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        山葡萄花青素超高壓提取工藝優(yōu)化及其組分分析

        2017-06-05 08:56:56杜月嬌文連奎
        食品科學(xué) 2017年10期
        關(guān)鍵詞:效果

        杜月嬌,賀 陽,文連奎

        山葡萄花青素超高壓提取工藝優(yōu)化及其組分分析

        杜月嬌,賀 陽,文連奎*

        (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林 長春 130118)

        以‘雙紅’山葡萄為原料采用超高壓法提取花青素,通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,并應(yīng)用高效液相色譜法分析‘雙紅’山葡萄水解液中花青素的種類及含量。結(jié)果表明:‘雙紅’山葡萄花青素最佳提取工藝參數(shù)為液料比8.5∶1(mL/g)、壓力200 MPa、保壓時間2 min,在此條件下,花青素得率最高為(0.304±0.007) g/100 g,較傳統(tǒng)熱浸提法(0.24±0.005) g/100 g提高了26.7%;‘雙紅’山葡萄花青素主要包括飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素、錦葵素,含量分別為51.03、19.30、13.54、3.00、99.91 mg/100 g。高效液相色譜法分析花青素組分為‘雙紅’山葡萄色素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

        山葡萄;花青素;超高壓提??;組分分析

        山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)為葡萄科葡萄屬植物,原產(chǎn)于中國東北、朝鮮和俄羅斯部分地區(qū)[1],具有種質(zhì)資源豐富[2]、抗寒性強(qiáng)[3-4]、花青素含量高[5]的特點(diǎn),主要品種有‘雙優(yōu)’、‘雙紅’、‘北冰紅’等。

        花青素又稱花色素,屬于生物類黃酮物質(zhì),是一種水溶性色素[6],主要分布于各種綠色植物的花、果實(shí)中[7],具有抗氧化、抗炎、緩解視疲勞等多項(xiàng)生理功能[8-11]。目前,存在于植物中的花青素主要有六大類:天竺葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素、牽牛花色素、芍藥色素和錦葵色素[12]?;ㄇ嗨貍鹘y(tǒng)提取方法主要有浸提法[13-14]、微波-超聲波輔助提取法[15-18]、高壓脈沖電場法[19-20]、超臨界萃取法[21]。近幾年,超高壓法得到廣泛應(yīng)用[22],與其他方法相比,該法具有提取時間短、能耗低、有效成分提取率高的優(yōu)點(diǎn)[23]。

        至今為止,‘雙紅’山葡萄花青素的報道較少,趙權(quán)等[24-25]研究了雙紅果皮和酒中總花色苷、非花色苷酚的種類及含量,王新偉等[26]對雙紅果皮和種子原花青素動態(tài)含量進(jìn)行了測定。本實(shí)驗(yàn)以‘雙紅’山葡萄為原料,采用超高壓法提取‘雙紅’山葡萄花青素,通過響應(yīng)面法確定最佳提取工藝參數(shù),并應(yīng)用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)鑒定‘雙紅’山葡萄水解液中花青素組分,為‘雙紅’山葡萄色素的深度開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        ‘雙紅’山葡萄由吉林省通化市葡萄酒研究所提供,凍果,備用。

        無水乙醇(色譜純) 法國Cleman公司;甲酸、甲醇(均為色譜純) 賽默飛世爾科技有限公司;鹽酸(優(yōu)級純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;飛燕草色素、矮牽牛色素、錦葵色素(純度≥96%)、芍藥素、矢車菊色素(純度≥98%) 美國Chromadex公司;甲酸、甲醇、乙醇、濃鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        HPP600MPa/30L超高壓食品處理裝置 包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司;SPX-250B-D振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Ultimate 3000 HPLC儀 賽默飛世爾科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 ‘雙紅’山葡萄花青素超高壓提取

        室溫條件下,取‘雙紅’山葡萄,解凍、打漿,精確稱取一定量‘雙紅’山葡萄漿,將其與提取劑(65%乙醇-1%鹽酸溶液)混勻裝入真空包裝袋,封口,放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取,經(jīng)快速升壓及瞬時降壓,樣品溫度(20±1)℃無明顯變化,提取后,用提取劑定容至相同體積,離心,取其上清液測吸光度。

        1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計

        1.3.2.1 液料比對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        固定提取壓力200 MPa,保壓時間3 min,液料比設(shè)計為5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1(mL/g),以花青素提取液吸光度為評價指標(biāo),研究液料比對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響。

