吳紅靜，曹冬梅，許 楊,，付金衡，涂 追,*

抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機(jī)突變與篩選

吳紅靜1,2，曹冬梅1，許 楊1,3，付金衡3，涂 追1,*

（ 1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330029；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

采用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，對(duì)來源于天然納米抗體文庫(kù)的抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）納米抗體進(jìn)行隨機(jī)突變，通過優(yōu)化和比較突變條件，構(gòu)建了突變分布均勻的突變文庫(kù)。噬菌體展示技術(shù)對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行了6 輪篩選，獲得了8 種突變序列，其檢測(cè)信號(hào)為野生型2.1 倍。多序列比對(duì)及三維結(jié)構(gòu)建模分析表明，突變序列的突變位點(diǎn)集中于互補(bǔ)決定區(qū)與框架區(qū)連接的區(qū)域，并且部分序列出現(xiàn)了可以形成二硫鍵的氨基酸殘基。研究結(jié)果為抗DON納米抗體進(jìn)一步的深度突變和改造提供了線索，同時(shí)可為其他抗小分子納米抗體的改造提供借鑒。

納米抗體；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；噬菌體展示

納米抗體是由天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavychain antibodies，HCAbs）可變區(qū)構(gòu)成，又稱為VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain）抗體[1]。納米抗體具有分子質(zhì)量小、易于表達(dá)以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、診斷及食品安全等領(lǐng)域[2-5]。近年來，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，納米抗體已成功用于抗原模擬、傳統(tǒng)抗體替代等方面的應(yīng)用[6-9]。雖然如此，目前針對(duì)小分子的高親和力納米抗體報(bào)道較少，有學(xué)者指出基于納米抗體本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，動(dòng)物免疫系統(tǒng)可能并不適合產(chǎn)生高親和力的抗小分子納米抗體[10]。因此，采用體外突變和分子改造技術(shù)可為提高納米抗體的親和力、穩(wěn)定性等特性提供有效途徑[11-14]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）屬于B類單端孢霉烯族真菌毒素，是一種由真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[15]。前期研究從天然納米抗體噬菌體展示文庫(kù)中篩選獲得了可特異結(jié)合DON的納米抗體，命名為DONIV2[16]。本研究采用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（error prone polymerase chain reaction，epPCR）對(duì)DONIV2進(jìn)行隨機(jī)突變，通過噬菌體展示技術(shù)對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行淘選，比較突變序列氨基酸殘基變化以及突變位點(diǎn)三維結(jié)構(gòu)的位置，分析抗DON納米抗體與DON相互作用的機(jī)制和特點(diǎn)，為定向改造研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）TG1，含有抗DON納米抗體編碼基因的質(zhì)粒pRX2-DONIV2，噬菌粒pHEN1和輔助噬菌體KM13均為實(shí)驗(yàn)室保藏[16]。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、TA克隆載體（pMD18-T）及各種DNA試劑盒 TaKaRa公司；T4連接酶 New England Biolab公司；酵母膏、蛋白胨英國(guó)Oxoid公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13單克隆抗體（HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate） 美國(guó)GE Healthcare公司；氨芐青霉素、卡那霉素、四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、脫脂乳 上海生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物

表 1 隨機(jī)突變及鑒定所用的引物Table 1 Primers used for epPCR

隨機(jī)突變以及突變文庫(kù)鑒定所用的引物見表1。引物T7prom和T7term為載體pRX2的通用引物，分別位于抗DON納米抗體編碼基因兩側(cè)；引物M13和pHEN-R為載體pHEN1通用引物。PCR引物合成和DNA測(cè)序委托上海英俊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR

常規(guī)PCR體系（25 μL）中含有模板DNA（pRX2-DONIV2）10 ng、引物各10 pmol、10×PCR緩沖液（不含Mg2+）、TritonX-100 0.01%、MgCl21.5 mmol/L、dNTP各0.16 mmol/L、Taq聚合酶1.25 U。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

