武麗芳，杜劍峰

miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)及臨床意義

武麗芳，杜劍峰

目的：探討神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中微小 RNA-132（miR-132）的表達(dá)及臨床意義。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè)新鮮神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本 135例及正常腦組織標(biāo)本53 例中 miR-132 的表達(dá)，分析其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征關(guān)系、診斷價(jià)值及與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織（P＜0.05）；miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織高表達(dá)和低表達(dá)組在腫瘤切除程度、WHO 分級(jí)、KPS 評(píng)分方面差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；ROC 曲線分析 AUC=0.856（P＜0.001），靈敏性和特異性分別是 52.7%和 86.6%，Youden 指數(shù)為 0.465；miR-132 高表達(dá)和低表達(dá)組在總生存時(shí)間及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間上的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論：miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的，可能可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新型生物標(biāo)記物和診斷靶標(biāo)。

miR-132；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；ROC 曲線；臨床病理特征；生物標(biāo)記物

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性惡性腦瘤 ，世 界 衛(wèi) 生 組 織（World Health Organization，WHO）根據(jù)病理組織惡性程度將原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為4個(gè)等級(jí)，1、2級(jí)是低等級(jí)膠質(zhì)瘤，3、4 級(jí)是高等級(jí)膠質(zhì)瘤[1]。高等級(jí)膠質(zhì)瘤1年總體生存率為40%，5年生存率不足10%，因此迫切需要新的治療方法和新型腫瘤標(biāo)記物用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷及治療。

微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類小的、內(nèi)源性的非編碼 RNA，通過(guò)與mRNAs的3’端UTR互補(bǔ)結(jié)合從而負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[2]。miRNAs通過(guò)靶向多個(gè)基因，對(duì)大量重要的生理和病理功能過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。異常miRNAs表達(dá)通常與各種不同惡性腫瘤的形成有關(guān)，同時(shí)失調(diào)的miRNAs具有癌基因或抑癌基因的特性[2]。作為 miRNAs家族中的一員，miR-132在炎癥、血管新生及神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的作用[3]。miR-132 的失調(diào)與非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[4-6]。但 miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和臨床意義還未見相關(guān)報(bào)道，因此，本文旨在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤中 miR-132 的表達(dá)、臨床病理以及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集 2010 年 3 月至 2012 年3月我院確診的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本135例為膠質(zhì)瘤組，患者年齡28～74歲，平均年齡（47.7±7.8）歲；根據(jù) WHO 分級(jí)，1 級(jí)纖維性星形細(xì)胞瘤 26 例，2 級(jí)彌漫性星形細(xì)胞瘤 28例，3級(jí)間變星形細(xì)胞瘤39例，4級(jí)惡性膠質(zhì)瘤42例；所有患者手術(shù)前均未接受化療或放療；所有患者都簽署同意書，并通過(guò)電話或者家訪的形式定期隨訪48月，記錄患者的生存狀況和疾病進(jìn)展情況。同期腦損傷或腦出血患者53例，行顱內(nèi)減壓術(shù)時(shí)獲取正常腦組織為對(duì)照組。所有標(biāo)本取完后立即保存于液氮中備用。

1.1.2 試 劑 和 儀 器 RNA 提 取 試 劑 Trizol（Invitrogen, Carlsbad,CA,USA），NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer（NanoDrop Technologies,Houston,TX,USA），Prime-Script逆 轉(zhuǎn) 錄 -PCR 試 劑 盒（NCode ? SYBR?Green miRNA quantitative real-time PCR）購(gòu) 自 Invitrogen 公司，Premix EX Taq DNA 聚合酶購(gòu)自 TaKaRa 公司，ABl7300熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI公司。