        1.3.2.2 壓力對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        固定液料比9∶1(mL/g),保壓時間3 min,壓力設(shè)計為100、150、200、250、300 MPa,以花青素提取液吸光度為評價指標(biāo),研究壓力對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響。

        1.3.2.3 保壓時間對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        固定液料比9∶1(mL/g),壓力200 MPa,保壓時間分別為1、2、3、4、5 min,以花青素提取液吸光度為評價指標(biāo),研究保壓時間對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響。

        1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定液料比、壓力、保壓時間的取值范圍,進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計,因素水平見表1。以‘雙紅’山葡萄花青素提取液吸光度為響應(yīng)值,利用Design-Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出超高壓法提取‘雙紅’山葡萄花青素的最佳工藝條件。

        表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design for response surface analysis

        1.3.4 ‘雙紅’山葡萄花青素?zé)峤?/p>

        采用最佳提取條件,精確稱取一定量的‘雙紅’山葡萄漿液,加入一定量的65%乙醇-1%鹽酸溶液,在55 ℃條件下,以100 r/min振蕩提取30 min,用提 取 劑定容至相同體積后離心,取上清液測其吸光度。

        1.3.5 花青素含量的測定

        參照國食健字G20130303中直接分光光度法測定花青素含量,并稍作修改,精確稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,用0.1%鹽酸-80%乙醇(15∶85,V/V)混合液溶解并定容至5 mL,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定該標(biāo)準(zhǔn)溶液于535 nm波長處測定吸光度A標(biāo)。按下式計算花青素得率:

        式中:X為‘雙紅’山葡萄花青素得率/(g/100 g);A樣為樣品溶液吸光度;V樣為樣品溶液總體積/mL;C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/(mg/mL);A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度;M樣為樣品質(zhì)量/mg。

        1.3.6 HPLC法分析‘雙紅’山葡萄花青素組成成分1.3.6.1 花色苷水解

        參照NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定》中的HPLC法,取響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件下提取的花青素液,加入濃鹽酸,在90 ℃條件下水浴1 h,取出冷卻后,用提取液定容至25 mL,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。

        1.3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

        分別精確稱取花青素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg,溶解于1 mL溶劑(1%鹽酸-甲醇溶液)中,配制成1 mg/mL的母液,取適量花青素標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行混合,再用1%鹽酸-甲醇溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.6.3 色譜條件

        色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為2%甲酸-水(V/V)溶液;流動相B為甲醇;采用UV-VIS紫外檢測器檢測,檢測波長530 nm;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量20 μL,梯度洗脫見表2。

        表 2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 液料比對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        圖 1 液料比對花青素提取效果的影響Fig. 1 Effects of liquid to solid ratio on the yield of anthocyanins

        由圖1可知,當(dāng)液料比在5∶1~9∶1(mL/g)范圍內(nèi),提取液吸光度隨液料比的增加逐漸升高,液料比在9∶1 (mL/g)時,提取效果最佳,在9∶1~13∶1(mL/g)范圍內(nèi),吸光度小幅度下降后維持穩(wěn)定??紤]到提高液料比不但會增加不必要的溶劑成本,還會給后續(xù)濃縮提純帶來不便,因此,選擇液料比為7∶1、9∶1、11∶1(mL/g)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

        2.1.2 壓力對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        圖 2 壓力對花青素提取效果的影響Fig. 2 Effect of pressure on the yield of anthocyanins

        由圖2可知,壓力在100~200 MPa范圍內(nèi),提取液吸光度隨壓力的增加而增加,當(dāng)壓力升至200 MPa時,吸光度達(dá)到最大,壓力再升高,吸光度并沒有顯著變化,原因可能是壓力增加,使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓增大,促進(jìn)有效成分溶出,當(dāng)壓力增加至200 MPa時,有效成分已充分溶出并在溶劑內(nèi)達(dá)到飽和狀態(tài),此后再增大壓力,提取液吸光度不會有顯著變化[27],因此,選擇壓力為150、200、250 MPa進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

        2.1.3 保壓時間對‘雙紅’山葡萄花青素提取效果的影響

        圖 3 保壓時間對花青素提取效果的影響Fig. 3 Effect of pressure-holding time on the yield of anthocyanins

        由圖3可知,保壓時間在1~3 min范圍內(nèi),提取液吸光度隨時間延長而增加,3 min時,提取液吸光度達(dá)到最大,當(dāng)保壓時間在3~5 min 范圍內(nèi),吸光度基本不變,說明此時系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài),延長保壓時間,有效成分不會向周圍擴(kuò)散,體現(xiàn)在提取液吸光度再無明顯升高,因此,保壓時間選擇1、2、3 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

