蔡雪梅，蔣英麗，吳聯(lián)海，徐 延，陳 劍，高 鴻，羅愛民,*

不同區(qū)域醬香型白酒人工窖底泥細(xì)菌多樣性及其影響因子

蔡雪梅1，蔣英麗2，吳聯(lián)海2，徐 延1，陳 劍1，高 鴻1，羅愛民1,*

（1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川 古藺 646500）

為探討醬香型白酒人工窖底泥中細(xì)菌的多樣性及其影響因子，應(yīng)用高通量測序技術(shù)，比較4 種不同區(qū)域人工窖底泥的細(xì)菌多樣性，并結(jié)合理化指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，不同區(qū)域的窖底泥理化性質(zhì)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都存在一定差異，且距離越遠(yuǎn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異越大。聚類結(jié)果顯示區(qū)域相近的二郎鎮(zhèn)、習(xí)酒鎮(zhèn)和茅臺鎮(zhèn)的窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)類似，其主要菌群包括Aminicenantes、綠彎菌門和變形菌門；而瀘州市的窖底泥與這3 個區(qū)域的有明顯差異，其主要菌群是厚壁菌門。影響窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性的主要理化因子有pH值、速效鉀和水分，受這3 種理化因子影響較為顯著的菌群有Aminicenantes、厚壁菌門、放線菌門、裝甲菌門。

高通量測序；細(xì)菌多樣性；醬香型白酒

醬香型白酒是中國白酒的五大香型之一[1]，具有醬香突出、酒體醇厚、幽雅細(xì)膩、回味悠長的風(fēng)格特點(diǎn)[2-4]，醬香型酒的典型代表有國酒茅臺和四川郎酒。醬香型白酒有3 種典型體：“醬香型”、“醇甜型”及“窖底香型”，成品醬香型白酒是以此3 種典型體為主勾兌而成。醬香型白酒發(fā)酵容器是泥底條石窖，發(fā)酵時窖底酒醅與窖底泥接觸；“窖底香型”酒在實(shí)際生產(chǎn)中采用“雙輪底”生產(chǎn)技術(shù)，在“三、四、五、六”輪次進(jìn)行生產(chǎn)，其品質(zhì)與窖底泥質(zhì)量有密切關(guān)系。窖底泥中富集了大量的微生物及生物營養(yǎng)（包括氮、磷、鉀等元素和多種化合物），不僅對窖底香型白酒中微量香味成分的形成及其量比關(guān)系的協(xié)調(diào)起著重要的作用，也在白酒釀造過程中起到接種微生物和提供發(fā)酵環(huán)境的重要作用，為釀酒提供豐富的風(fēng)味物質(zhì)[5-9]?！敖训紫阈汀卑拙瞥煞种饕ㄒ阉?、已酸乙酯、乳酸乙酯等為主的香味香氣，濃烈且凸顯柔和，它是由品質(zhì)好的窖池，經(jīng)過較長時間的發(fā)酵取窖底酒醅蒸餾，貯存而得，里面的微量成分豐富，常作為調(diào)味酒使用，在醬香型白酒產(chǎn)品質(zhì)量中發(fā)揮著重要的作用。

近年來，對濃香型白酒窖泥研究較多，而對醬香型白酒窖泥，尤其是窖底泥研究則較為少見。陶勇等[10]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）技術(shù)研究了不同窖齡的窖泥微生物與環(huán)境因子的相關(guān)性，得出有效磷、氨氮、pH值對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大，其次是腐殖質(zhì)；黃治國等[11]利用PCRDGGE研究了不同區(qū)域濃香型白酒窖池窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及其與理化因子的關(guān)系，得出不同區(qū)域的窖泥樣本細(xì)菌多樣性有明顯差異，且其多樣性與總酸呈負(fù)相關(guān)、與pH值呈正相關(guān)；韓光等[12]研究了窖泥微生物、窖泥酶活與窖泥養(yǎng)分的相關(guān)性，得出速效磷、水解氮、蔗糖酶和過氧化氫酶是影響微生物總數(shù)量的主要因子。醬香型白酒中“窖底香型”白酒與窖底泥的質(zhì)量關(guān)系重大，但醬香型白酒窖底泥研究較為少見，特別是關(guān)于醬香型人工窖底泥的細(xì)菌多樣性及其與理化因子的相關(guān)分析研究報(bào)道較少，醬香白酒窖底泥是否與濃香型白酒窖泥具有相似的特性，這是一個值得進(jìn)一步探討的問題。

