王玉玲福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

豬偽狂犬病病毒高免血清的制備及應(yīng)用

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用偽狂犬病病毒及抗體陰性羊，以不同免疫劑量，間隔一定時間，多次免疫不同類型的豬偽狂犬病病毒（Bartha-K61株），制備豬偽狂犬病病毒高免血清，特異性強，效價可達1:2 048以上。本研究為偽狂犬病活疫苗或毒種的鑒定及外源病毒檢驗提供了具有良好特異性和高效價的中和用血清。

豬偽狂犬病病毒高免血清ELISA中和試驗外源病毒檢驗

偽狂犬?。ˋujeszky's Disease）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus PRV）引起多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要特征的一種重要傳染病。該病自1902年發(fā)現(xiàn)以來，已在全球范圍內(nèi)流行。中國自1947首次報道以來，目前已擴大到全國各地，隱性感染、臨床發(fā)病及混合感染日趨嚴(yán)重，每年因為該病造成巨大經(jīng)濟損失。進行疫苗接種是預(yù)防、控制甚至消滅偽狂犬病最主要的措施之一。

根據(jù)《中國獸藥典》三部（二〇一〇年版）規(guī)定，偽狂犬病活疫苗或毒種必須進行外源病毒檢驗，此項檢驗需用抗PRV特異性血清對樣品進行中和。因此，抗血清的中和效價和特異性對檢驗起著至關(guān)重要的作用。由于市場上缺乏能夠滿足獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)檢驗需求的偽狂犬病特異性抗血清，因此，本研究優(yōu)化了免疫條件，利用偽狂犬病活疫苗進行基礎(chǔ)免疫，并用偽狂犬病滅活疫苗進行加強免疫，對所收集的血清進行純凈性、中和效價和中和能力進行鑒定，從而制備了一批特異性較強的抗PRV高免血清，為開展偽狂犬病活疫苗或毒種的外源病毒檢驗提供了物質(zhì)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫抗原豬偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株，效價為105.5TCID50/頭份），由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。豬偽狂犬病滅活疫苗（Bartha-

K61株，滅活前病毒含量為106.5TCID50/0.1 mL），由試驗組自制。

1.1.2 試驗動物5只健康豚鼠（350~400 g）；選取10只3~6月齡健康山羊，采血，進行細胞中和試驗和ELISA檢測，確定偽狂犬病病毒及抗體均為陰性，且羊類相關(guān)抗原及抗體均為陰性。

1.1.3 試驗儀器和試劑Marc-145細胞、PK15、ST細胞和Vero細胞等由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司質(zhì)檢部提供；SPF蛋購自濟南斯帕法斯；羊痘、小反芻獸疫病毒，藍舌病、口蹄疫等ELISA抗體檢測試劑盒購自美國BD公司；BVDV間接免疫熒光檢測試劑盒，PPV間接免疫熒光檢測試劑盒，CSFV間接免疫熒光檢測試劑盒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；BVDV抗體檢測試劑盒購自韓國金諾公司；偽狂犬病抗體檢測試劑盒（gE、gB）購自IDEXX公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序?qū)徣肷窖蜻M行采血，采用細胞法進行偽狂犬病病毒檢測為陰性，用細胞中和法和ELISA測定偽狂犬病抗體為陰性，觀察1周進行采血作為陰性對照。將10只羊分為2組，5只/組，具體接毒過程和間隔時間見表1。

1.2.2 高免血清的制備和安全性試驗當(dāng)用ELISA方法檢測血清抗體效價達到要求(1:2 048)時，對山羊進行無菌采血，采得的血液均用自然凝結(jié)法分離血清，56℃滅活30 min后，少量分裝并標(biāo)記后-40℃保存?zhèn)溆?。將自制血清樣品，分別給5只健康豚鼠進行皮下注射1 mL，觀察豚鼠反應(yīng)。

1.2.3 純凈性檢驗根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》及《中國生物制品檢驗規(guī)程》進行無菌檢驗、支原體檢驗、內(nèi)毒素檢驗、外源病毒檢驗。

1.2.4 高免血清效價測定

1.2.4.1 細胞法測定將血清按2倍倍比稀釋，將工作抗原用M199稀釋成100TCID50/0.1 mL的偽狂犬病病毒液與各稀釋度血清樣品等量混合，搖勻后在37℃中和1 h，其間振搖3次。同時設(shè)正常細胞組、工作抗原100TCID50/0.1 mL濃度加等量Hank's液的病毒對照組，中和結(jié)束分別接種雞胚成纖維細胞，每個稀釋度5孔（96孔板），每孔0.2 mL，37℃溫箱中孵育1 h后棄去上清液，加入含1%NBS的M199營養(yǎng)液，0.2 mL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5 d，觀察細胞病變情況，計算血清中和效價。

1.2.4.2ELISA方法測定取最終所采血清按2倍倍比稀釋，后根據(jù)偽狂犬病病毒抗體檢測試劑盒操作說明進行操作，測定OD值，計算血清中和效價。

1.2.5 初步應(yīng)用按照《中國獸藥典》三部(二〇一五年版)，應(yīng)用本研究制備的抗PRV高免血清，進行PRV種毒中和試驗和偽狂犬病活疫苗外源病毒檢驗。