1.2 方法

①RNA提取：組織破碎儀破碎組織后分別提取2組的總 mRNA，具體操作參考 Trizol?RNA 提取試劑盒說(shuō)明；Nanodrop 測(cè)定總 mRNA 的含量和濃度，所有RNA 測(cè)量吸光度（A）值，保證 RNA 的完整性（A260/ A280＞2.0）。②cDNA 逆轉(zhuǎn)錄：總 mRNA 按照 Invitrogen 公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成 miR-132 及內(nèi)參 U6B 的 cDNA。③real-time PCR：用 SYBR Green試劑盒進(jìn)行 real-time PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：1 μL cDNA (500 ng/20μL)，0.6 μL 引物 (10 pmol/L)，9 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，無(wú) RNA 酶水 8.4 μL。 反應(yīng) 條件：95 ℃ 2 min 預(yù)熱，95 ℃ 15 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，68 ℃ 30 s延伸，40 個(gè)循環(huán)。引物序列為 miR-132：正向引物 5’-TGGATCCCCCCCAGTCCCCGTCCCTCAG-3’，反向引物 5’-TGAATTCGGATACCTTGGCCGGGAGGAC-3’；U6B：正向引物 5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，反向引物 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著性的高表達(dá)

qRT-PCR 定量分析結(jié)果顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中 miR-132 的相對(duì)表達(dá)量為（4.448±1.857），顯著高于正常組的（1.936±0.543）（P＜0.001），見圖 1。

圖1 qRT-PCR 定量分析 miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)差異

2.2 miR-132 表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)患者腫瘤 miR-132 表達(dá)高低分為 2 亞組，表達(dá)量高于平均值的為高表達(dá)亞組68例，低于平均值的為低表達(dá)亞組 67 例。對(duì) miR-132表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)2亞組的年齡、性別及照射模式差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而切除程度、WHO分級(jí)、KPS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.3 miR-132 作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤潛在生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值

用 ROC 曲線評(píng)價(jià) miR-132作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤中潛在的生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值，見圖 2。其中 cut-off值是7.361；ROC 曲 線 下 面 積 AUC 為 0.856（95%CI，0.7141～0.9112；P＜0.001）；靈 敏 性 和 特 異 性 分 別 是52.7%和 86.6%；Youden 指數(shù)為 0.465。此 ROC 曲線提示miR-132在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中具有診斷價(jià)值。

2.4 miR-132 表達(dá)對(duì)患者生存關(guān)系影響

miR-132 高表達(dá)亞組患者的總體生存時(shí)間為 27 個(gè)月（95%CI為 23.2～31.6），無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為 18 個(gè)月（95%CI為 16.7～21.8）；miR-132 低表達(dá)亞組總體生存時(shí)間為 43 個(gè)月（95%CI為 35.7～46.3），無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間為 47 個(gè)月（95%CI為 36.7～49.2）。對(duì) 2 亞組患者采用 Kaplan-Meier法進(jìn)行生存數(shù)據(jù)假設(shè)檢驗(yàn)比較的 logrank檢驗(yàn)表明，miR-132 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者總生存時(shí)間（χ2=8.517，P=0.0072＜0.01）及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間（χ2= 6.554，P=0.0084＜0.01）上的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可認(rèn)為 2 亞組生存曲線不同。提示 miR-132 高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后緊密相關(guān)，見圖3。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 miR-132 表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的 miR-132 ROC 曲線

3 討論

由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤早期階段無(wú)癥狀進(jìn)展[7]，患者的預(yù)后通常不好。因此有必要理解膠質(zhì)瘤發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制，神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后因子的鑒定對(duì)于預(yù)測(cè)患者生存和確定最優(yōu)的治療策略有重要的意義。