利用分子生物學(xué)方法研究獲得微生物遺傳信息多樣性的方法是目前研究微生物多樣性的主要方法，主要包括末端限制性片段長度多態(tài)性分析、DGGE、16S rDNA克隆文庫、高通量測序技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)，這些方法避免了傳統(tǒng)微生物多樣性分析方法局限性[13-14]，在分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)中具有重要優(yōu)勢，能更可靠、更直接地反映細(xì)菌的群落構(gòu)成及多樣性[15]。但大多數(shù)方法主要基于傳統(tǒng)測序技術(shù)及芯片技術(shù)來開展，測序通量有限且只能檢測環(huán)境中部分高豐度菌株的微生物信息，無法全面獲得整個環(huán)境中微生物的多樣性及功能基因信息[16]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，第2代的高通量測序技術(shù)如Roche454、Illumina HiSeq2000/2500/4000及MiSeq，Ion Torrent以及PacBio等，相比基因文庫、DGGE等菌群分析方法的數(shù)據(jù)量更大、分辨率更高，且免去大量人工操作，可有效用于各種酒類微生物多樣性研究[13,17]。

本實(shí)驗(yàn)利用MiSeq高通量測序技術(shù)探討不同區(qū)域醬香型白酒窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并探索其與理化特征之間的相關(guān)性，為今后制定判斷醬香型窖底泥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)，同時也為人工窖底泥的培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

人工窖底泥樣本分別采自習(xí)酒鎮(zhèn)、二郎鎮(zhèn)、瀘州市和茅臺鎮(zhèn)地區(qū)4 家醬香型白酒廠，用取樣器轉(zhuǎn)移至無菌聚乙烯袋[18]，密封保存,迅速置于冰盒運(yùn)回，分別編號為1、2、3、4號，置于－20 ℃條件下保藏。

1.2 試劑

AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；QuantiFluor-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 鹽城賽寶生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

IKA VORTEX1振蕩儀 萊貝（上海）科學(xué)儀器有限公司；JA1203分析天平 上海楚定分析儀器有限公司；TGL20M-Ⅱ冷凍離心機(jī) 西安禾普生物科技有限公司；火焰分光光度計(jì) 上海傲譜分析儀器有限公司；ABI GeneAmp? 9700 PCR儀 上海賽默生物科技有限公司；核酸蛋白微量檢測儀 芯起點(diǎn)基因科研（北京）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 窖底泥理化性質(zhì)的測定

窖底泥理化性質(zhì)參考文獻(xiàn)[19]，其中水分：常壓烘干法；pH值：電位法；有機(jī)質(zhì)：K2Cr2O7容量法；全氮：半微量開氏法；堿解氮：堿解擴(kuò)散法；全磷：HClO4-H2SO4消煮法；有效磷：NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；全鉀：火焰光度法；速效鉀：NH4OAC浸提-火焰光度法；鐵、鋅、錳、鈣：原子吸收分光光度法。

1.4.2 窖底泥總DNA的提取與測序

使用MIBIO Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit[18]試劑盒提取窖底泥中微生物的總DNA，然后用核酸蛋白微量檢測儀檢測DNA的質(zhì)量濃度和純度，置于－20 ℃條件下備用。PCR擴(kuò)增以338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為引物，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、正向及反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、模板DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。每個樣取3 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫。之后將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，再進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建及測序。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對窖底泥理化性質(zhì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以及對窖底泥細(xì)菌多樣性和理化進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Mothur軟件對測序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元（optical transform unit，OTU）聚類以及多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同區(qū)域人工窖底泥的理化特性

