劉建方趙國強

當歸對膠原性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響

劉建方趙國強

目的觀察當歸對膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠血清單核細胞趨化因子-1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的影響。方法清潔級Wistar大鼠30只，隨機分為空白對照組、膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組和當歸低、高劑量組，每組6只。除空白對照組外，采用Ⅱ型膠原免疫法制備膠原性關(guān)節(jié)炎模型。、甲氨蝶呤組每次給藥1mg/kg，每周2次，腹腔注射；當歸低、高劑量組分別灌飼當歸煎液0.75g（kg·d）和1.5g（kg·d），空白對照組和模型組灌飼等量生理鹽水，持續(xù)3周。觀察大鼠血清MCP-1、MMP-3及大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。結(jié)果造模后，各藥物組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠MCP-1均有降低[（139.20±11.69）pg/mL、（151.64±13.42）pg/mL比（179.21±13.79）pg/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠MMP-3均有降低[（1.57±0.19）ng/mL、（1.69±0.21）ng/mL比（2.04±0.27）ng/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當歸高劑量組的大鼠關(guān)節(jié)腫脹評分均有降低[（2.83±0.41）分、（3.33±0.52）分比（3.83± 0.41）分，P＜0.05）]。結(jié)論當歸能不同程度降低膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清MCP-1、MMP-3含量，且同時減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。

大鼠；膠原性關(guān)節(jié)炎；當歸；MCP-1；MMP-3；關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，最終常致關(guān)節(jié)畸形[1-2]。單核細胞趨化因子-1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）作為重要的細胞炎癥參與因子，在機體免疫性疾病中扮演重要的角色。筆者通過觀察當歸煎液對大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）血清MCP-1、MMP-3的變化，了解當歸對類風濕關(guān)節(jié)炎可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級Wistar大鼠30只，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0180，體質(zhì)量220～250g，由浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供并常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠分籠飼養(yǎng),每籠6只，室溫20～22℃，通過自動換氣裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)空氣，人工調(diào)節(jié)熒光照明，每天明暗各12h，常規(guī)全價飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2 藥物及主要試劑當歸購自浙江中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，取當歸500g，加適量蒸餾水浸30min，煮沸10min后小火再30min，過濾；殘渣再次加蒸餾水煮沸，再小火30min，反復3～4次，濃縮至100mL。最后用蒸餾水調(diào)制到1000mL，制成每毫升含0.5g生藥的當歸煎液。依照人體單位體質(zhì)量生藥量求得大鼠的單位體質(zhì)量生藥量,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Ⅱ型膠原：美國sigma試劑公司，批號（060069）；不完全弗氏佐劑：美國sigma試劑公司，批號（104K8926）；MCP-1序列號（CSB-E08478r）、MMP-3ELISA序列號（CSB-E08534r）試劑盒：由美國ADL公司分裝，杭州方順生物技術(shù)有限公司提供，。

1.3 動物模型建立SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用Ⅱ型膠原誘導法制備CIA模型[3]：將Ⅱ型膠原溶解于0.1mol/L的冰乙酸中制備Ⅱ型膠原溶液（終濃度為2g/L），將Ⅱ型膠原溶液滴加至冷的等體積不完全弗氏佐劑中，充分乳化。于第1天及第7天下午3時進行Ⅱ型膠原乳化劑注射，醫(yī)用酒精消毒后每只大鼠尾部多點注射，每點約0.1mL，注射總量0.5mL。術(shù)后注意創(chuàng)面消毒，保持清潔。空白對照組給予生理鹽水注射，其他操作同造模組。

1.4 動物分組與給藥SD大鼠30只按數(shù)字隨機表法隨機分為空白對照組、膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組、當歸低劑量組和當歸高劑量組，每組6只。CIA造模成功后1周開始給藥?？瞻讓φ战M及CIA模型組每日給予等量生理鹽水；甲氨蝶呤組每周周一、周四上午9時給予甲氨蝶呤1mg/kg，腹腔內(nèi)注射；當歸低劑量組每日上午9時予0.5g/mL當歸煎液0.75g灌飼；當歸高劑量組每日9時和16時灌飼當歸煎液0.75g/d，各1次。各組均連續(xù)給藥3周。

1.5 標本制備與指標檢測（1）給藥前及給藥過程中記錄各組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹部位及程度，采用腫脹指數(shù)評分系統(tǒng)[4]進行評價。0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹；2分：小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹。（2）血清標本制備：予2%戊巴比妥鈉（40mg/ kg）腹腔麻醉，仰臥固定，乙醇消毒后，緩慢抽取大鼠頸動脈血1mL，置于PE管中，3000r/min離心l0min，分離血清，于-70℃凍存，待全部實驗結(jié)束后采用ELISA法測定血清MCP-1、MMP-3含量，操作嚴格按照試劑說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 當歸煎液對大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響與空白對照組比較，余四組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評分增高（P＜0.05）；與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評分均明顯降低（P＜0.05）；當歸低劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評分與CIA模型組比較有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。當歸低、高劑量組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均高于甲氨蝶呤組（P＜0.05）；低、高劑量當歸組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠給藥前后關(guān)節(jié)腫脹評分比較

