胡藝偉，加亞玲，張光先，張鳳秀,*

乙烯對α-淀粉酶活力、動力學和微環(huán)境的影響

胡藝偉1，加亞玲1，張光先2,*，張鳳秀1,*

（1.西南大學化學化工學院，生物有機與藥物化學研究所，重慶 400715；2.西南大學紡織服裝學院，重慶 400715）

用乙烯利釋放出乙烯，研究其對α-淀粉酶活力、動力學及微環(huán)境的影響。結(jié)果表明：與對照組比較，低濃度乙烯提高α-淀粉酶活力，而高濃度乙烯抑制α-淀粉酶活力；乙烯對α-淀粉酶的最適pH值（pH 6.0）幾乎沒有影響，但對其最適溫度改變，向高溫方向偏移5 ℃。用高濃度和低濃度的乙烯處理α-淀粉酶，探討乙烯對α-淀粉酶的反應機理，其水解動力學符合一級動力學方程（Michaelis-Menten），其對應的雙倒數(shù)曲線（Lineweaver-Burk）擬合度較好。紫外、熒光光譜分析表明：隨著乙烯濃度增加，α-淀粉酶紫外吸光度和熒光發(fā)射強度明顯增強。與對照組相比，紫外吸收光譜在波長229 nm紅移1 nm。α-淀粉酶溶液的黏度隨著乙烯濃度的增加而下降，導致酶的微環(huán)境改變。目前，乙烯利已廣泛應用于各種蔬菜、水果，本研究對乙烯的食品安全有非常重要的意義。

乙烯；影響；α-淀粉酶；活力；微環(huán)境；動力學

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）全稱為1,4-α-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶[1]，廣泛存在于植物、動物和微生物中[2]，如發(fā)芽的水稻、大麥和小麥等[3]。在人和動物的唾液、胰腺中α-淀粉酶含量非常高。α-淀粉酶能切開淀粉分子內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，生成糊精和還原糖[4]。目前，工業(yè)生產(chǎn)上用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶[5]，它廣泛被應用于紡織工業(yè)、制藥工業(yè)和食品工業(yè)，如食品加工、釀造、發(fā)酵工業(yè)等[6-7]。已有較多研究報道酶活性受到多種因素的影響，如pH值、溫度、金屬離子、溶劑、二氧化碳、甲醇、硫化氫等[8-12]。

乙烯利作為催熟劑被廣泛用于噴水果和蔬菜中，它所釋放的乙烯對作物催熟。在日本和中國，乙烯利對玉米最大殘留量被設(shè)定為0.5 mg/kg；在英格蘭和歐洲聯(lián)盟為0.05 mg/kg[13]。然而，中國在1～180 d的存儲中，乙烯殘留量在新鮮和干玉米中分別為0.43～0.657 mg/kg和0.657～0.609 mg/kg，這超出了乙烯利殘留量的最大限度[14]。此外，多余的乙烯利將破壞環(huán)境（土壤、水和空氣）和傷害非目標生物（植物和動物原料）[15]，例如急性毒性、慢性中毒和突變等[16]。