表 1 不同窖底泥理化性質(zhì)的單因素方差分析Table 1 One-way analysis of variance (ANOVA) of physicochemical characteristics in different bottom pit muds

窖泥生物營養(yǎng)是構(gòu)成其微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，窖池中所有微生物和理化特性相互作用、相互聯(lián)系共同構(gòu)成具有協(xié)調(diào)性和機(jī)能性的統(tǒng)一體[20-22]。共測定分析了窖底泥的11 個理化指標(biāo)，結(jié)果表明，2號樣本的水分、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀均顯著高于其他3 個樣本（P＜0.05）；3號樣本的水分、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷、全鉀、鐵錳鋅鈣含量均顯著低于其他樣本，而其有效鉀含量顯著高于其他樣本（P＜0.05）；1號和4號樣本除有效磷和金屬元素外，其他指標(biāo)值均介于2號與3號樣本之間，且1號和4號樣本的pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷、全鉀、速效鉀以及鐵錳含量均存在顯著差異（P＜0.05）（表1）。分析可知，不同區(qū)域的窖底泥理化性質(zhì)存在一定的差異，除了區(qū)域差異而導(dǎo)致的環(huán)境因素外，還可能是由于工藝上存在的不同以及窖齡沒有絕對的一致[11]。

2.2 窖底泥細(xì)菌多樣性

2.2.1 測序數(shù)據(jù)合理性分析

圖 1 有效序列長度分布圖Fig. 1 Effective sequence length distribution

通過Miseq高通量測序，將序列優(yōu)化后最終得到優(yōu)化序列25 5797 條，其中有效序列99.88%分布在421～460 bp，其中421～440 bp的堿基占總序列數(shù)的58.06%，441～460 bp的堿基占49.55%（圖1）。

圖 2 各窖底泥細(xì)菌稀釋性曲線Fig. 2 Rarefaction curves for bacteria in different pit bottom muds

根據(jù)相似度水平對所有優(yōu)化序列進(jìn)行OTU劃分，對97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)[23]，共聚類形成822 個OTU。采用對測序序列隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與其所代表的OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線（圖2）。4 個樣本的稀釋性曲線均趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，已反映樣本中絕大部分細(xì)菌的豐度及多樣性，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU。

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖 3 群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig. 3 Bacterial community components

4 個樣本共檢測到35 個細(xì)菌門，其中1號樣本檢測到33 個，2號樣本檢測到30 個，3號樣本檢測到24 個，4號樣本檢測到28 個。1號樣本的優(yōu)勢菌群有綠彎菌門（Chloroflexi，34.48%）、Aminicenantes（29.04%）、變形菌門（Proteobacteria，12.15%）；2號樣本的優(yōu)勢菌群有Aminicenantes（32.28%）、Chloroflexi（19.52%）、Proteobacteria（15.03%）；3號樣本的優(yōu)勢菌群有厚壁菌門（Firmicutes，86.98%）；4號樣本的優(yōu)勢菌群有Chloroflexi（61.82%）、Aminicenantes（20.72%）（圖3）。Chloroflexi、Proteobacteria和Firmicutes在濃香型白酒窖泥中都有發(fā)現(xiàn)，但Aminicenantes未曾被報(bào)道，其在醬香型窖底泥中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。3號樣本中的微生物主要組成與其他3 個樣本相比有明顯差異，其主要菌群Firmicutes一般在濃香型窖泥中含量較高[24]，此菌門中的乳球菌屬和芽孢桿菌屬對窖泥呈味生香貢獻(xiàn)較大[25]，且窖泥的主要產(chǎn)酸功能菌己酸菌主要分布在芽孢桿菌屬[26]。根據(jù)樣本的細(xì)菌豐度，使用SPSS 19.0計(jì)算其歐幾里德距離，當(dāng)歐幾里德距離小于5時，1、2、4號樣本可以歸為一類，表明赤水河流域一帶的習(xí)酒鎮(zhèn)、二郎鎮(zhèn)和茅臺鎮(zhèn)的3 個酒廠的窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，其中習(xí)酒鎮(zhèn)酒廠和二郎鎮(zhèn)酒廠的窖底泥更為相近，瀘州市窖底泥與其他3 種差異較大（圖4）。這說明區(qū)域越相近的窖底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)越相似，王莉等[27]已證實(shí)醬香型白酒生產(chǎn)地域周邊土壤對于窖底泥的形成具有重要的影響，區(qū)域越相近土壤結(jié)構(gòu)越相似，這進(jìn)一步說明環(huán)境因素是導(dǎo)致不同區(qū)域窖底泥存在差異的重要原因之一。