易錯(cuò)PCR體系在常規(guī)PCR體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行，擴(kuò)增條件相同，對(duì)Mg2+濃度、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。單因素優(yōu)化后的條件下，設(shè)置Ⅰ和Ⅱ兩組不同的dNTP濃度，Ⅰ組的4 種dNTP濃度均為0.16 mmol/L，Ⅱ組dATP和dGTP濃度均為0.16 mmol/L、dTTP和dCTP濃度均為1 mmol/L。

Ⅰ和Ⅱ兩組易錯(cuò)PCR條件下的產(chǎn)物分別以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，然后按照TA克隆試劑盒說明，分別將兩種純化的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，分別隨機(jī)挑選10 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。對(duì)兩組易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的突變位點(diǎn)、突變率以及突變類型等指標(biāo)進(jìn)行比較分析，選擇適當(dāng)突變率、突變分布均勻的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物構(gòu)建文庫(kù)。

1.2.2 易錯(cuò)PCR文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與噬菌粒pHEN1分別用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以物質(zhì)的量比3∶1，16 ℃條件下過夜連接。連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10 μL無菌水，電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化，按照參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。取10 μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)板，計(jì)算庫(kù)容。其余部分全部涂布于24 cm×24 cm LB（含100 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)板，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)16 h。用5 mL LB培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終含量25%甘油，分裝，－80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。從?jì)算庫(kù)容的平板上隨機(jī)挑取10 個(gè)克隆，采用通用引物M13-R和pHEN-R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，計(jì)算有效庫(kù)容量。

接種至少10 倍庫(kù)容量的活細(xì)胞于5 mL的LB（含2%葡萄糖，100 μg/mL氨芐青霉素），30 ℃、220 r/min振搖培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃、220 r/min振搖培養(yǎng)60 min。將培養(yǎng)物離心，用50 mL LB（含100 μg/mL 氨芐青霉素、50 μg/mL卡那霉素）重懸沉淀，30 ℃、220 r/min振搖培養(yǎng)過夜后，3 000×g離心取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)的聚乙二醇/NaCl法純化噬菌體[18]，即得到噬菌體抗體文庫(kù)，取10 μL測(cè)定滴度，其余分裝于－80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 噬菌體擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定

[18]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 易錯(cuò)PCR文庫(kù)的淘選

以甲基化牛血清白蛋白（methylated BSA，MBSA）為載體，參考文獻(xiàn)[17]制備DON人工抗原DON-MBSA。采用競(jìng)爭(zhēng)洗脫法對(duì)突變文庫(kù)進(jìn)行淘選，方法參見文獻(xiàn)[19]，人工抗原DON-MBSA（100 μg/mL）包被酶標(biāo)板，每輪3% BSA和3% OVA交替封閉，競(jìng)爭(zhēng)洗脫采用50 ng/mL的DON溶液孵育1 h。

1.2.5 間接phage-ELISA

采用phage-ELISA法對(duì)淘選后的克隆進(jìn)行親和力鑒定[20]。酶標(biāo)板中包被磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋的人工抗原DON-MBSA（1 μg/mL），3%脫脂乳封閉后，分別加入淘選后的噬菌體克隆和未突變的原始噬菌體克隆DONIV2，PBST（含0.5%吐溫20的PBS溶液）洗板后，以HRP/Anti-M13（用3%脫脂乳，按1∶5 000（V/V）稀釋）檢測(cè)吸附的噬菌體。

1.2.6 三維結(jié)構(gòu)模擬與對(duì)比

采用I-TASSER4.4軟件建立納米抗體的三維結(jié)構(gòu)[21-22]。預(yù)測(cè)結(jié)果采用軟件UCSF Chimera進(jìn)行顯示和編輯[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 易錯(cuò)PCR條件的優(yōu)化

圖 1 不同Mg2＋濃度條件下易錯(cuò)PCR電泳圖Fig. 1 Effects of Mg2+concentration on the epPCR

為了獲得隨機(jī)突變的編碼基因，同時(shí)保證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量，在普通PCR的基礎(chǔ)上，首先對(duì)Mg2+、Mn2+濃度、TritonX-100濃度進(jìn)行了單因素優(yōu)化試驗(yàn)。如圖1所示，隨著Mg2+濃度的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度下降，當(dāng)Mg2+濃度大于6 mmol/L時(shí)，凝膠電泳未檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。高濃度的Mg2+能穩(wěn)定錯(cuò)配的堿基對(duì)，因此選擇較高的Mg2+濃度6 mmol/L。