miRNAs被預(yù)測(cè)可調(diào)控人基因組中 30%的編碼蛋白的基因，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[8]。miR-132 是高度保守的miRNA，從人類17號(hào)染色體內(nèi)含子上轉(zhuǎn)錄而來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子 cAMP 響應(yīng)原件結(jié)合蛋白[9]。關(guān)于miR-132 調(diào)控及生物學(xué)功能的報(bào)道大部分來(lái)自于神經(jīng)元的研究[10,11]，在炎癥、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生等生理過(guò)程中的功能也有報(bào)道[3]。最近研究表明，miR-132 失調(diào)與非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌的發(fā)生進(jìn)展相關(guān)；miR-132的作用機(jī)理也在各種腫瘤中被廣泛研究。Park 等[12]發(fā)現(xiàn) miR-132 和 miR-212過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞中磷酸化Rb蛋白表達(dá)下調(diào)及轉(zhuǎn)錄因子E2F靶基因表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞增殖增加。Zhang 等[13]發(fā)現(xiàn) miR-132 過(guò)表達(dá)可下調(diào) AKT磷酸化及 Cyclin D1 蛋白表達(dá)，但對(duì) ERK 和 JNK 表達(dá)和磷酸化水平?jīng)]有影響，表明 miR-132 通過(guò)抑制 AKT信號(hào)通路，表現(xiàn)出腫瘤抑制功能。You 等[14]發(fā)現(xiàn) miR-132可通過(guò)靶向ZEB2調(diào)控上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），顯著性抑制肺癌的遷移和浸潤(rùn)。但 miR-132 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床意義還沒有相關(guān)報(bào)道

本研究結(jié)果顯示，miR-132 在膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達(dá)水平呈顯著增高，與 Lages等[15]研究結(jié)果基本一致。提示 miR-132 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮非常重要的作用。本研究將腦損傷或腦出血患者行顱內(nèi)減壓術(shù)時(shí)獲取的組織作為對(duì)照組，而并未對(duì)腦損傷或腦出血對(duì) miR-132 的表達(dá)干擾進(jìn)行排除，這也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，后續(xù)將對(duì) miR-132 在腦損傷或腦出血患者中的表達(dá)和臨床意義進(jìn)行研究。

通過(guò)對(duì) miR-132 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-132 與 KPS 評(píng)分、腫瘤切除程度、WHO 分級(jí)顯著相關(guān)。通過(guò) Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)具有miR-132 高表達(dá)患者的總體生存時(shí)間 OS 及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間 PFS 顯著降低，提示 miR-132 與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后緊密相關(guān)。ROC 曲線分析表明，miR-132 可作為臨床診斷的生物標(biāo)志物，具有一定臨床診斷價(jià)值。

綜上所述，本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn) miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，可能可作為預(yù)測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤預(yù)后和診斷的生物標(biāo)志物。這一發(fā)現(xiàn)具有重要的提示意義，下一步擬進(jìn)行大樣本的研究以進(jìn)一步確認(rèn) miR-132 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的預(yù)后作用。

圖3 miR-132 表達(dá)量與患者總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系

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（本文編輯：唐穎馨）

The Expression and Clinical Significance of miR-132 in Glioma

WU Li-fang,DU Jian-feng.
Department of Neurology,Affiliated Hospital of YanAn University,Shan Xi 716000,China

Objective:To investigate the expression and clinical significance of microRNA(miR-132)in patients with glioma.Methods:One hundred thirty-five cases with glioma(glioma group)and 53 cases of normal brain tissues(control group)were collected.Real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the miR-132 expression in 2 groups.The clinic pathological characteristics of miR-132 expression were further analyzed.A receiver operating characteristic(ROC)curve was constructed to determine the diagnostic value of miR-132.Results:miR-132 expression was significantly up-regulated in the glioma group compared with that in the normal group(P＜0.05).There was significant differences between KPS score,extent of resection and WHO grade in terms of miR-132 expression(P＜0.05).The area under the ROC curve was 0.856 (P＜0.001),the sensitivity was 52.7%,the specificity was 86.6%and the index of Youden was 0.465.The overall survival time and progression free survival in miR-132 high expression and low expression sub-groups were statistically significant(P＜0.01).Conclusion:miR-132 may be involved in carcinogenesis of glioma,which may be a new biomarker for diagnosis and treatment.

miR-132;glioma;ROC curve;clinicopathological;biomarker

R741；R739.41

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.03.011

延安大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科陜西 716000

2016-12 -28

武麗芳wulifang1980125@ 126.com