圖 4 聚類分析樹狀圖Fig. 4 Cluster analysis dendrogram

2.2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析通過樣本的多樣性分析計(jì)算出一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)多樣性指數(shù)[28]，進(jìn)而估計(jì)窖底泥細(xì)菌群落的物種豐度和多樣性。由表2可知，2號樣本OTU種類最多，物種多樣性最豐富，其次是1號樣本，4號樣本的物種多樣性最少。理化結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，2號樣本物種最豐富且其水分、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀均顯著高于其他3 個樣本，張強(qiáng)等[29]曾指出營養(yǎng)物質(zhì)的富集有助于釀酒微生物的生長，這說明良好的理化環(huán)境能夠提高窖底泥細(xì)菌的多樣性。

表 2 不同窖底泥細(xì)菌群落的多樣性分析Table 2 Diversity index for bacterial community of different pit muds

2.2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性與理化性質(zhì)的關(guān)系利用SPSS 19.0分析計(jì)算窖底泥理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性的相關(guān)性。由表3可知，有機(jī)質(zhì)、速效鉀與Chao指數(shù)、

表 3 窖底泥細(xì)菌多樣性與理化的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between bacterial diversity and physicochemical properties

Ace指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，全氮、全鉀、水分、pH值、鋅與Chao指數(shù)、Ace指數(shù)在不同水平上呈顯著正相關(guān)。水分在0.01水平上與Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)；速效鉀在0.05

水平上與Shannon指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)；pH值在0.01水平上與Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。這說明pH值、速效鉀和水分與窖底泥細(xì)菌群落多樣性有顯著相關(guān)性，其中pH值最為顯著，pH值影響微生物的代謝活動，從而引起有機(jī)質(zhì)、礦物元素以及金屬元素的變化，而這些變化會進(jìn)一步影響窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在濃香型窖泥相關(guān)研究報(bào)道中也有指出pH值對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大[10-11]。

2.2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與窖底泥理化性質(zhì)的關(guān)系

表 4 窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between bacterial community structure and physicochemical properties

相關(guān)性分析表明，在0.05水平上，Aminicenantes與速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)，與水分、pH值、鋅元素呈顯著正相關(guān)；Firmicutes與水分、pH值以及鐵鋅呈顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀呈顯著正相關(guān)；Actinobacteria與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)；Armatimonadetes與速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)（表4）。分析表明，對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較為顯著的理化因子有：pH值、速效鉀、水分，受這些因子影響較為顯著的菌群有：Aminicenantes、Firmicutes、Actinobacteria、Armatimonadetes。

