喬超超，王新俠，李鶴賓，倪 輝，肖安風(fēng)，朱艷冰,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023）

Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩(wěn)定性提高突變體的篩選及鑒定

喬超超1，王新俠1，李鶴賓2，倪 輝1，肖安風(fēng)1，朱艷冰1,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361023）

利用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)引入隨機(jī)誘變，構(gòu)建一個(gè)Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫。經(jīng)過篩選，獲得一個(gè)芳香基硫酸酯酶熱穩(wěn)定性提高的突變株4-153。序列分析表明，該突變體有2 個(gè)氨基酸替換，包括D84A和H260L。以對(duì)硝基苯硫酸鉀為底物，突變酶4-153（M4-153）的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在45、50、55、60 ℃處理30 min后，M4-153分別保留85%、83%、48%和13%的殘留酶活力。野生型酶（WT）在45、50、55、60 ℃處理30 min后，分別保留79%、68%、21%和1%的殘留酶活力。M4-153與WT相比具有更好的熱穩(wěn)定性。M4-153的最適反應(yīng)pH值為8.0，在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。EDTA對(duì)突變酶的抑制作用表明，金屬離子在突變酶的催化過程中起重要作用。M4-153對(duì)一些洗滌劑，包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps，有好的耐受性。M4-153對(duì)龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)的脫硫率為79.5%。

芳香基硫酸酯酶；易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；熱穩(wěn)定性提高；突變體性質(zhì)

瓊脂是構(gòu)成紅藻細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖，由瓊脂糖和硫瓊膠組成[1]。瓊脂糖是由（1-3）-β-D-半乳糖和（1-4）-3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖相互交替連接而成的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)[1]。硫瓊膠的結(jié)構(gòu)與瓊脂糖基本相同，主要差別是替換了半乳糖殘基C6位置上的羥基，以硫酸基、甲氧基等基團(tuán)進(jìn)行替代[1]。瓊脂的凝膠過程主要是由糖殘基的相互交聯(lián)作用所導(dǎo)致，交聯(lián)越緊密，形成的瓊脂凝膠強(qiáng)度就越大，而硫瓊膠上具有的硫酸基等基團(tuán)會(huì)影響分子間的相互交聯(lián)作用，使得瓊脂凝膠強(qiáng)度降低[2]，瓊膠產(chǎn)品質(zhì)量下降。在瓊脂的工業(yè)生產(chǎn)中，脫除硫酸基團(tuán)是很重要的環(huán)節(jié)，最為廣泛的方法為堿法[3]。國(guó)內(nèi)外常用的堿法可分為3 種類型：低溫濃堿法、常溫濃堿法和高溫稀堿法[4]。這類方法工藝簡(jiǎn)單、操作方便，但是由于處理過程中大量強(qiáng)堿的使用，使得該方法有反應(yīng)難控制、產(chǎn)品得率低、膠質(zhì)易損失和環(huán)境污染嚴(yán)重等缺陷。很多研究者開始嘗試探索新的有效方法。芳香基硫酸酯酶能催化芳香基硫酸酯鍵的水解，生成芳基化合物和無機(jī)硫酸鹽[5]。芳香基硫酸酯酶具有廣泛的分布性，在真菌[6]、細(xì)菌[7]、海膽[8]、海藻[9]、蝸牛[10]、哺乳動(dòng)物[11]和人體[12]中都有分離得到。其中對(duì)一些微生物來源的芳香基硫酸酯酶，這包括從米曲霉[13]、肺炎克雷伯桿菌[14]、肺炎克雷伯菌[15]、海單胞菌[16]、交替假單孢菌[17]、銅綠假單胞菌[7,18]、鼠傷寒沙門氏菌[19]、黏質(zhì)沙雷氏菌[20]、鞘氨醇單胞菌[21]、鏈霉菌[22]和海棲熱袍菌[23]中得到的芳基硫酸酯酶進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)某些芳香基硫酸酯酶具有可裂解瓊脂上硫酸酯鍵的功能[5,16-17]。利用酶法去除硫酸基團(tuán)具有反應(yīng)條件溫和、易控制、硫酸基團(tuán)脫除率高，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。芳香基硫酸酯酶在瓊脂提取工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[24]。