乙烯是最簡單的烯烴，也是一種植物激素[17]。在植物的生長和發(fā)育中起著非常重要的作用，如種子萌發(fā)、葉子衰老與脫落、木材形成、應對環(huán)境壓力[18-20]等。目前，較多文獻報道乙烯在植物體內(nèi)合成并影響植物的生理和生化反應[21]，這些研究表明乙烯參與植物一系列的生理生化反應，如通過乙烯受體途徑調(diào)節(jié)植物的基因表達[22]，這是乙烯和乙烯受體的結(jié)合產(chǎn)生乙烯受體反應從而提高或抑制植物體內(nèi)各種酶的活力[23]。因此，乙烯在植物體內(nèi)的生理生化調(diào)控機理已清晰，但對人體和動物體內(nèi)各種酶的活力是否有影響還不清楚?；谶^量乙烯利在水果、蔬菜甚至作物的廣泛使用，過量乙烯利釋放出的乙烯對動物和人類是否存在食品安全隱患的研究報道極少。筆者已報道乙烯對體外脂肪酶的水解活力的影響和機理[24]，但乙烯對體外其他酶活力的影響目前還鮮有相關(guān)報道。因此，本實驗以廣泛存在的米曲霉α-淀粉酶為例，進一步研究乙烯對體外α-淀粉酶活力、動力學和微環(huán)境的影響，以期得到更多的實驗證據(jù)。這對乙烯的食品安全有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶（來自于米曲霉，粉末，活力≥150 000 U/g）美國Sigma-Aldrich公司；乙烯利水劑（純度40%） 四川省精細化工研究設(shè)計院；可溶性淀粉（來自于土豆，分析純，相對分子質(zhì)量342.294 8）、碘化鉀（純度≥98.5%）、碘（純度≥99.8%） 成都市科龍化工試劑廠；檸檬酸（純度≥99.5%）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，純度≥99.0%） 重慶東方試劑廠；鹽酸（純度36%～38%，1.18 g/mL） 重慶川東化工有限公司化學試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810-PC紫外分光光度計 北京浦西通用儀器有限公司；F-4600-FL熒光分光光度計 日本日立公司；烏氏黏度計 北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司；6890氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙烯的制備和濃度的計算

稱取5.0 g氫氧化鈉轉(zhuǎn)入盛有5 mL蒸餾水的250 mL三頸燒瓶中。加入10 mL的乙烯利于恒壓滴液漏斗中，以30 drop/min的速率滴加到三頸燒瓶中。用排水吸氣法收集乙烯，在－20 ℃條件下冷凍干燥[23]。

精確移取5 mL蒸餾水到盛有2 mL磷酸緩沖溶液（pH 6.0）的60 mL玻璃瓶中，用橡膠塞密封。用常量或微量注射器注入適當體積的乙烯，恒溫水浴振蕩加熱一定時間以達氣-液平衡，冷卻至室溫。用氣相色譜測定乙烯濃度。色譜條件：氫離子火焰檢測器，cyclodex-β毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為N2（純度99.999%），進樣口溫度150 ℃，柱溫10～80 ℃，檢測器溫度200 ℃。擬合乙烯體積計算公式（1）如下：

y=25.865x+3.457 （1）

式中：x為注射乙烯的體積/mL；y為溶液中乙烯濃度/（μmol/L）。

1.3.2 α-淀粉酶活力計算

按照文獻[6,25]方法測定α-淀粉酶活力。量取5 mL一定濃度的可溶性淀粉溶液和2 mL一定pH值磷酸鹽緩沖溶液到60 mL的帶橡膠塞玻璃瓶中，混合均勻。在恒溫水浴鍋中加熱5 min后，精確移取0.5 mL的一定質(zhì)量濃度的α-淀粉酶，用橡膠塞密封。然后將適當濃度的乙烯氣體注入到玻璃瓶中，對照組不加乙烯，搖勻后放入恒溫水浴鍋中反應5 min。反應結(jié)束后，移取1 mL混合溶液于盛有5 mL 88 mg/L的碘和0.5 mL 0.1 g/L的稀鹽酸溶液的試管中終止酶反應，搖勻。立即在660 nm波長處測定該溶液的吸光度，實驗重復3 次。酶活力定義：α-淀粉酶1 min水解1 mg淀粉的量為1 U。α-淀粉酶活力按公式（2）計算：