3 討 論

通過高通量測序方法研究遠(yuǎn)近距離不同區(qū)域的窖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)，清晰全面地揭示了微生物組成的差異，并結(jié)合理化性質(zhì)分析了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性與理化特征之間的關(guān)系。所選取的遠(yuǎn)近不一的4 個區(qū)域的醬香型窖底泥具有一定的區(qū)域代表性，因?yàn)樵诮涯嗟闹谱鬟^程中，黃泥占了主要部分，一般窖泥生產(chǎn)時就地取材，所以推測同一區(qū)域的窖泥具有一定的相似性，同時由于不同廠家的窖泥生產(chǎn)工藝具有一定差異，也造成了窖泥的差異性，因此假設(shè)同一區(qū)域的窖泥具有很強(qiáng)的相似性，這對于取樣來講，即可減少研究樣本的數(shù)量，又具有一定的代表性。

通過4 個樣本的比較分析，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的窖底泥理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都存在一定的差異，且區(qū)域距離越遠(yuǎn)差異越大。二郎鎮(zhèn)窖底泥的水分、pH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀均顯著高于其他3 種窖底泥，且其細(xì)菌物種總數(shù)最多，細(xì)菌多樣性最豐富；而距赤水河流域一帶較遠(yuǎn)的瀘州窖底泥水分、pH值、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、全鉀、鐵錳鋅鈣均顯著偏低，且其細(xì)菌多樣性也較低。赤水河流域一帶的3 個區(qū)域（習(xí)酒鎮(zhèn)、二郎鎮(zhèn)、茅臺鎮(zhèn)）的窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，其中距離較近的習(xí)酒鎮(zhèn)和二郎鎮(zhèn)的窖底泥更為相近。導(dǎo)致這些差異性存在的原因除了工藝和取樣點(diǎn)的不完全一致性，可能更重要的是地理環(huán)境因素，黃泥和黃水作為制作人工窖底泥的主要原輔料，攜帶著豐富的微生物，是窖底泥重要的微生物來源，而不同區(qū)域的土壤和水資源存在差異，其具體形成差異性的原因有待進(jìn)一步探討。

通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性主要受pH值、速效鉀、水分的影響。在一定范圍類，窖底泥細(xì)菌多樣性與速效鉀呈負(fù)相關(guān)，與pH值和水分含量呈正相關(guān)，受這3 種理化因子影響較為顯著的菌群有：Aminicenantes、Firmicutes、Actinobacteria、Armatimonadetes，其具體影響機(jī)制有待后續(xù)研究。

[1] 李習(xí), 方尚玲, 劉超, 等. 醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)主體成分研究進(jìn)展[J].釀酒, 2012, 39(3): 19-23. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2012.03.008.

[2] 朱德文, 蔣英麗, 高鴻, 等. 醬香型大曲中一株產(chǎn)香芽孢桿菌的分離鑒定[J]. 釀酒科技, 2014(6): 43-46. DOI:10.13746/j.njkj.2014.0051.

[3] 陳劍, 蔣英麗, 程偉, 等. 醬香型白酒酒糟中耐酸產(chǎn)酯香細(xì)菌的篩選[J].釀酒科技, 2016(2): 61-64. DOI:10.13746/j.njkj.2015413.

[4] 王婧, 王曉丹, 羅曉葉, 等. 醬香大曲中高產(chǎn)蛋白酶功能細(xì)菌的篩選及鑒定[J]. 中國釀造, 2015, 34(10): 43-46. DOI:10.11882/ j.issn.0254-5071.2015.10.010.

[5] 任道群, 劉茂柯, 唐玉明, 等. 濃香型酒窖泥理化特性的研究[J]. 中國釀造, 2014, 33(10): 55-57. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.013.

[6] 劉淼, 姚萬春, 唐玉明, 等. 功能性人工窖泥的培養(yǎng)和應(yīng)用[J]. 釀酒科技, 2014(6): 80-83. DOI:10.13746/j.njkj.2014.0060.

[7] 郭富祥, 侯建光, 張俊峰. 人工窖泥培養(yǎng)工藝探析[J]. 釀酒科技, 2013(11): 47-49. DOI:10.13746/j.njkj.2013.11.031.