圖 2 不同Mn2＋濃度條件下易錯(cuò)PCR電泳圖Fig. 2 Effects of Mn2+concentration on the epPCR

反應(yīng)體系中加入Mn2+可以降低聚合酶對(duì)模板的特異性，提高錯(cuò)配率。Mn2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2所示，當(dāng)Mn2+濃度降至0.2 mmol/L時(shí)，凝膠電泳出現(xiàn)特異性目的條帶，選擇Mn2+適宜濃度為0.2 mmol/L。

圖 3 不同TritonX-100體積分?jǐn)?shù)條件下易錯(cuò)PCR電泳圖Fig. 3 Effects of TritonX-100 concentration on the epPCR

反應(yīng)體系中TritonX-100體積分?jǐn)?shù)對(duì)易錯(cuò)PCR的影響結(jié)果如圖3所示，PCR產(chǎn)物的量隨著TritonX-100體積的提高而增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.04%時(shí)，PCR產(chǎn)物產(chǎn)量最大（泳道4）。

2.1.2 易錯(cuò)PCR產(chǎn)物突變分析

表 2 突變產(chǎn)物序列分析Table 2 Mutation spectrum of random mutagenesis

分別隨機(jī)挑取10 個(gè)兩組不同dNTP組分條件下的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，突變條件Ⅰ的總突變率為1.16%，突變條件Ⅱ的總突變率為0.86%，發(fā)生的突變絕大多數(shù)為點(diǎn)突變，缺失和插入較少（表2）。突變條件Ⅱ的轉(zhuǎn)換比例（A∶T→G∶C/G∶C→A∶T）較突變條件Ⅰ小，即轉(zhuǎn)換的偏好性更低，同時(shí)條件Ⅱ產(chǎn)物突變點(diǎn)的分布比條件Ⅰ突變點(diǎn)的分布更為均勻，綜合考慮，采用突變條件Ⅱ的產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，平均每個(gè)克隆突變3～4 個(gè)核苷酸位點(diǎn)。

2.2 隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建、淘選與鑒定

2.2.1 文庫(kù)的構(gòu)建與淘選

將易錯(cuò)PCR產(chǎn)物用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切，凝膠電泳回收純化，連接至噬菌粒載體pHEN1，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，獲得約6×106個(gè)獨(dú)立克隆，輔助噬菌體救援后得到噬菌體展示文庫(kù)滴度約為2.7×1013CFU/mL。

圖 4 間接phage-ELISA測(cè)定每輪擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 4 Indirect phage-ELISA of amplified phages from each round of panning

采用固相篩選的方法，對(duì)隨機(jī)突變文庫(kù)進(jìn)行了6 輪篩選，phage-ELISA檢測(cè)擴(kuò)增后的每輪競(jìng)爭(zhēng)洗脫物，結(jié)果顯示在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，OD450nm隨著淘選的進(jìn)行而升高，提示親和力提高的突變得到了富集（圖4）。

2.2.2 phage-ELISA鑒定陽性克隆

圖 5 陽性克隆多序列比對(duì)結(jié)果Fig. 5 Multi-sequence alignment of mutants

從第6輪淘選競(jìng)爭(zhēng)洗脫產(chǎn)物測(cè)定滴度的平板上，隨機(jī)挑取96 個(gè)克隆，經(jīng)輔助噬菌體救援后，進(jìn)行phage-ELISA檢測(cè)。以未突變的野生型克隆DONIV2作為對(duì)照，設(shè)置OD450nm為對(duì)照的2.1 倍為陽性標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定的96 個(gè)克隆中，共有30 個(gè)克隆為陽性，陽性率達(dá)31.3%。陽性克隆測(cè)序分析結(jié)果顯示，共獲得了8 條不同的突變序列（圖5）。