來自Pseudoalteromonas carrageenovora的芳香基硫酸酯酶對(duì)對(duì)硝基苯硫酸鉀（potassium 4-nitrophenyl sulfate，p-NPS）有活性，以及有脫除瓊脂硫酸基團(tuán)的能力[17]。從P. carrageenovora分離得到的芳香基硫酸酯酶基因（984 bp）克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)45 ℃以上重組酶熱穩(wěn)定性不高。本研究以易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)定向進(jìn)化提高該酶的熱穩(wěn)定性，并研究突變酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coli BL21（DE3）、pET-28a質(zhì)粒由集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、rTaq酶、dNTPs TaKaRa公司；p-NPS 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙層全溫度恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；超聲細(xì)胞破碎儀 美國(guó)Sonics公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；蛋白電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；小型高速常溫離心機(jī)、蛋白核酸測(cè)定儀 德國(guó)Eppendorf公司；大型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；離子色譜 美國(guó)Dionex公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芳香基硫酸酯酶隨機(jī)突變體庫的構(gòu)建

P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶含有信號(hào)肽，其長(zhǎng)度為18 個(gè)氨基酸。在前期研究中，構(gòu)建了不含信號(hào)肽的芳香基硫酸酯酶基因（930 bp）重組質(zhì)粒pET-28a-ars。隨機(jī)突變體庫是基于易錯(cuò)PCR構(gòu)建。以重組質(zhì)粒pET-28aars為模板，使用上游引物ars-F（5’-CGCGGATCCTTT ACGTTTAACGGCAGC-3’）和下游引物ars-R（5’-CCC AAGCTTGCGTTTTAGTTCGTAAC-3’）（劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)）對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系為50 μL，其中包含5 μL 10×緩沖液、0.2 μmol/L引物、0.5 mmol/L dTTP、0.5 mmol/L dGTP、0.1 mmol/L dATP、0.1 mmol/L dCTP、1 U rTaq 聚合酶、7 mmol/L MgCl2、2 ng重組質(zhì)粒模板。熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min（35 次）；72 ℃ 10 min。BamHⅠ和HindⅢ消化后，PCR產(chǎn)物插入pET-28a（+）載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒突變文庫。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），生成突變文庫。

1.3.2 熱穩(wěn)定性提高突變株的篩選

將文庫的突變子涂布于LB固體培養(yǎng)基（含50 mg/mL卡那霉素和0.05 mmol/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG），37 ℃過夜培養(yǎng)后，根據(jù)產(chǎn)芳香基硫酸酯酶菌株水解底物p-NPS的顯色反應(yīng)來進(jìn)行突變文庫的初篩。含有菌株的平板經(jīng)過50 ℃處理2 h后，用含20 mmol/L p-NPS的軟瓊脂覆蓋，這時(shí)野生型菌株無顯色反應(yīng)，具有顯色反應(yīng)的菌落認(rèn)為是熱穩(wěn)定性提高的突變株。菌株過夜培養(yǎng)后，按1∶100（V/V）轉(zhuǎn)接到5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/mL卡那霉素）中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6，加入終濃度為0.05 mmol/mL IPTG，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)10 h。離心收集菌體，重懸于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，在冰浴條件下進(jìn)行超聲波破碎處理，10 000 r/min離心20 min獲得的上清液即為粗酶液。粗酶液在50 ℃處理2 h后，按下述1.3.5節(jié)的方法檢測(cè)酶的殘余活力，進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證。復(fù)篩后得到的熱穩(wěn)定性提高突變株，送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行基因測(cè)序分析。

1.3.3 重組酶的表達(dá)與純化

突變型和野生型菌株分別接種至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.5，然后加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L。在25 ℃孵育10 h后，誘導(dǎo)細(xì)胞通過6 000 r/min離心5 min收獲。純化帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，使用Ni Sepharose 6 Fast Flow在自然條件下進(jìn)行親和層析。純化后的蛋白用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[25]，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析純化的酶，并對(duì)其分子質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.3.4 芳香基硫酸酯酶的活性測(cè)定

根據(jù)Kim等[17]的方法稍作修改后，測(cè)定芳香基硫酸酯酶的活性（文中進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析使用的酶為純化后的酶，除非另有說明）。取80 μL用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（野生型使用pH 7.5，突變體使用pH 8.0）配制的20 mmol/L p-NPS底物溶液，加入20 μL酶液（400 ng），55 ℃孵育10 min后，加入25 μL 5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。在410 nm波長(zhǎng)處使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。在此條件下，每分鐘催化生成1 μmoL對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響