[8] 謝玉球, 林洋, 周二干, 等. 人工窖泥的制作和養(yǎng)護(hù)[J]. 釀酒科技, 2013(2): 67-69. DOI:10.13746/j.njkj.2013.02.033.

[9] 徐開成, 徐希望, 夏培禹, 等. 人工窖泥在北方濃香型曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技, 2005(1): 50-51. DOI:10.13746/j.njkj.2005.01.014.

[10] 陶勇, 徐占成, 李東訊, 等. 窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替及其與環(huán)境因子的相關(guān)性[J]. 釀酒科技, 2011(9): 42-46. DOI:10.13746/ j.njkj.2011.09.002.

[11] 黃治國, 王艷麗, 衛(wèi)春會, 等. 不同地域窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及其與理化因子相關(guān)分析[J]. 釀酒科技, 2015(11): 18-25. DOI:10.13746/ j.njkj.2015097.

[12] 韓光, 張宿義, 盧中明, 等. 窖泥微生物,窖泥酶活性與窖泥養(yǎng)分相關(guān)性研究[J]. 釀酒科技, 2011(3): 49-52. DOI:10.13746/ j.njkj.2011.03.023.

[13] 葉光斌, 羅惠波, 楊曉東, 等. 基于免培養(yǎng)法研究瀘州地區(qū)濃香型白酒窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 176-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201317038.

[14] YANG F, ZENG X W, NING K, et al. Saliva microbiomes distinguish caries-active from healthy human populations[J]. The ISME Journal, 2012, 6(1): 1-10. DOI:10.1038/ismej.2011.71.

[15] NOGALES B, MOORE E R B, LLOBE-BROSSA E, et al. Combined use of 16S ribosomal DNA and 16S rRNA to study the bacterial community of polychlorinated biphenyl-polluted soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(4): 1874-1884. DOI:10.1128/ AEM.67.4.1874-1884.2001.

[16] 陳玲, 袁玉菊, 曾麗云, 等. 16S rDNA克隆文庫法與高通量測序法在濃香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析中的對比研究[J]. 釀酒科技, 2015(12): 33-36. DOI:10.13746/j.njkj.2015145.

[17] MACCALLUM I, PRZYBYLSKI D, GNERRE S, et al. Small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads[J]. Genome Biology, 2009, 10(10): R103. DOI:10.1186/ gb-2009-10-10-r103.

[18] DENG B, SHEN C H, SHAN X H, et al. PCR-DGGE analysis on microbial communities in pit mud of cellars used for different periods of time[J]. The Institute of Brewing and Distilling, 2012, 118(1): 120-126. DOI:10.1002/jib.2.

[19] 王福榮. 釀酒分析與檢測[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

[20] 李海峰, 沈才洪, 盧忠明, 等. 人工窖泥的研究進(jìn)展[J]. 釀酒, 2012, 39(2): 33-38. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2012.02.033.

[21] 姚繼承, 殷成浩, 屈光偉, 等. 窖池養(yǎng)護(hù)的基本原理與實(shí)踐[J]. 釀酒科技, 2014(6): 74-76. DOI:10.13746/j.njkj.2014.0082.

[22] 李祖明, 張洪遠(yuǎn), 王于廣, 等. 醬香型窖泥理化指標(biāo)的研究[J]. 食品科技, 2011, 36(9): 79-82. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2011.09.044.

[23] OBERAUNER L, ZACHOW C, LACKNER S, et al. The ignored diversity: complex bacterial communities in intensive care units revealed by 16S pyrosequencing[J]. Scienti c Reports, 2013, 3: 1413. DOI:10.1038/srep01413.

[24] 陶勇, 芮俊鵬, 徐占成, 等. 濃香型白酒窖泥中細(xì)菌和古菌的組成與多樣性[J]. 化工學(xué)報(bào), 2014, 65(5): 1800-1806. DOI:10.13746/ j.njkj.2011.09.002.

