何鵬暉，錢 楊，王 猛，楊建濤，趙婷婷，蔣云露，車振明，饒 瑜,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620020；3.四川省食品藥品檢 驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097）

腐敗發(fā)酵蔬菜中產(chǎn)膜醭細(xì)菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性分析

何鵬暉1，錢 楊1，王 猛2，楊建濤1，趙婷婷1，蔣云露3，車振明1，饒 瑜1,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620020；3.四川省食品藥品檢 驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610097）

以發(fā)酵蔬菜為研究對(duì)象，分離和鑒定其中形成腐敗膜醭的主要微生物，并分析其生長(zhǎng)特性。利用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭中的微生物，挑取50 株單克隆回接到發(fā)酵鹽鹵胰蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將能夠在培養(yǎng)液表面顯著形成膜醭的菌株進(jìn)行16S rDNA或18S rDNA分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明這6 株菌均為細(xì)菌，分別為枯草芽孢桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、科氏葡萄球菌科氏亞種、普羅威登斯菌、克雷伯氏桿菌屬和陰溝腸桿菌。利用5 種發(fā)酵蔬菜模擬培養(yǎng)基培養(yǎng)上述6 株細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)不同菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭情況不同?？莶菅挎邨U菌和科氏葡萄球菌科氏亞 種除了能形成膜醭外，還能引起培養(yǎng)基pH值升高，并對(duì)氮源需求不高?？死撞蠗U菌屬和普羅威登斯菌僅在發(fā)酵鹽鹵胰蛋白胨培養(yǎng)基和發(fā)酵蔬菜汁胰蛋白胨培養(yǎng)基中形成膜醭。上述細(xì)菌可能是發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭形成的關(guān)鍵細(xì)菌和潛在威脅。

膜醭；發(fā)酵蔬菜；模擬培養(yǎng)基；16S rDNA；pH值變化

發(fā)酵蔬菜主要是以乳酸菌為主的復(fù)雜微生物體系（由蔬菜和輔料等帶入）在相對(duì)封閉的池或壇中自然發(fā)酵而成[1]，世界各地都有生產(chǎn)和食用，如中國(guó)泡菜、韓國(guó)泡菜[2]以及歐洲的sauerkraut和酸黃瓜等[3-4]。目前，大多數(shù)的發(fā)酵蔬菜產(chǎn)品都已逐漸由原來(lái)的家庭作坊生產(chǎn)轉(zhuǎn)變成工業(yè)化生產(chǎn)，邁向工業(yè)化生產(chǎn)的成熟期[5]。但無(wú)論是家庭制作還是工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵蔬菜，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中和發(fā)酵后都保留有豐富的微生物數(shù)量和多樣性。這樣復(fù)雜的微生物菌群中也會(huì)存在一些腐敗微生物，它們?cè)谝欢l件下會(huì)打破原有的微生物生態(tài)平衡并大量繁殖，通過(guò)生成令人不悅的風(fēng)味物質(zhì)或分泌胞外酶破壞蔬菜組織結(jié)構(gòu)[6]、產(chǎn)生腐敗膜醭（pellicle，俗稱“生花”）[7]、代謝發(fā)酵體系中的乳酸引起pH值的升高并促使其他腐敗微生物的生長(zhǎng)[8]，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)酵蔬菜的腐敗，對(duì)發(fā)酵蔬菜行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

膜醭即聚集在空氣與液體交界面的，被細(xì)胞自身分泌的胞外大分子物質(zhì)包裹使得單細(xì)胞個(gè)體相互黏附在一起的、有組織的細(xì)胞群體[9]。其形成機(jī)理為：從細(xì)胞水平來(lái)看，單一運(yùn)動(dòng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)移動(dòng)互相粘黏形成難運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞長(zhǎng)鏈，再通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)使其對(duì)齊并相互黏附；從宏觀來(lái)看，先形成薄的膜醭，再變厚，隨后形成成熟膜醭[10]。它是發(fā)酵蔬菜腐敗最常見(jiàn)的現(xiàn)象之一。一般認(rèn)為發(fā)酵蔬菜鹽鹵表面腐敗膜醭的形成主要由真菌引起，如克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）和白地霉（Galactomyces candidum）[6]。但敖曉琳等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蔬菜鹽鹵表面的腐敗膜醭中存在著芽孢桿菌。王猛等[11]在比較分析不同鹽濃度四川泡菜腐敗前后的微生物時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在腐敗膜醭中有細(xì)菌存在，但是未對(duì)細(xì)菌是否形成膜醭進(jìn)行探討。國(guó)內(nèi)外有很多研究者對(duì)細(xì)菌形成膜醭進(jìn)行了報(bào)道[12-13]，但對(duì)能在發(fā)酵蔬菜中存在并形成膜醭的細(xì)菌的報(bào)道卻很少。因此，本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵蔬菜鹽鹵表面腐敗膜醭中的微生物入手，對(duì)其進(jìn)行分離、回接并鑒定，分析菌種種類及其膜醭形成特性，對(duì)發(fā)酵蔬菜表面腐敗膜醭形成的預(yù)防和控制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與材料