式中：M0為初始的淀粉質(zhì)量/mg；M1為殘留淀粉質(zhì)量/mg；M2為酶質(zhì)量/g；t為反應時間/min。

1.3.3 α-淀粉酶溶液的黏度、紫外和熒光光譜測定

精確移取10 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL、pH 6.0的α-淀粉酶溶液，放入60 mL帶橡膠塞的玻璃中。然后加入不同濃度的乙烯，用橡膠塞塞住。對照組不加乙烯。用手不停地搖動，讓乙烯充分溶解到α-淀粉酶溶液中。在40 ℃恒溫水浴中加熱30 min，冷卻到室溫（24 ℃）以達到氣-液平衡。在24 ℃測定其紫外、熒光光譜和黏度，在190～400 nm的波長范圍內(nèi)測定紫外光譜。熒光光譜在激發(fā)波長279 nm和發(fā)射波長270～400 nm條件下測定，激發(fā)和發(fā)射寬度為5 nm。實驗均重復3 次。

以去離子水作為對照，用烏氏黏度計來測量黏度。α-淀粉酶黏度的計算如公式（3）所示[26]：

式中：t1和t2分別為對照組和乙烯處理組液體流經(jīng)時間/s；η為去離子水在24 ℃條件下的黏度系數(shù)，0.914 2 mPa·s；ρ1為去離子水的密度/（g/cm3）；ρ2為酶溶液的密度/（g/cm3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯濃度對α-淀粉酶活力的影響

在磷酸緩沖溶液pH 6.0、淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和55 ℃條件下，實驗組加入不同體積乙烯，對照組不加乙烯。測定不同濃度乙烯對α-淀粉酶催化水解活力的影響，結(jié)果見圖1。

圖 1 乙烯濃度對α-淀粉酶活力的影響Fig. 1 Effects of different ethylene concentrations on α-amylase activity

由圖1可見，與對照組相比，乙烯濃度在6.04～29.32 μmol/L的范圍內(nèi)，α-淀粉酶活力隨乙烯濃度的增加而增加，然后隨著乙烯濃度的增加而降低。當乙烯濃度為29.32 μmol/L，α-淀粉酶活力達到最大值，該結(jié)果與乙烯在植物體中的生理效應一致[13]，即較低乙烯濃度促進α-淀粉酶活力，而較高濃度抑制α-淀粉酶活力。這可能是在反應條件下，酶分子熱運動導致其構(gòu)象發(fā)生漲落[27]，結(jié)構(gòu)簡單的疏水乙烯小分子容易滲入疏水性的α-淀粉酶內(nèi)部，直接影響α-淀粉酶分子的微觀結(jié)構(gòu)，因而調(diào)控α-淀粉酶活力。

2.2 不同反應時間的α-淀粉酶活力

在淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL、pH 6.0和55 ℃條件下，探討反應時間對乙烯濃度為29.32 μmol/L的實驗組和未加乙烯對照組的α-淀粉酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，實驗組與對照組α-淀粉酶活力均隨著反應時間的升高而下降，并在反應時間超過25 min以后逐漸達到平衡。但對于同一反應時間，實驗組的α-淀粉酶活力比對照組高。結(jié)果表明，乙烯提高了α-淀粉酶活力?？赡艿脑蚴?，乙烯溶解到反應溶液中，改變了酶的微環(huán)境，進一步改變了酶的空間構(gòu)象[24,27]。

胰島素瘤:是發(fā)生在胰腺的最常見的功能性腫瘤,因胰島β細胞瘤或β細胞增生造成胰島素分泌過多,引起低血糖癥,常有典型的Whipple三聯(lián)征表現(xiàn),即低血糖癥狀、昏迷及精神神經(jīng)癥狀。和甲狀旁腺腺瘤一樣,一經(jīng)確診,需手術(shù)治療。

圖 2 乙烯對不同反應時間α-淀粉酶活力的影響Fig. 2 Effects of ethylene on α-amylase reaction rate

2.3 乙烯對α-淀粉酶最適pH值的影響

在不同pH值的磷酸緩沖液中，實驗組加入乙烯濃度為29.32 μmol/L，對照組不加乙烯。在淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和55 ℃恒溫水浴中條件下，測定不同pH值條件下α-淀粉酶催化水解淀粉的活力，結(jié)果見圖3。

