王濟(jì)緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

·藥學(xué)研究·

嘎狗嚕對(duì)肢體缺血再灌注損傷大鼠的抗炎作用研究

王濟(jì)緯 蘭 俊 許榮成 鄧連成 劉 斌 鄢連和 陳科 雷后興

大鼠；再灌注損傷；嘎狗嚕；炎癥因子

肢體缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是一種臨床常見(jiàn)損傷，處理不當(dāng)會(huì)引起嚴(yán)重的臨床后果。其病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，包括細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、鈣超載、血管內(nèi)皮損傷、缺血后的微循環(huán)障礙等方面，而炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[1-2]，發(fā)生IRI會(huì)刺激機(jī)體炎性細(xì)胞在肢體的聚集，同時(shí)表達(dá)產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，而這些炎性因子反過(guò)來(lái)刺激更多的炎性反應(yīng)，加重再灌注損傷。研究[3]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）在其中起著非常重要的作用。文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道，畬藥嘎狗嚕（地稔，Melastoma dodecandrum Lour，MDL）具有抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)觀察畬藥嘎狗嚕水煎液對(duì)肢體缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)的影響及作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡清潔級(jí)健康SD大鼠，體質(zhì)量200～250g，雌雄各15只，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SYXK（浙）2010-0150。適應(yīng)性飼養(yǎng)，雌雄分養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前夜禁食，自由飲水。

1.2 畬藥配置MDL全草由麗水市畬族醫(yī)藥研究所提供。取MDL原藥材1kg，剪碎后分別以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次30min，合并3次煎煮液濾過(guò)、離心，濃縮至1g生藥/mL的MDL濃縮液置于冰箱冷藏備用，實(shí)驗(yàn)用MDL水煎液由MDL濃縮液+純水稀釋配制而成，濃度0.2g/mL。灌胃劑量為1次10mL/kg，1天1次。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑南京SOPTOP舜宇顯微鏡ST60，上海手術(shù)器械廠800型離心機(jī)，Mutuskan MK3酶標(biāo)儀。Multi sciences公司生產(chǎn)的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1，批號(hào)238960234）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，批號(hào)230660752）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)238260734）試劑盒。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及造模30只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和藥物組，每組10只。大鼠術(shù)前禁食12h，自由飲水，術(shù)前10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。每2h追加1次維持麻醉，劑量減半。麻醉成功后，大鼠仰臥位，四肢固定于木板上，取右腹股溝切口，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，剪開(kāi)皮膚，在手術(shù)顯微鏡下顯露股動(dòng)、靜脈及股神經(jīng)，分離出右側(cè)股動(dòng)脈。假手術(shù)組僅單純游離股動(dòng)脈，不阻斷，直接縫合皮膚。模型組和藥物組大鼠用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)股動(dòng)脈，顯微鏡下確認(rèn)阻斷動(dòng)脈血流后，縫合切口兩針，再次消毒。同時(shí)予以右大腿根部橡皮帶環(huán)扎，阻斷側(cè)支循環(huán)。4h后松解橡皮帶，拆線，取出動(dòng)脈夾，并檢查血管是否通暢，以確認(rèn)恢復(fù)右下肢血流灌注，縫合創(chuàng)口。藥物組造模后第2天開(kāi)始灌胃中藥，另兩組灌胃等量生理鹽水，每天1次，共喂5天；第6天三組大鼠麻醉后，心尖取血，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.2 血漿組織細(xì)胞因子水平檢測(cè)取血4mL入促凝管（促凝劑+分離膠）,靜置30min待血清部分析出后，再予離心機(jī)離心，3000rpm，10min。分離血清后裝入無(wú)菌Epperdorf管置于-75℃超低溫冰箱中保存，統(tǒng)一檢測(cè)。ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度均采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。將血清標(biāo)本從-75℃超低溫冰箱中取出，緩慢恢復(fù)至室溫；準(zhǔn)備所有試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；復(fù)孔加入100μL兩倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品；樣本孔加入50μL 1×檢測(cè)緩沖液和50μL樣本；每孔加入50μL稀釋的檢測(cè)抗體；室溫孵育2h；洗滌6次；每孔加入100μL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；室溫孵育45min；洗滌6次；每孔加入100μL顯色底物，避光，室溫孵育20min；每孔加入100μL終止液；30min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，參考波長(zhǎng)630nm。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的OD450吸光值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的ICAM-1、IL-6、TNF-α濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)法，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組ICAM-1含量與假手術(shù)組比較顯著升高（P<0.05），模型組IL-6、TNF-α與假手術(shù)組比較有非常顯著升高（P<0.01）。藥物組ICAM-1、IL-6、TNF-α與模型組比較均有非常顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 MDL提取液對(duì)肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

表1 MDL提取液對(duì)肢體IRI模型大鼠血清炎性因子的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01. ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；IL-6：白細(xì)胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

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3 討論

缺血再灌注損傷可在全身多部位發(fā)生，肢體、心臟、肝臟、肺臟、腦部、腎臟、小腸等都是好發(fā)部位[3，6-7]，同時(shí)這些部位的再灌注損傷又會(huì)影響全身相關(guān)重要器官及系統(tǒng)，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），處理不及時(shí)可造成持續(xù)的不可控的炎癥反應(yīng)，其產(chǎn)生的炎性介質(zhì)會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，并影響重要器官微循環(huán)，引起凝血功能障礙，導(dǎo)致多臟器功能障礙綜合征（MODS）[8]。

嘎狗嚕系畬族民間的常用藥物，具有解毒消腫、祛瘀活血之功能。ICAM-1參與免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。ICAM-1、IL-6和TNF-α作為經(jīng)典的炎癥因子指標(biāo)，可以準(zhǔn)確表達(dá)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鉗夾股動(dòng)脈及橡皮片捆扎肢體造成大鼠缺血再灌注損傷，造模后相關(guān)指標(biāo)升高，成功造成肢體缺血再灌注損傷動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)，MDL水煎提取液能夠明顯減少血液中炎癥因子的表達(dá)，表明MDL水煎提取液可以通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)抑制大鼠炎癥反應(yīng)。

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［7］王曉琴，陳麗.舒芬太尼預(yù)處理對(duì)老年人肢體缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和心肌肌鈣蛋白I的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2016，10（9）：1283-1286.

［8］北京市科委重大項(xiàng)目“MODS中西醫(yī)結(jié)合診治/降低病死率研究”課組．多器官功能障礙綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)、病情嚴(yán)重度評(píng)分及預(yù)后評(píng)估系統(tǒng)和中西醫(yī)結(jié)合證型診斷［S］．中國(guó)危重癥急救醫(yī)學(xué)，2008，20（1）：1-3.

（收稿：2016-10-12修回：2106-10-22）

浙江省麗水市重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No.2012CXTD09-06）

浙江省麗水市人民醫(yī)院（麗水323000）

雷后興，Email：zjleihx@163.com