表1 四組大鼠給藥前后關(guān)節(jié)腫脹評分比較

注：與CIA模型組比較，*P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P＜0.05；與空白對照組比較；△P＜0.05；CIA：膠原性關(guān)節(jié)炎

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2.2 當歸煎液對大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響與空白對照組比較，CIA模型組、甲氨蝶呤組及不同劑量當歸組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當歸高劑量組大鼠血清MCP-1、MMP-3明顯降低（P＜0.05）。當歸低劑量組血清MCP-1、MMP-3較CIA模型組降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與甲氨蝶呤組比較，當歸高、低劑量組血清MCP-1、MMP-3均升高（P＜0.05）。當歸低、高劑量組血清MCP-1、MMP-3比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎為難治性自身免疫性疾病，如沒有有效治療，往往造成關(guān)節(jié)畸形和強直[5]。研究表明，類風濕性關(guān)節(jié)炎病程中，MCP-1等趨化因子在炎性細胞遷移、浸潤過程中起了重要作用[6]。大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型，能夠很好模擬類風濕性關(guān)節(jié)炎的臨床特點和病理改變，因此常用它來證實某些臨床藥物對風濕性關(guān)節(jié)炎的治療機制和臨床效果[3]。

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

注：與空白對照組比較，△P<0.05；與CIA模型組比較，*P<0.05；與低劑量當歸組比較，#P<0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P<0.05；MCP-1：單核細胞趨化因子-1；MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶-3

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MCP-1是機體內(nèi)一種常見的細胞趨化因子，主要通過促使炎性細胞特別是單核細胞等的遷移、浸潤，造成局部關(guān)節(jié)軟骨破壞、病變[7]。動物實驗表明[8-9]，將MCP-1注射到兔的關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜上出現(xiàn)顯著的巨噬細胞浸潤；從類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中也可檢測到高滴度的MCP-1，兩者均提示MCP-1是風濕性關(guān)節(jié)炎重要的致病性細胞因子。本研究顯示，CIA模型組在制模后3周血清MCP-1濃度明顯增加，說明MCP-1參與了膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能使細胞外基質(zhì)的所有蛋白成分降解，從而導致韌帶、軟骨及骨的破壞。MMPs的活化被認為是細胞外基質(zhì)降解的限速環(huán)節(jié)[10]，機體組織內(nèi)的金屬蛋白酶組織抑制劑可抑制MMPs的活性，從而保持一種動態(tài)平衡，一旦平衡打破，多種病理過程就會隨之產(chǎn)生[11]。MMP-3為基質(zhì)金屬蛋白酶組的一種，與類風濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切，在晚期類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜中，MMP-3的基因和蛋白均有過度表達，滑膜液中含有大量MMP-3，血清中濃度也明顯升高[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，CIA模型組在制模后3周，MMP-3血清平均值較空白對照組升高近一倍，提示MMP-3可能是疾病作用機制中的一個因子。而通過甲氨蝶呤和高劑量當歸的持續(xù)應用，大鼠MMP-3平均濃度均有明顯下降，說明當歸煎液能夠明顯減少膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠中血清MMP-3的產(chǎn)生，從而抑制MMP-3對關(guān)節(jié)軟骨的進一步破壞。

當歸為多個中藥湯劑的主要成分，如當歸芍藥湯劑、當歸補血湯等。實驗結(jié)果顯示，當歸對機體多個系統(tǒng)有明顯的保護作用[15-17]，當歸水浸出液可顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能；其次，它還有非特異性的抗炎作用，包括對關(guān)節(jié)的急、慢性炎癥有顯著的抑制作用，降低炎性因子的含量，減少毛細血管的通透性，減輕水腫。以當歸為主的湯劑治療類風濕性關(guān)節(jié)炎可能正是通過以上途徑來阻止關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展，從而減輕和改善關(guān)節(jié)及全身癥狀。本組CIA制模后給予不同劑量的當歸煎液持續(xù)3周，不同程度減少大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕組織水腫，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)較CIA模型組減少，能夠明顯減少參與關(guān)節(jié)炎癥的細胞趨化因子如MCP-1濃度。本實驗發(fā)現(xiàn)，高劑量當歸煎液組用藥后3周血清平均MCP-1較CIA模型組明顯下降（P＜0.05），提示高濃度當歸煎液能夠顯著減少MCP-1的產(chǎn)生。然而當歸高低劑量組與甲氨蝶呤組相比，MCP-1血清濃度還是明顯升高，顯示通過單一的當歸作用機制，很難完全控制住膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)某些細胞因子水平，也不能阻斷疾病的繼續(xù)發(fā)展。但當歸作為湯劑的一個有效成分，是否能夠與中藥湯劑中的其他成分一起發(fā)揮作用，從而通過減少機體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶、細胞趨化因子等方法控制疾病，值得進一步研究。

［1］Bukhari M，Harrison B，Lunt M，et al.Time to first occurrenceoferosionsininflammatorypolyarthritis：Results from a prospective community-based study［J］.Arthritis& Rheum，2001，44（6）：1248-1253.