圖 3 乙烯對α-淀粉酶最適pH值的影響Fig. 3 Effects of ethylene on optimum pH for α-amylase

如圖3所示，實驗組和對照組在pH 3～9的范圍內(nèi)，α-淀粉酶活力的變化呈“鐘形”，且最適pH值均為6。但對于對照組，當pH值小于4或大于7，則α-淀粉酶活力改變更為明顯。對于實驗組，在pH 3～6范圍內(nèi)α-淀粉酶活力逐漸增加，而在pH 7～9范圍內(nèi)其活性逐漸降低。在同一pH值條件下，實驗組的活性總是高于對照組，尤其是在pH 3，實驗組α-淀粉酶活力比對照組提高了約5 倍。在pH 3～7范圍內(nèi)實驗組均保持了較高的活性，這表明乙烯沒有改變酶的最佳pH值，意味著乙烯沒有影響α-淀粉酶的二級或三級結(jié)構(gòu)，而是使酶的四級結(jié)構(gòu)有一定程度的變化。在乙烯作用下α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性增加，且保留或增加了α-淀粉酶的反應活性位點[27]。

2.4 乙烯對α-淀粉酶最適溫度的影響

在磷酸緩沖液pH 6.0、淀粉濃度58.429 mmol/L、α-淀粉酶質(zhì)量濃度0.2 mg/mL和不同溫度條件下，實驗組加入濃度為29.32 μmol/L乙烯，對照組無乙烯，酶催化活力隨溫度變化的影響規(guī)律見圖4。

圖 4 乙烯對α-淀粉酶最適溫度的影響Fig. 4 Effects of ethylene on optimum temperature for α-amylase

如圖4所示，在相同溫度條件下實驗組的α-淀粉酶活力比對照組高。在25～40 ℃，實驗組和對照組α-淀粉酶活力隨溫度的升高而逐漸增加。當實驗組和對照組的最適溫度分別為60 ℃和55 ℃時，α-淀粉酶活力最高。與對照組相比，實驗組最適溫度向高溫方向偏移了5 ℃。其可能原因是乙烯溶解在酶溶液中明顯改變了酶溶液的黏度和α-淀粉酶大分子的構(gòu)象。隨著溫度繼續(xù)升高，兩組的α-淀粉酶活力都降低，但是實驗組下降幅度比對照組慢。這一結(jié)果進一步證實乙烯有助于增強α-淀粉酶大分子的熱穩(wěn)定性，使其在高溫條件下有較好的活性。

2.5 乙烯對α-淀粉酶催化可溶性淀粉溶液水解動力學的影響

圖 5 反應速率與底物濃度的Miehaelis-Menten曲線（A）及Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線（B）Fig. 5 Michaelis-Menten curves reaction velocity against substrate concentration (A) and Lineweaver-Burk double-reciprocal curves (B)

表 1 米氏方程和動力學參數(shù)Table 1 Michaelis-Menten equations and kinetics parameters

從表1可看出，與對照組相比，用乙烯濃度為2 9.32 μmol/L處理的實驗組vmax和Km值均大于比對照組，并且也高于262.11 μmol/L乙烯濃度處理的實驗組，但262.11 μmol/L乙烯濃度處理的vmax和Km值低于對照組，這說明高濃度的乙烯對α-淀粉酶活力有抑制作用，低濃度的乙烯對酶活力有促進作用，所有的R2值擬合很好，分別為0.999 6、0.999 8和0.999 4。此外，在底物濃度和反應速率的對應雙倒數(shù)曲線，如圖5B所示。其擬合方程如下：