        2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

        2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

        結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取對花青素提取液吸光度影響顯著的3個因素液料比(A)、壓力(B)和保壓時間(C),采用三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及分析方法進(jìn)行提取條件的優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果見表3。

        表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

        利用Design-Expert 7.0.0軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,獲得花青素提取液吸光度(Y)對液料比(A)、壓力(B)、保壓時間(C)的二次回歸模型方程為:Y0.84-0.018A+0.086B+2.875×10-3C+7.000×10-3AB+ 2.750×10-3AC+0.034BC-0.041A2-0.13B2-0.023C2

        表 4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

        如表4所示,回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P0.132 4>0.05),表明回歸方程擬合程度良好,未知因素對試驗(yàn)?zāi)P陀绊戄^??;決定系數(shù)R2為0.993 8,調(diào)整決定系數(shù)0.985 8均說明該模型可信度較高;為0.925 9,說明該模型預(yù)測性良好。由表4可知,一次項(xiàng)A對提取效果影響極顯著(P<0.01),B對提取效果影響極顯著(P<0.01),而C對提取效果影響不顯著(P>0.05)。從F值可知,以上三因素對花青素提取效果影響的順序?yàn)椋築壓力>A液料比>C保壓時間。

        兩因素交互作用中,BC對提取效果影響極顯著(P<0.01),AB、AC對提取效果的影響不顯著(P>0.05)。二次項(xiàng)A2、B2、C2對提取效果均有極顯著影響(P<0.01),進(jìn)一步說明各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

        2.2.2 響應(yīng)面分析

        圖 4 各交互因素對花青素提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 4 Response surface plots showing the effects of interaction between various factors on the yield of anthocyanins

        如圖4所示,在壓力、液料比方向的坡面較陡,表明壓力、液料比對花青素提取效果影響較為顯著,隨著壓力和液料比的增加,提取液吸光度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,并在200 MPa、9∶1(mL/g)附近,提取液吸光度最高。隨著保壓時間的延長,提取液吸光度也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,但吸光度升高的趨勢不明顯,表現(xiàn)為保壓時間方向的坡面較平滑,說明保壓時間對花青素提取效果影響不顯著。壓力和保壓時間等高線圖呈橢圓形,說明兩者交互作用明顯,而液料比和保壓時間的等高線圖接近圓形,說明兩者交互作用不明顯。

        2.2.3 最佳工藝條件及驗(yàn)證

        經(jīng)Design-Expert 7.1.3分析得到的預(yù)測工藝條件為液料比8.65∶1(mL/g)、保壓時間2.32 min、壓力217.82 MPa,預(yù)測吸光度為0.857,得率為0.294 g/100 g。根據(jù)實(shí)際操作,對工藝條件進(jìn)行規(guī)范化處理,在溫度為室溫,液料比8.5∶1(mL/g)、保壓時間2 min、壓力200 MPa條件下花青素提取液吸光度為0.886±0.021,實(shí)際得率為(0.304±0.007) g/100 g,與預(yù)測理論值接近,說明此模型有效且優(yōu)化結(jié)果可靠。

        2.3 超高壓法與熱浸提法提取‘雙紅’山葡萄花青素的比較

        按照1.3.4節(jié)方法提取‘雙紅’山葡萄花青素提取時間為30 min,得率為(0.240±0.005) g/100 g,而超高壓法提取花青素提取時間僅為2 min,得率為(0.304± 0.007) g/100 g,較熱浸提法提高了26.7%,可見,超高壓法不僅縮短了提取時間,還提高了花青素得率。

        2.4 HPLC分析結(jié)果

        表 5 花青素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 5 Standard curves, correlation coefficients and linear ranges for five anthocyanin standards

        分別將5 個花青素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度X(μg/mL)與峰面積Y進(jìn)行線性回歸分析,如表5所示,相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999,說明花青素的質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

        圖 5 5 種花青素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和‘雙紅’山葡萄花青素(B)的HPLC圖譜Fig. 5 HPLC chromatograms of mixture of five anthocyanin standards and anthocyanins in ‘Shuanghong’ Amur grapes

        表 6 ‘雙紅’山葡萄花青素出峰時間、質(zhì)量濃度、含量及比例Table 6 Peak time, mass concentration, and total and individual contents of anthocyanins in ‘Shuanghong’ Amur grapes