新鮮筍殼青菜為市售。蔬菜發(fā)酵菌種為L(zhǎng)actobacillus plantarum E11，發(fā)酵蔬菜前期研究中分離并保藏[14]。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

放線菌酮、DNA Marker、Taq DNA連接酶、dNTPs、DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒 北京天根生化科技有限公司；RNase A 美國(guó)Sigma公司。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soy agar，TSA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、1 000 mL蒸餾水，pH值為6.0±0.2，121 ℃滅菌30 min。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、1 000 mL蒸餾水，pH值為6.0±0.2，121 ℃滅菌30 min。

本研究中所用模擬培養(yǎng)基如表1所示。

表 1 用于分析發(fā)酵蔬菜膜醭形成菌特性的模擬培養(yǎng)基Table 1 Preparation of model media used to characterize pellicleforming isolates from fermented vegetable

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SHA-B恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；SW-CJ-IF潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；pHS-3C酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蔬菜發(fā)酵

將新鮮筍殼青菜用清水洗凈，晾干。取800 g洗凈晾干的筍殼青菜于泡菜壇中，向壇中加入1 500 mL含食鹽質(zhì)量濃度為6 g/100 mL的涼開(kāi)水，涼開(kāi)水中已加入活化的L. plantarum E11（終濃度為106CFU/mL）。在室溫下靜置發(fā)酵和貯藏，直至發(fā)酵鹽鹵表面形成腐敗膜醭。

1.3.2 產(chǎn)膜醭微生物的分離

從長(zhǎng)有腐敗膜醭的泡菜壇中用無(wú)菌玻璃棒挑取鹽鹵表面的薄膜于5 mL無(wú)菌生理鹽水（0.9% NaCl），將其振蕩搖勻后進(jìn)行等梯度稀釋至10－3～10－5，分別取100 μL各稀釋度的菌懸液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基，再倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～36 h。

1.3.3 產(chǎn)膜醭微生物的回接

隨機(jī)挑取5 0 個(gè)形態(tài)不同的單克?。ň幪?hào)為P1～P50）于5 mL TSB培養(yǎng)基30 ℃搖床培養(yǎng)12～18 h后，取500 μL懸浮液接種于5 mL TFB培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d。

1.3.4 產(chǎn)膜醭微生物的分子生物學(xué)鑒定

將能夠在TFB培養(yǎng)基表面形成膜醭的單克隆菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。用DNA提取試劑盒分別提取各單克隆菌株的基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果。以提取的基因組DNA為模板，細(xì)菌以Eu27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’）和1490R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物，PCR體外擴(kuò)增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、1 min、50 ℃、1 min、72 ℃、2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，進(jìn)行擴(kuò)增16S rDNA片段。真菌以NSl（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NS4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）為引 物，其PCR體外擴(kuò)增條件為：94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，40 ℃、1 min，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min，進(jìn)行擴(kuò)增18S rDNA片段。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，送成都擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析，并通過(guò)Clustal X軟件多重比對(duì)后用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5 產(chǎn)膜醭微生物在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭情況分析

將經(jīng)過(guò)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定后的菌株分別接種于TSB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12～18 h。再分別取培養(yǎng)的菌懸液2 mL接種于50 mL TSB、VJ、FB、TFB、FVJ和TFVJ培養(yǎng)基中，搖勻后，分別分裝到5 支無(wú)菌試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)10～12 d。于第1、3、5、7、11天觀察膜醭形成情況并取出一支試管進(jìn)行pH值的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)膜醭菌株的分離

將制備的發(fā)酵蔬菜靜置貯藏至鹽鹵表面形成腐敗膜醭后，用無(wú)菌玻璃棒挑取膜醭于5 mL生理鹽水，混勻進(jìn)行10 倍梯度稀釋后涂布TSA培養(yǎng)基。30 ℃倒置培養(yǎng)后，稀釋度為10－4的TSA上長(zhǎng)出212 個(gè)菌落，從中隨機(jī)挑取50 個(gè)單克隆于5 mL TSB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，并分別編號(hào)為P1～P50。