從圖5B和擬合方程（4）、（6）可以看出，對照組和262.11 μmol/L乙烯處理的實驗組Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線的斜率相近，但它們的截距不同，因此262.11 μmol/L乙烯處理的實驗組酶反應機理屬于反競爭性抑制[28]。而方程（4）和（5）中，對照組和乙烯濃度為29.32 μmol/L的實驗組Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線的斜率和截距均相差較大，因此乙烯濃度為29.32 μmol/L處理的酶反應機理屬于簡單的線性非競爭性抑制[28]。表1中Km值等于反應初速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，即酶活性部位數(shù)的一半為底物占據(jù)時所需的底物濃度[27]。表1的Km數(shù)據(jù)表明：低濃度乙烯處理的實驗組酶的活性位點數(shù)比對照組多；而高濃度乙烯處理的實驗組活性位點數(shù)低于對照組。這表明低濃度的乙烯分子被吸附到酶大分子的表面和疏水內(nèi)部，使酶分子的柔性增加，導致活性位點數(shù)大于對照，因此有激活作用。而高濃度的乙烯分子占據(jù)了較多的酶活性位點，導致較大程度的破壞了酶原有的構(gòu)象，因此起抑制作用[27-28]。這兩種不同的水解動力學機制表明乙烯在反應體系中可能有兩種途徑如圖6所示。一種途徑是乙烯先與α-淀粉酶結(jié)合形成反應性中間體，然后該中間體與底物結(jié)合發(fā)生水解反應。另一種途徑是，α-淀粉酶和底物的結(jié)合形成一種中間體，乙烯再與這種中間體結(jié)合成復合中間體水解淀粉。在水解反應中這兩個途徑可能同時存在[27]。

圖 6 乙烯酶催化反應機理Fig. 6 Reaction mechanism of α-amylase hydrolysis in the presence of ethylene

2.6 乙烯對α-淀粉酶黏度的影響

為了證實乙烯對α-淀粉酶微環(huán)境的影響，在24 ℃（室溫）測定不同乙烯濃度條件下的α-淀粉酶溶液黏度，結(jié)果如圖7所示。

圖 7 不同濃度乙烯對α-淀粉酶溶液黏度的影響Fig. 7 Effects of ethylene concentration on viscosity of α-amylase solution

由圖7可見，經(jīng)乙烯處理后的α-淀粉酶溶液的黏度低于對照組，并且隨著乙烯的濃度的增加而降低，然后逐漸達到一個平衡。這個結(jié)果表明，乙烯濃度對α-淀粉酶的微環(huán)境有顯著影響，可能是由于乙烯部分地溶解在酶溶液中，提高了α-淀粉酶微環(huán)境的疏水性和酶溶液的流動性，從而導致α-淀粉酶分子的伸展性和柔韌性增加[27]。

2.7 乙烯對α-淀粉酶溶液紫外吸收光譜的影響

在α-淀粉酶質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、24 ℃和磷酸緩沖溶液pH 6.0條件下，不同濃度乙烯對紫外線吸收的影響結(jié)果如圖8所示。

從圖8可知，實驗組的峰強度隨著乙烯濃度的增加而增加，并且高于對照組。對照組和實驗組均在約229 nm和276 nm波長處有兩個明顯的吸收峰。但對照組和實驗組強的吸收峰分別出現(xiàn)在229 nm和230 nm，實驗組吸收波長紅移了1 nm，這可能是CO肽鍵的n→P3電子躍遷所致。此外，在276 nm波長處出現(xiàn)了弱吸收峰，這主要歸功于α-淀粉酶中的色氨酸和酪氨酸芳環(huán)雜原子的n→P3電子躍遷[29]?？赡茉蚴且蚁┰黾恿嗣溉芤旱氖杷裕功?淀粉酶內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸基團被暴露在酶分子表面上。

圖 8 乙烯對α-淀粉酶溶液紫外光譜的影響Fig. 8 Effects of ethylene concentration on the UV absorption spectrum of α-amylase

2.8 乙烯對α-淀粉酶溶液熒光光譜的影響

圖 9 乙烯對α-淀粉酶溶液熒光光譜的影響Fig. 9 Effect of ethylene concentrations on the fluorescence spectrum of α-amylase solution