[25] 侯小歌, 王俊英, 李學(xué)思, 等. 濃香型白酒糟醅及窖泥產(chǎn)香功能菌的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(7): 1257-1265. DOI:10.13344/ j.microbiol.china.2013.07.011.

[26] 楊菁謹(jǐn), 唐雪, 楊先超, 等. 瀘州老窖不同窖齡窖泥中己酸菌遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016(2): 182-188. DOI:10.16036/j.issn.1000-2650.2015.02.010.

[27] 王莉, 王亞玉, 王和玉, 等. 醬香型白酒窖底泥微生物組成分析[J].釀酒科技, 2015(1): 12-15. DOI:10.13746/j.njkj.2014513.

[28] 喬曉梅, 趙景龍, 杜小威, 等. 高通量測序法對清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的分析[J]. 釀酒科技, 2015(4): 28-31. DOI:10.13746/ j.njkj.2015076.

[29] 張強(qiáng), 沈才洪, 劉清斌, 等. 窖泥質(zhì)量評價研究進(jìn)展[J]. 釀酒科技, 2013(7): 45-48. DOI:10.13746/j.njkj.2013.07.051.

Diversity of Bacteria and Its Influencing Factors in Bottom Pit Mud from Artificial Cellars Used for the Production Maotai-Flavor Liquor in Different Regions

CAI Xuemei1, JIANG Yingli2, WU Lianhai2, XU Yan1, CHEN Jian1, GAO Hong1, LUO Aimin1,*
(1. College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 2. Sichuan Gulin Langjiu Group Co. Ltd., Guli n 646500, China)

The purpose of this study was to investigate the bacterial diversity and its influencing factors in bottom pit mud from artificial cellars used for the production of Maotai-flavor liquor. A high-throughput sequencing technique was used to analyze the bacterial diversity of four pit mud samples from different liquor producing regions and its correlations with physicochemical factors. The results showed that there was a significant difference in physicochemical characteristics and bacterial community among bottom pit muds from different regions and the longer the geographic distance was, the greater the difference in bacterial community structure was, the greater in differences was. Cluster analysis showed that the bacterial co mmunity structure of bottom pit muds from Erlang, Xijiu and Maotai, which were closer to each other, was similar, with Aminicenantes, Chloroflexi, and Proteobacteria being predominant. However, the bacterial flora of bottom pit mud from a liquor producer in Luzhou was dominated by Firmicutes, which was significantly different from that of bottom pit mud from the above three regions. Correlation analysis showed that available K, pH, and moisture content were the main factors that had significant effects on the structure and diversity of bacterial community in bottom pit muds, especially for Aminicenantes, Firmicutes, Actinobacteria, and Armatimonadetes.

high-throughput sequencing; bacterial diversity; Maotai-flavor liquor

10.7506/spkx1002-6630-201710015

TS261.1

A

1002-6630（2017）10-0087-05

蔡雪梅, 蔣英麗, 吳聯(lián)海, 等. 不同區(qū)域醬香型白酒人工窖底泥細(xì)菌多樣性及其影響因子[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 87-91. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710015. http://www.spkx.net.cn

CAI Xuemei, JIANG Yingli, WU Lianhai, et al. Diversity of bacteria and its influencing factors in bottom pit mud from artificial cellars used for the production Maotai-flavor liquor in different regions[J]. Food Science, 2017, 38(10): 87-91. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710015. http://www.spkx.net.cn

2016-07-22

白酒質(zhì)量安全可追溯系統(tǒng)的發(fā)展現(xiàn)狀對策研究基金項(xiàng)目（2015ZR0181）；四川省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)品專項(xiàng)（2015GZX0079）

蔡雪梅（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：cxm121517@163.com

*通信作者：羅愛民（1971—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：599159632@qq.com