1.2.5.1PRV種毒中和試驗取效價為106.5TCID50/ 0.1 mL的種毒，將不同量的血清樣品（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL）分別與0.1 mL病毒液混合，37℃中和1 h，分別接種雞胚成纖維細胞，觀察7 d，觀察細胞病變情況，如無病變將細胞瓶反復(fù)凍融后進行繼代，三次繼代均無病變，則判定為中和完全。

1.2.5.23 批偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）外源病毒檢驗取3批偽狂犬病活疫苗分別稀釋成10頭份/2 mL，12 000 r/min降溫離心15 min后取上清，將不同量的血清樣品（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、 2.0 mL）按照病毒效價與病毒抗原混合，37℃中和1 h后接種T25的Vero細胞，ST細胞單層，每瓶接種血清和抗原混合液（保證抗原量為10頭份），37℃孵育1 h后，棄去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次后加入含2%NBS的DMEM培養(yǎng)液10 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況，5 d后取出細胞瓶置于-40℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min降溫離心5 min后取上清，進行繼代培養(yǎng)。5 d后-40℃反復(fù)凍融3次，離心取上清接種Vero細胞，ST細胞單層，進行第二次繼代培養(yǎng)，觀察細胞病變情況，經(jīng)3次培養(yǎng)如未發(fā)現(xiàn)細胞病變判定為中和完全。

2 結(jié)果

2.1 中和抗體效價測定

2.1.1 細胞中和法結(jié)果見表2。

表1 免疫程序

表2 細胞中和法測定中和抗體效價結(jié)果

2.1.2ELISA方法結(jié)果見表3。

從表2-表3可以看出，用細胞中和法和ELISA方法測定的抗體效價結(jié)果基本一致，且免疫方法B的免疫效果較方法A的免疫效果有明顯差異。說明采用活疫苗與滅活疫苗協(xié)同作用的效果較單獨使用滅活疫苗的免疫效果要好。

表3ELISA方法測定中和抗體情況

2.2 安全性檢驗血清注射豚鼠后觀察10 d，豚鼠均健康，無異常表現(xiàn)。

2.3 純凈性檢驗經(jīng)檢驗樣品中無細菌、霉菌、支原體生長，外源病毒檢驗結(jié)果為合格。

2.4 初步應(yīng)用

2.4.1PRV種毒中和試驗中和試驗結(jié)果表明，本研究制備的1 mL抗PRV血清可完全中和106.5TCID50的病毒。

2.4.23 批偽狂犬病活疫苗外源病毒檢驗3批疫苗樣品的外源病毒檢驗結(jié)果均為陰性，說明2 mL抗PRV血清完全可以中和10頭份效價≤106.0TCID50/頭份的疫苗樣品。結(jié)果見表4。

3 討論

表4 血清中和能力測定結(jié)果

按照《中國獸藥典》三部（二〇一〇年版）要求，豬偽狂犬病活疫苗或毒種必須進行外源病毒檢驗。外源病毒檢驗需使用一定量的血清與相當(dāng)于10頭份的豬偽狂犬病活疫苗或毒種進行中和，這要求抗血清應(yīng)具有良好的特異性和高效價。

本實驗室根據(jù)多次試驗的經(jīng)驗，優(yōu)化了免疫方法，最終制備了2 000 mL抗血清。按照《中國獸藥典》三部（二〇一〇年版）對血清進行了無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗，結(jié)果均符合規(guī)定，確保了血清的純凈性。

本研究在首次免疫前對使用的山羊進行了血清抗體篩查，確保無外源病毒感染。為了提高抗血清的中和效價，本研究采用活疫苗進行基礎(chǔ)免疫，然后用滅活疫苗間隔不同時間進行多次加強免疫，促使機體免疫系統(tǒng)持續(xù)產(chǎn)生高效價的抗體。血清中和效價最高可達1:4 096，1 mL中和抗體效價為1:2 048的血清可中和效價為106.6TCID50的偽狂犬病病毒。應(yīng)用于外源病毒檢驗時，3批疫苗樣品的病毒含量分別為105.2TCID50/頭份、105.5TCID50/頭份、106.0TCID50/頭份，2 mL抗PRV血清能夠完全中和10頭份效價≤106.0TCID50/頭份的疫苗樣品。

從試驗結(jié)果可以看出，采用本試驗的免疫方法可制備出高效價的豬偽狂犬病病毒高免血清，該血清完全滿足偽狂犬病活疫苗的外源病毒檢測的使用要求，同時該血清也完全可以用于各大豬場及研究機構(gòu)用于偽狂犬病病毒的檢測及抗原檢測試劑盒的研制。因此，本試驗的內(nèi)容具有較高的應(yīng)用價值。

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The preparation and application of porcine pseudorabies virus high immune serum

Wang Yuling
（Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

This study produced the pseudorabies virus(PRV)high immune serum by multi-incubated the pseudorabies antibody negative healthy goat with pseudorabies vaccine strain Bartha-K61 with different doses at certain intervals,and identified the high immune serum by neutralization test and ELISA.The results approved that the PRV high immune serum produced by this method is of high specification,the titer is not less than 1:2 048.Antiserum against PRV was prepared with high specificity and neutralization titer for the identify inspection and exogenous virus test of PR live vaccines and virus seeds．

Pseudorabies virus High immune serum ELISA Neutralization test Exogenous virus test

A

1003-4331（2017）03-0004-04