如圖9所示，在283 nm和342 nm波長處α-淀粉酶溶液的峰強度隨著乙烯濃度的增加而增加，且均高于對照組。在342 nm波長處強發(fā)射峰是色氨酸殘基引發(fā)所致[30]。這表明乙烯改變了酶的微環(huán)境，使α-淀粉酶的構(gòu)象從緊湊狀態(tài)向松弛狀態(tài)改變，導致α-淀粉酶分子內(nèi)的芳香族氨基酸殘基很容易暴露到的表面上，增加了酶分子的柔韌性，從而增強了其熒光強度。

3 結(jié) 論

乙烯可以直接在體外影響α-淀粉酶活力，低濃度乙烯提高α-淀粉酶催化活力，高濃度乙烯降低α-淀粉酶催化活力。當乙烯濃度為29.32 μmol/L時，α-淀粉酶活力達到最大值。相比對照組，乙烯對α-淀粉酶的最適pH值（pH 6.0）無影響，而α-淀粉酶的最適溫度上升5℃。隨著α-淀粉酶質(zhì)量濃度的增加，反應速率增加；且實驗組的反應速率比對照組快。有、無乙烯存在條件下，α-淀粉酶水解動力學均符合一級米氏動力學方程；并且其雙倒數(shù)曲線很好擬合。29.32 μmol/L乙烯處理的實驗組酶反應機理屬于簡單的線性非競爭性抑制，262.11 μmol/L乙烯處理的實驗組酶反應機理屬于反競爭性抑制。加入乙烯后，α-淀粉酶溶液的黏度明顯下降，α-淀粉酶溶液的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜增強，表明α-淀粉酶的微環(huán)境和構(gòu)象受到乙烯的直接影響。

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Effect of Ethylene on the Activity, Kinetics and Microenvironment of α-Amylase in Vitro

HU Yiwei1, JIA Yaling1, ZHANG Guangxian2,*, ZHANG Fengxiu1,*
(1. Institute ofBioorganic and Medicinal Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. College of Textiles and Garments, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The effects of ethylene on α-a mylase activity, kinetics and micr oenvironment were investigated. Compared with the controlgroup, α-amylase activity was enhanced by ethylene at low concentration but inhibited at high concentration. However, ethylene hardly affected the optimum pH (6.0) for α-amylase, whereas it resulted in an increase in the optimum temperature by 5 ℃. The hydrolysis kinetics of α-amylase in the presence of low and high concentrations of ethylene followed a first-order kinetic equation (Michaelis-Menten), and the Lineweaver-Burk double-reciprocal curves were well fitted. The mechanism of action of ethylene in this respect was investigated. The ultraviolet (UV) absorption and fluorescence emission intensity of α-amylase were obviously enhanced with increasing ethylene concentration, and the absorption peak of α-amylase at 229 nm showed a red shift by 1 nm. After ethylene was added, the viscos ity of α-amylase solution declined obviously compared with the control group, leading to a change in the microenvironment of α-amylase. This research is of great significance for supporting the safe application of ethylene in fruits and vegetables.

ethylene; effect; α-amylase; activity; microenvironment; kinetics

楊娟. 胰α-淀粉酶的部分性質(zhì)研究[D]. 成都: 四川大學, 2007.

10.7666/d.y1212651.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024

Q5-33

A

1002-6630（2017）10-0143-06

胡藝偉, 加亞玲, 張光先, 等. 乙烯對α-淀粉酶活力、動力學和微環(huán)境的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 143-148.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024. http://www.spkx.net.cn

HU Yiwei, JIA Yaling, ZHANG Guangxian, et al. Effect of ethylene on the activity, kinetics and microenvironment of α-amylase in vitro[J]. Food Science, 2017, 38(10): 143-148. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710024. http://www.spkx.net.cn

2016-05-27

胡藝偉（1988—），女，碩士研究生，研究方向為生物有機化學。E-mail：805756023@qq.com

*通信作者：張光先（1965—），男，教授，博士，研究方向為應用化學。E-mail：zgxzfx@swu.com.cn

張鳳秀（1965—），女，副教授，博士，研究方向為生物有機催化。E-mail：zhangfx656472@sina.com.cn