突變酶的最適反應(yīng)溫度在30～80 ℃的范圍內(nèi)測(cè)定。突變型與野生型酶的熱穩(wěn)定性在45、50、55、60 ℃下進(jìn)行。將酶在不同溫度條件下處理30 min后，測(cè)定酶的殘余活力，以未經(jīng)處理的酶活力作為100%。

1.3.6 pH值對(duì)突變酶活性的影響

將酶在pH3.0～10.0的緩沖液中于37 ℃放置 1 h后，測(cè)定酶的殘余活力。以未經(jīng)處理的酶活力定義為100%。測(cè)定使用的緩沖液為：50 mmol/L 磷酸二氫鈉-檸檬酸（pH 3.0～5.0）、50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0～9.0），50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0～10.0）。

1.3.7 金屬離子對(duì)突變酶活性的影響

在突變酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的不同金屬鹽離子，包括NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2、CuCl2、MnCl2、CoCl2和CdCl2。37 ℃條件下放置1 h后，測(cè)定酶的殘余活力，研究金屬離子對(duì)突變酶活性的影響。以未添加金屬離子的酶活力為100%。

1.3.8 抑制劑和洗滌劑對(duì)突變酶活性的影響

在突變型芳香基硫酸酯酶中分別添加終濃度為1 mmol/L或10 mmol/L的抑制劑（包括乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethano，β-ME）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyluoride，PMSF））、0.1%或1%去垢劑（包括Triton X-100、Tween 20、Tween 80、Chaps和SDS）。置于37 ℃條件下放置1 h后，測(cè)定酶的殘余活力，研究抑制劑和洗滌劑對(duì)突變酶活性的影響。以未添加抑制劑或去垢劑的酶活力為100%。

1.3.9 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

400 ng突變酶與不同濃度（0.1～3.0 mmol/L）p-NPS在最適條件下反應(yīng)10 min后，測(cè)定酶的活力。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到線性回歸方程，并分析計(jì)算酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（vmax）。

1.3.10 脫除龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)的研究

稱取0.1 g龍須菜粗多糖溶解于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中。分別加入60 U和90 U的野生型或突變型酶，45 ℃條件下處理4 h。將處理后的混合溶液置于尼龍布上，用超純水充分洗滌后，烘干粉碎。稱取等質(zhì)量的經(jīng)過酶處理后與未處理的龍須菜粗多糖，高溫碳化后，置于馬弗爐中550 ℃灰化4 h，將所得灰分全部溶于超純水中，定容至25 mL。取1 mL溶液用0.22 μm的膜過濾后，利用ICS-2100離子色譜測(cè)定樣品的硫酸基團(tuán)含量。以未經(jīng)酶處理的粗多糖為對(duì)照，根據(jù)以下公式計(jì)算脫硫率：

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香基硫酸酯酶隨機(jī)突變體庫的構(gòu)建與篩選

芳香基硫酸酯酶基因利用易錯(cuò)PCR技術(shù)引入隨機(jī)誘變，庫容量約為2.0×105。經(jīng)過兩步篩選，發(fā)現(xiàn)突變體4-153與野生型相比熱穩(wěn)定性提高?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，野生型與突變型酶基因相比有3 個(gè)堿基被替換，導(dǎo)致4-153有2 個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變，分別為D84A和H260L（野生型和突變型芳香基硫酸酯酶4-153分別命名為WT和M4-153）。突變酶4-153被選定做進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.2 突變型和野生型酶的表達(dá)與純化

經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，分別對(duì)重組的WT和M4-153進(jìn)行純化。對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示，突變后的芳香基硫酸酯酶大小與野生型一致，并測(cè)得WT和M4-153的酶活力分別為11.3、7.8 U/mg。

圖 1 芳香基硫酸酯酶在大腸桿菌中的表達(dá)Fig. 1 Expression of the arylsulfatase genes in E. coli

2.3 溫度對(duì)芳香基硫酸酯酶的影響

圖 2 溫度對(duì)M4-153和WT的影響Fig. 2 Effect of temperature on the activity of M4-153 and WT