2.2 產(chǎn)膜醭菌株的回接

取500 μL過(guò)夜培養(yǎng)的單克隆P1～P50于5 mL TFB培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)有部分菌株已形成膜醭。最終篩選出6 株形成膜醭速度快且膜醭較厚的菌株，其編號(hào)分別為P5、P11、P17、P29、P37和P48。由圖1可知，P5、P17和P37形成的膜醭厚，且P5和P17的培養(yǎng)液比較透明。P11、P29和P48形成片狀薄膜醭，且培養(yǎng)液比較渾濁。

圖 1 6 株菌株在TFB培養(yǎng)基表面形成膜醭情況Fig. 1 Pellicle formation by six isolates on the surface ofTFB

2.3 產(chǎn)膜醭微生物的分子鑒定結(jié)果分析

圖 2 細(xì)菌基因組DNA（A）和16S rDNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（B）瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of different bacteria (A) and PCR-amplified products of their 16S rDNA (B)

將P5、P11、P17、P29、P37和P48用TSB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，其菌液分別用DNA提取試劑盒提取總基因組DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析。從圖2A可以看到，沒(méi)有明顯的拖尾現(xiàn)象，有亮帶，且片段大小超過(guò)15 kb，達(dá)到DNA提取要求。以基因組DNA為模板，分別進(jìn)行了16S rDNA和18S rDNA PCR擴(kuò)增，僅出現(xiàn)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小在1～2 kb之間（圖2B），瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰。因此判斷這6 株菌株均為細(xì)菌。

將PCR擴(kuò)增的16S rDNA片段與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析，并通過(guò)Clustal X軟件多重比對(duì)后，用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。Devereux等[15]認(rèn)為當(dāng)16S rRNA的序列同源性不小于97%時(shí)可以認(rèn)為是一個(gè)屬，同源性不小于98%時(shí)則可以認(rèn)為是同一個(gè)種。進(jìn)行鑒定的6 株菌株屬于6 個(gè)菌種，菌株P(guān)5為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、P11為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、P17為科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp. cohnii）、P29為普羅威登斯菌（Providencia vermicola）、P37為克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella sp.）以及P48為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。

圖 3 基于16S rDNA構(gòu)建的發(fā)酵蔬菜中產(chǎn)膜醭細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogentic tree based on 16S rDNA sequences of pellicleforming strains

普遍認(rèn)為，腐敗的發(fā)酵蔬菜表面形成的膜醭主要是由真菌引起的，鐘小廷[16]和饒瑜[6]等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭中的真菌主要為畢赤酵母屬；Chapot-Chartier等[17]發(fā)現(xiàn)在一定的條件下Lactococcus lactis能夠形成膜醭。Armitano等[10]發(fā)現(xiàn)不僅革蘭氏陽(yáng)性菌如枯草芽孢桿菌能夠形成膜醭，革蘭氏陰性菌如Acinetobacter也能形成膜醭。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)把從膜醭中分離鑒定出來(lái)的6 株菌株回接到TFB中，發(fā)現(xiàn)這6 株菌株都能夠形成不同程度的膜醭，充分證明了發(fā)酵蔬菜表面的腐敗膜醭不僅是由真菌引起的，細(xì)菌也能夠形成腐敗膜醭。

2.4 產(chǎn)膜醭細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭特性分析

2.4.1 產(chǎn)膜醭細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭情況

將上述6 株菌株接種到TSB、VJ、FB、TFB、FVJ和TFVJ 6 種培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，觀察其長(zhǎng)膜情況（表2）。將不同程度的膜醭形成情況分為4 個(gè)層次如圖4所示。由表2可知，枯草芽孢桿菌產(chǎn)膜醭能力很強(qiáng)，能在TSA、VJ、FB、TFB和TFVJ中形成膜醭，且產(chǎn)膜醭量比較多，培養(yǎng)3 d就能夠產(chǎn)生片狀薄膜醭，與Trejo等[18]的研究結(jié)果相吻合?？剖掀咸亚蚓剖蟻喎N產(chǎn)膜醭的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道非常少，只有少量文獻(xiàn)報(bào)道了科氏葡萄球菌科氏亞種能夠在非生命固體表面形成生物膜[19]。本實(shí)驗(yàn)中分離得到的科氏葡萄球菌科氏亞種能在6 種培養(yǎng)基中產(chǎn)生膜醭，在TFB培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭能力最強(qiáng)，能夠產(chǎn)生片狀厚膜醭，其產(chǎn)膜醭時(shí)間與枯草芽孢桿菌產(chǎn)膜時(shí)間大致相同，但在FVJ培養(yǎng)基中第7天才長(zhǎng)膜醭，其原因可能是由于FVJ培養(yǎng)基的pH值較低（約3.5左右）?？莶菅挎邨U菌和科氏葡萄球菌科氏亞種在VJ培養(yǎng)基中成膜情況比在FB和FVJ中好，表明這兩株菌株形成膜醭易受到pH值的影響。

