dá)特異性分析 利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異引物，分析上述基因在黃瓜根、莖和葉中的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)體系為：10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTP 1.0 μL，上下游引物 各 1.0 μL，Taq 酶0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl22.0 μL，模板 1.0 μL，無菌去離子水補(bǔ)足到15 μL。PCR反應(yīng)條件依據(jù)退火溫度而定，循環(huán)次數(shù)均為31個(gè)，具體引物序列詳見表1。

1.2.4 低溫處理下Ca2+基因家族的表達(dá)分析 將具有2～3片真葉的黃瓜植株，在4℃下處理0、2、4、12、24 h。葉片-80℃保存，用于總RNA提取。選取Csa001688進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。利用LineGene 9620型實(shí)時(shí)熒光PCR儀，采用兩步法，在60℃進(jìn)行熒光信號(hào)采集，反應(yīng)結(jié)束后繪制曲線圖。

表1 引物序列及退火溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜Ca2+基因家族序列生物信息學(xué)分析

利用網(wǎng)站上發(fā)布的擬南芥Ca2+基因家族蛋白質(zhì)序列（NM_119927.3）反復(fù)搜索黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫，共得到15個(gè)相關(guān)基因。其中，有5個(gè)序列分布于第1條染色體上，3個(gè)序列分布于第2條染色體上，2個(gè)序列分布于第4條染色體上，1個(gè)序列尚未定位，其余序列分布見表2，一致性為47.67%，Csa001688、Csa009857和Csa009360等3個(gè)基因的5′區(qū)出現(xiàn)CpG島結(jié)構(gòu)。

2.2 候選基因序列比對(duì)

利用DNAMAN6.0對(duì)擬南芥和黃瓜中的Ca2+基因家族氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果（圖1，封二）表明，Csa002070、Csa002837、Csa003758、Csa005375、Csa015954、Csa016434、Csa018475和Csa018949同源性較高；Csa010172與擬南芥同源性最高；Csa009360與其他氨基酸序列差異最大，不具有全部保守序列結(jié)構(gòu)域；Csa009857所編碼的氨基酸只具備Ca2+基因家族部分功能。

表2 黃瓜Ca2+基因家族生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖2 黃瓜Ca2+家族成員與擬南芥蛋白的進(jìn)化樹

2.3 黃瓜Ca2+基因家族進(jìn)化樹分析

用DNAMAN6.0 軟件將黃瓜15個(gè)Ca2+家族蛋白序列與擬南芥AtACA2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析。從圖2可以看出，黃瓜Ca2+基因家族蛋白主要分為兩類，其中Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關(guān)系最近，Csa001688、Csa009857和Csa021245與擬南芥AtACA2關(guān)系稍遠(yuǎn)，其他Ca2+基因家族蛋白成員聚集在一起。

2.4 黃瓜Ca2+基因家族組織表達(dá)特異性分析

對(duì)15個(gè)黃瓜Ca2+基因家族進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析。從圖3（封二）可以看出，Csa003758、Csa006135、Csa010172、Csa018475和Csa018949等5個(gè)基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，其中Csa003758在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖和根，Csa006135在根中的表達(dá)量較低；Csa009360和Csa009857在所有組織中均無表達(dá)；Csa001688、Csa002070、Csa005375和Csa016434只在葉片中有表達(dá)；Csa002837和Csa021245在葉和莖中有表達(dá)，且表達(dá)量相近；Csa015954在葉和根中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量較弱，莖中未見。

2.5 低溫處理下黃瓜Ca2+基因家族表達(dá)分析

試驗(yàn)選取Csa001688進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果（圖4）顯示，Csa001688基因在4℃處理12 h的表達(dá)量達(dá)到最高峰，處理24 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)急劇下降，表明Csa001688基因參與低溫脅迫的應(yīng)答。

圖4 低溫脅迫下Csa001688基因的實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

Ca2+作為細(xì)胞信使的基礎(chǔ)是胞漿Ca2+與胞內(nèi)鈣庫之間存在濃度梯度，當(dāng)某種刺激使胞內(nèi)Ca2+濃度大幅度增加時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)［19-21］。在植物細(xì)胞中，Ca2+與其他離子有著本質(zhì)區(qū)別，Ca2+不可移動(dòng)，它不能從老的葉片撤離而補(bǔ)充到新生的年輕細(xì)胞中，因此Ca2+必須不斷補(bǔ)充到年輕細(xì)胞的胞內(nèi)Ca2+貯存庫，特別是莖尖和根尖分生區(qū)和伸長區(qū)細(xì)胞。Ca2+泵（Ca2+- ATPase） 屬于P-型ATPase家族，直接利用ATP驅(qū)動(dòng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)［22-24］。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14種Ca2+泵，大部分功能還不清楚。

本研究利用測(cè)序已完成的黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫，以擬南芥Ca2+泵基因ACA2的完整序列為模板，共得到15個(gè)黃瓜Ca2+基因家族成員。經(jīng)過生物信息學(xué)分析可知，成員內(nèi)部之間存在高度保守序列，且序列一致性為47.67%。15個(gè)基因中除Csa021245未定位以外，其余均勻分布在1～6號(hào)染色體上；進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，只有Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關(guān)系最近；Csa009360和Csa009857在根、莖和葉中均未檢測(cè)到表達(dá)，可能與低溫誘導(dǎo)的時(shí)間有關(guān)或只在花和果實(shí)等部位特異表達(dá)。15個(gè)基因中，除Csa009360和Csa009857外，其余13個(gè)基因均在葉中有表達(dá)，推測(cè)葉片對(duì)于外界刺激最為敏感，莖部次之，根部最差。但是這13個(gè)基因如何參與逆境調(diào)控還有待進(jìn)一步探討。試驗(yàn)選取Csa001688進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果顯示，Csa001688基因在低溫4℃處理12 h時(shí)達(dá)到表達(dá)最高峰，表明Csa001688基因參與低溫脅迫的應(yīng)答。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Analysis on sequence characteristics and expression of Ca2+family of cucumber

SHENG Hui，DU Wei-ling
（Biological Center，Harbin Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150029，China）

Fifteen sequences of Ca2+family in cucumber were indentified from Cucumber Genome Database using bioinformatics methods，and the chromosomal location，genomic position，amino acid length，transcription initiation site and Pfam matching domain were predicted. At the same time，sequence similarity and phylogenetic tree were analyzed. Cucumber plants were exposed to low temperature，and the expression of Ca2+gene family was analyzed. The results showed that 5 sequences distributed on the first chromosome，3 sequences distributed on the second chromosome，2 sequences distributed on the fourth chromosome，1 sequence was not located，the remaining sequences evenly distributed on other chromosomes. With RT-PCR technique，the expressions of Csa001688，Csa006826，Csa010172 and Csa016434 in leaves were higher， the expressions of Csa003758，Csa010172 and Csa018949 in roots were higher. Phylogenetic tree analysis showed that，only Csa010172 and Csa009360 were close with Arabidopsis AtACA2，these genes may play important roles in Ca2+family signal transduction. Real - time quantitative expression analysis showed that Ca2+gene family was involved response to low temperature stress in cucumber.

cucumber； Ca2+family； tissue specificity； signal transduction

S642.2；Q786

A

1004-874X（2017）03-0061-06

2016-12-25

哈爾濱市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2006HE6BE052）

盛慧（1976-），女，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，E-mail：shenghui415128@163.com

盛慧，杜偉玲.黃瓜Ca2+家族序列特征及其表達(dá)特性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（3）：61-66.