2.3 三維結(jié)構(gòu)模擬與分析

圖 6 抗DON納米抗體三維結(jié)構(gòu)模擬與對(duì)比Fig. 6 Three-dimensional structure modeling

采用蛋白建模軟件I-TASSER4.4，對(duì)突變前野生型抗DON納米抗體DONIV2和2 個(gè)出現(xiàn)頻率最高的突變子6A-B5和6A-D12進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果如圖6A～C所示。通過結(jié)構(gòu)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，突變子的CDR3區(qū)域的結(jié)構(gòu)與突變前的CDR3區(qū)域結(jié)構(gòu)差異較大，其他部分主鏈結(jié)構(gòu)基本一致（圖6D）。

3 結(jié) 論

突變方法及反應(yīng)條件對(duì)目的序列的突變率、突變位點(diǎn)等結(jié)果具有明顯的影響。Rasila等[24]對(duì)易錯(cuò)PCR、化學(xué)突變和高突變菌株3 種突變方法的效果進(jìn)行了詳細(xì)的比較研究，發(fā)現(xiàn)易錯(cuò)PCR的突變率高和突變范圍更廣。本研究對(duì)易錯(cuò)PCR突變的條件進(jìn)行了優(yōu)化和比較，選擇突變率適宜、突變位點(diǎn)分布均勻的突變條件，為鑒定影響結(jié)合活性的關(guān)鍵區(qū)域提供了基礎(chǔ)。

通過比較突變前后氨基酸序列的變化，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)明顯集中在CDR與FR連接的區(qū)域（圖5），而CDR形成loop結(jié)構(gòu)的位置發(fā)生突變較少，說明抗原結(jié)合表位可能直接由CDR-loop組成，這與分子對(duì)接結(jié)果吻合[25]。Min等[12]通過酵母展示系統(tǒng)對(duì)抗黃曲霉毒素B1的親和力成熟的研究中，也發(fā)現(xiàn)大多數(shù)發(fā)生突變的位點(diǎn)不在CDR區(qū)域。值得注意的是，部分突變子（6A-D12和6A-H8）同時(shí)突變得到2 個(gè)半胱氨酸殘基，三維結(jié)構(gòu)模型顯示，2 個(gè)半胱氨酸殘基空間位置相鄰（圖6C），可形成新的二硫鍵，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，提示在蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)和改造中，引入二硫鍵有利于穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)。

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Random Mutation and Mutant Screening of Anti-Deoxynivalenol Nanobody

WU Hongjing1,2, CAO Dongmei1, XU Yang1,3, FU Jinheng3, TU Zhui1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. College of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China; 3. Jiangxi-OAI Joint Research Institution, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In this work, an anti-deoxynivalenol nanobody isolated from a naive phage display library was adopted to investigate the relationship between bioactivity and the composition of amino acid residues using error prone polymerase chain reaction (epPCR) and phage display. The epPCR was firstly optimized to produce a phage display library with balanced distribution of mutation. After six rounds of panning of the mutant library, 30 out of 96 picked clones exhibited 8 different mutations, whose signal was 2.1 folds higher than that of the wild-type clone. Multi-sequence alignment analysis showed that mutant sites were prone to be found in the junction region between complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FRs). Three-dimensional structure modeling results indicated that some mutants were capable of forming an intramolecular disulphide bond, which benefits to stabilize the molecular structure. These data can provide a clue for further mutation and modification of anti-deoxynivalenol nanobody and also provide a guideline for the design of nanobody recognizing other low molecular weight compounds.

nanobody; deoxynivalenol; error prone PCR; phage display

10.7506/spkx1002-6630-201710001

TS201.6

A

1002-6630（2017）10-0001-05

吳紅靜, 曹冬梅, 許楊, 等. 抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇納米抗體隨機(jī)突變與篩選[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

WU Hongjing, CAO Dongmei, XU Yang, et al. Random mutation and mutant screening of anti-deoxynivalenol nanobody[J]. Food Science, 2017, 38(10): 1-5. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201710001. http://www.spkx.net.cn

2016-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301479）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（GJJ151502）；南昌大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013-ZR-05）

吳紅靜（1981—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c營(yíng)養(yǎng)。E-mail：51531843@qq.com

*通信作者：涂追（1982—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c生物技術(shù)。E-mail：tuzhui@ncu.edu.cn