表 2 產(chǎn)膜醭細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的膜醭形成情況Table 2 Pellicle-forming abilities of different bacteria in different media

圖 4 不同程度的膜醭Fig. 4 Different degrees of pellicle formation

有很多文章報(bào)道了陰溝腸桿菌產(chǎn)生生物膜[20-22]，但是關(guān)于產(chǎn)生膜醭的報(bào)道卻很少，分析陰溝腸桿菌在6 種不同培養(yǎng)基中成膜情況，發(fā)現(xiàn)它在VJ、TSB、TFB和TFVJ等培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生不同程度的膜醭，在FB和FVJ中不能產(chǎn)生膜醭，究其原因可能是FB和FVJ這兩種培養(yǎng)基pH值較低（低于4.0），抑制其生長(zhǎng)[23]。克雷伯氏桿菌屬、弗氏檸檬酸桿菌和普羅威登斯菌在5 種模擬培養(yǎng)基中產(chǎn)膜情況大致相同?？死撞蠗U菌屬在TFVJ中產(chǎn)膜量增大，能產(chǎn)生片狀厚膜醭，但在TFB只能產(chǎn)生零星膜醭。弗氏檸檬酸桿菌能在TFB中形成較厚的片狀膜醭，但在TFVJ中能形成片狀膜醭。而普羅威登斯菌在TFB和TFVJ中都只能形成少量膜醭。但是3 株菌株都不能在VJ培養(yǎng)基中形成膜醭，表明發(fā)酵體系的低pH值環(huán)境可能會(huì)脅迫這3 株菌株形成膜醭，進(jìn)而抵抗外界環(huán)境的壓力達(dá)到保護(hù)自己的目的[16]。

分析培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌形成膜醭的影響發(fā)現(xiàn)，不同菌株在不同培養(yǎng)基條件下形成的膜醭情況不同?？死撞蠗U菌屬和普羅威登斯菌在TFB和TFVJ條件下，比TSB條件下更易形成膜醭，說(shuō)明克雷伯氏桿菌屬和普羅威登斯菌僅在發(fā)酵蔬菜條件下特異的形成膜醭并引發(fā)腐敗。FB和FVJ這2種培養(yǎng)基是最不適合細(xì)菌形成膜醭的，雖然這2種培養(yǎng)基的成分與發(fā)酵蔬菜的營(yíng)養(yǎng)成分也很接近，但缺乏氮源（沒(méi)有添加胰蛋白胨），且pH值太低不利于產(chǎn)膜細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。而枯草芽孢桿菌和科氏葡萄球菌科氏亞種在FB或FVJ培養(yǎng)基中也能形成膜醭，說(shuō)明其對(duì)氮源需求不高，更有可能是發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭形成的關(guān)鍵細(xì)菌和潛在威脅。

2.4.2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)膜醭細(xì)菌過(guò)程中環(huán)境pH值的變化

圖 5 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)膜醭細(xì)菌過(guò)程中的環(huán)境pH值變化Fig. 5 Changes in pH value during the growth of pellicle-forming strains in different media