［2］Zheng YQ，Wei W.Total glucosides of paeony suppresses adjuvant arthritis in rats and intervenes cytokine-signaling between different types of Synoviocytes［J］.International Immunopharmacology，2005，5（10）：1560-1573.

［3］李寶麗，唐方，龐曉東.Ⅱ型膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備［J］．中國免疫學雜志，2006，22（4）：350-352.

［4］宋姍姍，張玲玲，魏偉.實驗性關(guān)節(jié)炎動物模型建立及病理機制研究進展［J］.中國藥理學通報，2011，27（12）：1648-1652.

［5］Markku K，Leena L，Pekka H，et al.Retardation of joint damage in patients with early rheumatoid arthritis by initial aggressive treatment withdisease-modifying antirheu matic drugs：Five-year experience from the FIN-RACo study［J］.J Arthritis &Rheum，2004，50（7）：2072-2081.

［6］Haringman JJ，Ludikhuize J，Tak PP.Chemokines in joint disease：the key to inflammation［J］.J Annals of the Rheumtic Diseases，2004，63（10）：1186-1194.

［7］Szekanecz Z，Kim J，Koch AE.Chemokines and chemokine receptors in rheumatoid arthritis［J］．Semin Immunol，2003，15（1）：15-21.

［8］Rudolph EH，Woods JM.Chemokine expression and regulationofangiogenesisinrheumatoidarthritis［J］.CurrPharmDes，2005，11（5）：613-631.

［9］Haringman JJ，Tak PP.Chemokine blockade：a new era in the treatment of rheumatoid arthritis?［J］.Arthritis Res& Therapy，2004，6（3）：93-97.

［10］CataniaJM，Chen G，Parrish AR.Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies［J］.Am J Physiology Renal Physiol，2007，292（3）：905-911.

［11］林其徳，陸佩華，汪希鵬，等.原因不明習慣性流產(chǎn)患者與人類白細胞抗原-DQ區(qū)域基因多態(tài)性的研究［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2001，36（5）：293-295.

［12］胡偉，榮超，陳飛虎，等.基質(zhì)金屬蛋白酶在類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用研究進展［J］.安徽醫(yī)學，2001，32（5）：671-672.

［13］Ishiguro N，Ito T，Obata K，et al.Determination of stromelysin-1，72 and 92 kDa type IV collagenase，tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1），and TIMP-2 in synovial fluid and serum from patients with rheumatoid arthritis［J］．J Rheumatol，1996，23（9）：1599-1604.

［14］Klimiuk PA，Sierakowski SR，Latosiewicz R，et al.Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in different histological variants of rheumatoid synovitis［J］.Rheumatology，2002，41（1）：78-87.

［15］楊鐵虹，賈敏，梅其炳.當歸多糖組分促進淋巴細胞增殖及對IL-2和IFN的誘生作用［J］.中藥材，2005，28（5）：405-407.

［16］儲岳峰，顏新敏，胡元亮，等.幾種中藥成分的免疫增強活性及其作用效果［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35（1）：67-70.

［17］龍銳，楊芳，杜俊蓉，等.當歸內(nèi)酯對免疫抑制小鼠免疫功能的重建作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（3）：398-402.

（收稿：2016-08-14修回：2016-10-09）

Effect of Chinese Angelica on MCP-1 and MMP-3 in Rats with Collagen-induced Arthritis

LIU Jianfang, ZHAOGuoqiang.DepartmentofOrthopedics,Children'sHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity, Hangzhou(310051),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese angelica on the expression of serum monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in collagen-induced arthritis（CIA）model rats.MethodsThirty Wistar rats were randomly divided into blank control group,CIA model group, methotrexate group,and low and high doses of Chinese angelica groups,with 6 rats in each group.Except for blank control group,CIA models were established in other four groups.Methotrexate group

methorexate intraperitoneally twice a week,1mg/kg.Chinese angelica decoction was given to rats by gavage at dose of 0.75g（kg· d）and 1.5g（kg·d）in low and high doses of Chinese angelica groups,respectively.Blank control group and model group were administered with equivalent volume of saline.The treatment course lasted for 3 weeks.The serum levels of MCP-1 and MMP-3 were observed and the swelling scores of rats'joints were calculated.ResultsThe serum MCP-1 and MMP-3 increased in all CIA rats（P<0.05）.Compared with model group,methotrexate group and high dose of Ch-inese angelica group had decreased serum MCP-1（139.20±11.69pg/mL,151.64±13.42pg/mL vs 179.21±13.79pg/mL,P<0.05）and serum MMP-3（1.57±0.19ng/mL,1.69±0.21ng/mL vs 2.04±0.27ng/mL,P< 0.05）,and lower swelling score of the joints（2.83±0.41,3.33±0.52 vs 3.83±0.41,P<0.05）.ConclusionChinese angelica can reduce the serum level of MCP-1 and MMP-3 and alleviate the swelling of the joints in rats with CIA.

rats;collagen-induced arthritis;Chinese angelica;MCP-1;MMP-3;joint swelling index

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2013ZA085）

浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院骨科（杭州310051）

趙國強，Tel：13858020847；E-mail：friendlongzju@163.com