M4-153的最適溫度在30～80 ℃內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。如圖2所示，M4-153和WT的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在45～60 ℃溫度范圍內(nèi)仍可以保持超過80%活性（圖2A）。熱穩(wěn)定性分析顯示，在45、50、55、60 ℃條件下處理30 min后，M4-153分別保留了85%、83%、48%、13%的殘余活性，而WT在45、50、55、60 ℃處理30 min后，分別保留了79%、68%、21%、1%的殘余活性（圖2B）。以上結(jié)果表明，突變酶M4-153比野生型酶WT具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.4 pH值對(duì)突變酶活性的影響

芳香基硫酸酯酶M4-153和WT的最適pH值在5.0～10.0的范圍內(nèi)測(cè)定，結(jié)果如圖3A所示，M4-153的最適pH值為8.0，WT的最適pH值為7.5。當(dāng)pH值低于6.5或高于9.5，M4-153和WT的酶活性急劇降低。pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，M4-153在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上，而WT在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，在37 ℃放置1 h后仍能保留其原活性的60%以上（圖3B）。

圖 3 pH值對(duì)M4-153和WT活性和穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of pH on the activity and stability of M4-153 and WT

2.5 金屬離子對(duì)突變酶活性的影響

表 1 金屬離子對(duì)突變酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on mutant arylsulfatase activity

由表1可知，K+對(duì)突變芳香基硫酸酯酶活力沒有顯著的影響，而Mg2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+會(huì)抑制酶的活性，濃度越高抑制越明顯，Zn2+和高濃度的Cu2+會(huì)導(dǎo)致酶完全失活。Ca2+對(duì)突變酶的活力有一定的促進(jìn)作用。1 mmol/L的Na+和Mn2+對(duì)酶活力沒有影響，而10 mmol/L的Na+、和Mn2+對(duì)酶活力具有促進(jìn)作用。Co2+在1 mmol/L對(duì)酶活性有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度增大到10 mmol/L時(shí)會(huì)稍微抑制酶活力。

2.6 抑制劑和去垢劑對(duì)突變酶活性的影響

表 2 抑制劑和去垢劑對(duì)突變酶的影響Table 2 Effects of inhibitors and detergents on mutant arylsulfatase activity

由表2可知，抑制劑EDTA、β-ME和DTT都對(duì)酶活力有抑制作用，其中最明顯的是EDTA，使得芳香基硫酸酯酶失去超過70%的酶活力。PMSF對(duì)酶活性沒有強(qiáng)烈的抑制效果，在濃度為10 mmol/L時(shí)，芳香基硫酸酯酶仍可保留89.7%的相對(duì)酶活力。去垢劑SDS和1%的Chaps對(duì)酶活力有抑制作用,其中SDS抑制效果顯著，在加入1%的SDS時(shí)，芳香基硫酸酯酶失去近70%的酶活力。突變酶對(duì)Triton X-100、Tween 20和Tween 80有良好的抗性。

2.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以p-NPS為底物，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法做圖，計(jì)算突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。M4-153的Km和vmax值分別為0.73 mmol/L和12.21 μmol/（mg·min）。

2.8 脫除龍須菜粗多糖的硫酸基團(tuán)

由表3可知，在45 ℃條件下處理4 h的條件下，隨著加酶量的增多，龍須菜粗多糖被脫除的硫酸基團(tuán)就越多。當(dāng)加酶量為90 U時(shí)，M4-153能脫除79.5%的硫酸基團(tuán)，而野生型脫除率為76.3%。

表 3 突變型和野生型芳香基硫酸酯酶對(duì)龍須菜粗多糖硫酸基團(tuán)的脫除Table 3 Effects of enzymatic treatment with purified mutant and wide-type arylsulfatases on the desulfuration efficiency of crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis

3 討 論

定向進(jìn)化是一種提高酶熱穩(wěn)定性、底物特異性等的有效方法?；谝族e(cuò)PCR的定向進(jìn)化方法，由于簡(jiǎn)單易行而被廣泛應(yīng)用[26-27]。本研究利用易錯(cuò)PCR方法構(gòu)建了一個(gè)P. carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變體庫，并篩選得到熱穩(wěn)定性提高的突變酶M4-153。