由圖5可知，絕大多數(shù)培養(yǎng)基在培養(yǎng)產(chǎn)膜醭細(xì)菌的過(guò)程中pH值呈上升趨勢(shì)，到7.5～8.0趨于穩(wěn)定，部分培養(yǎng)基的pH值沒(méi)有變化是因?yàn)榫暝谂囵B(yǎng)過(guò)程中未能生長(zhǎng)。結(jié)合表2和圖5進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，菌株在生長(zhǎng)和膜醭形成過(guò)程中培養(yǎng)基pH值升高，究其原因可能是某些模擬培養(yǎng)基中添加了胰蛋白胨，在被菌株利用后引起培養(yǎng)基pH值升高，或者是某些菌株在生長(zhǎng)和產(chǎn)膜醭過(guò)程中利用代謝產(chǎn)物引起培養(yǎng)基pH值升高。如枯草芽孢桿菌和科氏葡萄球菌科氏亞種在FB或FVJ培養(yǎng)基中開(kāi)始形成膜醭時(shí)pH值高于5.0，表明這兩株菌株除了能形成膜醭外，還能引起培養(yǎng)基pH值升高，這一特性與能利用乳酸引起發(fā)酵蔬菜腐敗的微生物相同，這也是發(fā)酵蔬菜腐敗的另一典型特征[24-25]。

3 結(jié) 論

從發(fā)酵蔬菜膜醭中分離出的6 株菌株，經(jīng)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定均為細(xì)菌，分別是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp. cohnii）、普羅威登斯菌（Providencia vermicola）、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella sp.）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。將6 株 菌株接種到模擬培養(yǎng)基中，菌株在生長(zhǎng)和膜醭形成過(guò)程中環(huán)境pH值升高，且不同的菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)膜醭情況不同。枯草芽孢桿菌和科氏葡萄球菌科氏亞種對(duì)氮源要求不高，能在沒(méi)有加胰蛋白胨的FB和FVJ中形成膜醭，同時(shí)在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中還能引起培養(yǎng)基pH值升高，這也是發(fā)酵蔬菜腐敗的另一典型特征?？死撞蠗U菌屬和普羅威登斯菌僅在TFB和TFVJ形成膜醭，這些菌株可能是發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭形成的關(guān)鍵細(xì)菌和潛在威脅。在發(fā)酵蔬菜實(shí)際生產(chǎn)和腐敗過(guò)程中，上述產(chǎn)膜醭細(xì)菌共存于同一發(fā)酵蔬菜體系，它們之間的時(shí)間和空間地位、協(xié)同或競(jìng)爭(zhēng)作用等，還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)將為發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭形成機(jī)理的研究和腐敗膜醭的防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Isolation, Identification and Growth Characteristic Analysis of Pellicle-Forming Bacteria from Spoiled Vegetable

HE Penghui1, QIAN Yang1, WANG Meng2, YANG Jiantao1, ZHAO Tingting1, JIANG Yunlu3, CHE Zhenming1, RAO Yu1,*
(1. College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Dongpo Chinese Paocai Industrial Technology Research Institute, Meishan 620020, China; 3. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610097, China)

The ma in microbes which could form pellicle in spoiled vegetable were isolated and identified. The growth characteristics of these microbes were also analyzed. Tryptone soy agar (TSA) medium was used to isolate the pellicleforming microorganisms. Fifty isolates were selected randomly from TSA medium and inoculated into tryptone soy broth medium supplemented with fermented brine (TFB). Six isolates which could form pellicle on the surface of the medium were subjected to 16S rDNA or 18S rDNA identification. The results showed that the pellicle-forming agents were all ba cteria, which were identi ed as Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Providencia vermicola, Klebsiella sp. and Enterobacter cloacae. The pellicle-forming abilities of each isolate in different model media were different. Bacillus subtilis and Staphylococcus cohnii subsp. cohnii could also increase the pH value of the medium and had lower nitrogen requirement. Klebsiella sp. and Providencia vermicola could form pellicle only in TFB and TSA supplemented with squeezed juice from fermented vegetable (TFVJ). The bacteria des cribed above might be the key agents for pellicle formation and pose a potential risk for fermented vegetable quality.

pellicle; fermented vegetable; model media; 16S rDNA; pH variation

10.7506/spkx1002-6630-201710016

TS201.3

A

1002-6630（2017）10-0092-06

何鵬暉, 錢楊, 王猛, 等. 腐敗發(fā)酵蔬菜中產(chǎn)膜醭細(xì)菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 92-97.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710016. http://www.spkx.net.cn

HE Penghui, QIAN Yang, WANG Meng, et al. Isolation, identification and growth characteristic analysis of pellicle-forming bacteria from spoiled vegetable[J]. Food Science, 2017, 38(10): 92-97. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spk x1002-6630-201710016. http://www.spkx.net.cn

2016-08-02

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2015JY0142）；教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目（Z2015123）；西華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（ycjj2016046）

何鵬暉（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩-mail：240538743@qq.com

*通信作者：饒瑜（1982—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇踩?。E-mail：ryfish@163.com