        由圖5及表5、6的出峰時間可判斷,圖5B中出現(xiàn)的5 個峰依次是飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、芍藥素、錦葵素,對應(yīng)含量分別為51.03、19.30、13.54、3.00、99.91 mg/100 g,總計186.78 mg/100 g。由此可知,‘雙紅’山葡萄所含5 種花青素,錦葵素含量最高,占53.49%,其次為飛燕草素,占27.32%,矢車菊素占10.33%,矮牽牛素占7.25%,含量最少為芍藥素,僅占1.61%。

        3 討論與結(jié)論

        花青素基本結(jié)構(gòu)單元為α-苯基苯并吡喃型陽離子,由于B環(huán)各碳位的取代基不同(羥基或甲氧基),形成不同種類的花青素[28],花青素上的羥基被糖基取代,形成各種各樣的花色苷[29]。歐亞種葡萄中的花色苷主要由5 種花青素單體組成,分別為花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素[30],因此,本實(shí)驗(yàn)選擇以上5 種標(biāo)準(zhǔn)品鑒定‘雙紅’山葡萄花青素,經(jīng)HPLC分析共出現(xiàn)5 個特征峰,峰形良好,并無雜峰,與上述結(jié)果一致。但趙權(quán)等[24]研究指出‘雙紅’山葡萄果皮中檢測出13 種花色苷,其中花青素類2 種,花翠素類2 種,甲基花青素類3 種,甲基花翠素類3 種,二甲花翠素類2 種,還檢測到1 種花葵素類花色苷,表明‘雙紅’山葡萄中含有花葵素,產(chǎn)生這種差異的原因可能是原料來源不同、果實(shí)采摘時期不同,導(dǎo)致‘雙紅’山葡萄花青素種類存在差異,也可能是由于花青素不穩(wěn)定[31],在提取過程中,某類花青素B環(huán)上的取代基發(fā)生改變,產(chǎn)生花葵素類花色苷。

        本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化,確定各因素對花青素提取效果影響的主次順序?yàn)閴毫Γ疽毫媳龋颈簳r間;超高壓法提取花青素的最佳工藝條件為液料比8.5∶1(mL/g)、壓力200 MPa、保壓時間2 min,該條件下花青素得率為(0.304±0.007) g/100 g,較傳統(tǒng)熱浸提法得率提高26.7%;應(yīng)用HPLC鑒定‘雙紅’山葡萄花青素主要包括五類,含量由高至低依次為錦葵素99.91 mg/100 g、飛燕草素51.03 mg/100 g、矢車菊素19.30 mg/100 g、矮牽牛素13.54 mg/100 g、芍藥素3.00 mg/100 g。

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        Optimization of Ultra-High Pressure Extraction of Anthocyanins from Vitis amurensis Rupr. and Analysis of Its Anthocyanin Composition

        DU Yuejiao, HE Yang, WEN Liankui*
        (College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

        The fruits of Vitis amurensis cv. ‘Shuanghong’ were extracted using ultra-high pressure technique to obtain anthocyanins. The extraction process was optimized by response surface methodology. High performance liquid chromatography (HPLC) was applied to analyze the types and contents of anthocyanidins. The optimal extraction parameters that provided maximum yield of anthocyanins of (0.304±0.007) g/100 g were determined as follows: liquid/material ratio of 8.5:1 (mL/g), extraction pressure of 200 MPa and pressure-holding time of 2 min, which was 26.7% higher than that ((0.24±0.005) g/100 g) obtained with the traditional heat extraction method. The anthocyanins in Amur grapes mainly included delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin and malvidin. Their contents were 51.03, 19.30, 13.54, 3.00, and 99.91 mg/100 g, respectively. The HPLC analysis of anthocyanins components provided a theoretical basis for further development and utilization of pigment from Vitis amurensis.

        Vitis amurensis; anthocyanins; ultra-high pressure extraction; component analysis

        10.7506/spkx1002-6630-201710042

        TS255.1

        A

        1002-6630(2017)10-0258-06

        杜月嬌, 賀陽, 文連奎. 山葡萄花青素超高壓提取工藝優(yōu)化及其組分分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 258-263.

        DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710042. http://www.spkx.net.cn

        DU Yuejiao, HE Yang, WEN Liankui. Optimization of ultra-high pressure extraction of anthocyanins from Vitis amurensis Rupr. and analysis of its anthocyanin composition[J]. Food Science, 2017, 38(10): 258-263. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201710042.http://www.spkx.net.cn

        2016-10-27

        杜月嬌(1991—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)工程與功能性食品。E-mail:923809229@qq.com

        *通信作者:文連奎(1962—),男,教授,博士,研究方向?yàn)殚L白山野生資源開發(fā)。E-mail:wenliankui@163.com

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