瓊脂是典型的熱融性分子，需要加熱以成為液體狀態(tài)，它的融解溫度為43 ℃，溫度保持在45 ℃以上時(shí)不會(huì)形成凝膠。因此，水解瓊脂硫酸基團(tuán)的酶在45 ℃以上保持穩(wěn)定才能在工業(yè)應(yīng)用上有良好的前景。本研究中，突變酶的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果顯示，酶在高于45 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性提高。在相同的條件下，M4-153對(duì)龍須菜瓊脂硫酸基團(tuán)的脫硫率高于WT，并且M4-153在pH 5.0～9.0范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，這些提高了突變酶的工業(yè)應(yīng)用前景。

EDTA對(duì)M4-153的酶活性有較強(qiáng)的抑制效果，這表明金屬離子在酶的催化過程中起主要作用。SDS對(duì)酶活力也有著抑制作用，推測(cè)是由于SDS與芳香基硫酸酯酶的疏水性氨基酸殘基上的烷基結(jié)合并造成影響，來自Marinomonas sp. FW-1的芳香基硫酸酯酶也有著相似的結(jié)果[16]。M4-153在一些洗滌劑的存在下仍然保持相對(duì)穩(wěn)定，如Triton X-100、Tween 20、Tween 80和Chaps，這些性質(zhì)提高了該突變酶在工業(yè)利用過程中的潛在價(jià)值。

硫酸基含量是瓊脂的一個(gè)重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[28]，芳香基硫酸酯酶是一種可在溫和條件下進(jìn)行瓊脂脫硫的理想候選酶。本研究中當(dāng)突變酶M4-153的加酶量達(dá)90 U，在45 ℃處理4 h后，龍須菜粗多糖硫酸基含量下降了79.5%，該突變芳香基硫酸酯酶是瓊脂脫硫應(yīng)用中的潛在催化劑。

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Screening and Characterization of Mutant with Improved Thermostability from a Random Mutant Library of Pseudoalteromonas carrageenovora Arylsulfatase

QIAO Chaochao1, WANG Xinxia1, LI Hebin2, NI Hui1, XIAO Anfeng1, ZHU Yanbing1,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Department of Pharmacy, Xiamen Medical College, Xiamen 361023, China)

A library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase mutants was constructed by random mutagenesis using error-prone PCR. After screening, one mutant strain named 4-153 was obtained whose arylsulfatase had improved thermal stability. It was found that there were two amino acid substitutions in the mutant, including D84A and H260L. When p-nitrophenyl sulfate was used as a substrate, the optimal reaction temperature for the mutant enzyme was 55 ℃. Mutant arylsulfatase 4-153 (M4-153) retained 85%, 83%, 48%, and 13% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃for 30 min, respectively. Meanwhile, wild-type arylsulfatase (WT) retained 79%, 68%, 21%, and 1% of its initial activity after incubation at 45, 50, 55 and 60 ℃ for 30 min, respectively. These results showed that M4-153 had a better thermal stability than WT. M4-153 had an optimum pH of 8.0, and it was stable over the pH range of 5.09.0. Inhibition assay with EDTA indicated that metal ions played an important role in the catalytic process of the mutant enzyme. The recombinant arylsulfatase 4-153 showed a relatively strong tolerance to some detected detergents including Triton X-100, Tween 20, Tween 80, and Chaps. The desulfuration ratio of the crude polysaccharides from Gracilaria lemaneiformis by M4-153 was 79.5%.

arylesterase; error-prone PCR; improved thermostability; mutant property

10.7506/spkx1002-6630-201710004

Q814.9

A

1002-6630（2017）10-0018-06

喬超超, 王新俠, 李鶴賓, 等. Pseudoalteromonas carrageenovora芳香基硫酸酯酶突變文庫熱穩(wěn)定性提高突變體的篩選及鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 18-23. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

QIAO Chaochao, WANG Xinxia, LI Hebin, et al. Screening and characterization of mutant with improved thermostability from a random mutant library of Pseudoalteromonas carrageenovora arylsulfatase[J]. Food Science, 2017, 38(10): 18-23. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710004. http://www.spkx.net.cn

2016-09-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401632）；福建省高校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（B15139）

喬超超（1991—），男，碩士研究生，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：451028523@qq.com

*通信作者：朱艷冰（1976—），女，副教授，博士，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：yanbingzhu@163.com