章秋月南平市星星畜牧有限公司福建南平353000

一例雛番鴨新型鴨呼腸孤病毒感染的診斷

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2017年1月，福建省南平市延平區(qū)某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的雛番鴨出現(xiàn)大面積死亡，死亡率約45%。死亡鴨見有角弓反張、運(yùn)動失調(diào)等癥狀。剖檢死亡雛番鴨見肝臟呈現(xiàn)大面積點(diǎn)狀、片狀不規(guī)則出血，且伴有壞死；脾臟見有明顯的脾壞死。結(jié)合臨床初步診斷為新型鴨呼腸孤病毒感染。采集病死雛番鴨的肝臟和脾臟，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定與新型鴨呼腸孤病毒RT-PCR檢測。結(jié)果表明，死亡雛番鴨細(xì)菌分離為陰性，RT-PCR試驗(yàn)可以特異性擴(kuò)增出約586 bp的新型鴨呼腸孤病毒特異性條帶，而經(jīng)典呼腸孤病毒和鴨肝炎病毒未見特異性目的條帶，確診雛番鴨感染新型鴨呼腸孤病毒。

雛番鴨新型鴨呼腸孤病毒細(xì)菌分離RT-PCR鑒定

番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）感染表現(xiàn)為典型的“花肝病”癥狀，肝臟出現(xiàn)明顯的灰白色斑樣病灶，病灶大小不一、邊緣無光澤。該病原在分類地位是屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬禽正呼腸孤病毒，在鴨群中主要以番鴨感染為主[1]，也見有半番鴨感染[2]，但其他品種鴨未見感染后出現(xiàn)明顯癥狀。經(jīng)過近些年對鴨群免疫由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所研制的“番鴨呼腸孤病毒活疫苗”[3]，番鴨感染MDRV的疫情已得到有效控制。

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染為近年來新發(fā)的鴨群傳染病，該病的臨床癥狀與20世紀(jì)末期暴發(fā)于我國番鴨群的番鴨呼腸孤病毒病相似。該病可感染多品種鴨，如番鴨、半番鴨、麻鴨、櫻桃谷鴨、北京鴨、白改鴨等常見鴨品種，表現(xiàn)為肝臟斑塊狀出血，并伴有壞死；脾臟有出血性壞死點(diǎn)（塊）[4]。由于該病的部分臨床癥狀與經(jīng)典番鴨呼腸孤病毒病、鴨肝炎類似，本文通過細(xì)菌分離鑒定、病毒RT-PCR鑒別診斷，明確為新型鴨呼腸孤病毒感染，現(xiàn)報到如下。

1 剖檢與病料采集

剖檢死亡的7 d雛番鴨，可見肝臟有大面積斑點(diǎn)狀、點(diǎn)狀出血（見圖1）。

圖1 肝臟斑點(diǎn)狀出血

自病死雛番鴨小心采集左側(cè)肝臟（用于細(xì)菌分離鑒定）；右側(cè)肝臟和脾臟，剪碎后，按照1:4比例加入滅菌生理鹽水，勻漿后反復(fù)凍融5次，6 000 r/min離心20 min，取上清備用。

2 細(xì)菌分離與鑒定

在無菌工作臺取肝臟后，在血平板進(jìn)行劃線，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

3RT-PCR檢測

3.1 試驗(yàn)試劑盒耗材病毒核酸RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DNA分子量Marker 2000均購自福建都拜特生物試劑公司，其他化學(xué)試劑盒和耗材均購自上海生工公司福建辦事處。

3.2 試驗(yàn)引物根據(jù)文獻(xiàn)報道的檢測經(jīng)典番鴨呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和新型鴨呼腸孤病毒的引物，分別在上海生工生物公司進(jìn)行引物合成，引物序列見表1。

3.3 病原的RT-PCR檢測取處理后的離心上清液200 uL，按照病毒核酸RNA提取試劑盒提取病毒的核酸RNA，利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行病原的RT-PCR檢測，反應(yīng)液為20 uL體系，其中RNA 2 uL、特異性的上下游引物（各病原檢測引物分別加入一個PCR反應(yīng)管，濃度為10 pmol）各1 uL、2*RT-PCR一步法反應(yīng)液10 uL、酶0.4 uL，補(bǔ)充PCR反應(yīng)水至20 uL。RT-PCR反應(yīng)條件為45℃逆轉(zhuǎn)錄25 min、95℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行PCR循環(huán)；循環(huán)35次，條件為94℃50 s、54℃30 s、72℃50 s；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸7 min。取5 uL反應(yīng)液進(jìn)行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳，觀察病原的RT-PCR檢測結(jié)果。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 細(xì)菌分離鑒定劃線后的血平板經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h，未見明顯菌落生長，可排除細(xì)菌感染。

4.2 病原的RT-PCR鑒定經(jīng)番鴨呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和新型鴨呼腸孤病毒的RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，僅針對新型鴨呼腸孤病毒的引物出現(xiàn)特異性的目的條帶（586 bp），見圖2。

將該特異性RT-PCR目的條帶送由上海生工進(jìn)行克隆測序，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列與新型鴨呼腸孤病毒NP03株[7]的核苷酸同源性為99.1%。根據(jù)發(fā)病情況、剖檢病變、細(xì)菌分離和RT-PCR鑒定，可確診該病例為新型鴨呼腸孤病毒感染。

圖2 病原的RT-PCR診斷（M:2000 Marker；1:新型鴨呼腸孤病毒；2:番鴨呼腸孤病毒；3:鴨肝炎病毒）

[1]胡奇林,陳少鶯.番鴨呼腸孤病毒病(肝白點(diǎn)病)研究進(jìn)展[J].福建畜牧獸醫(yī),2004,26(z1):7-9.

[2]潘曉斌,胡奇林,陳少鶯,等.番鴨呼腸孤病毒病病原學(xué)研究[J].生物技術(shù)通報,2008(1):72-74.

[3]陳少鶯,胡奇林,程曉霞,等.番鴨呼腸孤病毒病活疫苗創(chuàng)制及應(yīng)用[J].中國科技成果,2016,17(13):73-74.

[4]袁遠(yuǎn)華,吳志新,黃興國,等.新型鴨呼腸孤病毒病研究進(jìn)展[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2012(10):18-20.

[5]胡奇林,林鋒強(qiáng),陳少鶯,等.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測番鴨呼腸孤病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2004,24(3):231-232.

[6]羅玉均,張桂紅,陳建紅,等.應(yīng)用RT-PCR檢測鴨肝炎病毒Ⅰ型感染[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2007,32(3):20-21.

[7]王劭,陳少鶯,陳仕龍,等.新型鴨呼腸孤病毒RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2011,19(2):388-392.

A case report of novel reovirus infection with Muscovy duckling

Zhang Qiuyue
（Nanping Xingxing animal husbandry Co.,Ltd.,Nanping 353000）

In January 2017,a Muscovy breeding farm in Yanping District of Nanping in Fujian outbreak a disease at nearly 45% death with opisthotonus and ataxia symptom.The dead Muscovy duck showed large area of irregular bleeding,and accompanied by necrosis with spleen.Combined with clinical preliminary which indicated with novel reovirus infection at the Muscovy ducklings.The liver and spleen of Muscovy ducklings after grinding treatment,then with bacteria isolation and specific RT-PCR analysis.The results showed no bacterial isolates was obtained and only novel reovirus specific RT-PCR primers were tested positive with 586 bp in length, no positive results with Muscovy duck reovirus and duck hepatitis virus,which suggested that this Muscovy breeding farm outbreak novel reovirus.

Muscovy duckling Novel reovirus Bacterial isolation RT-PCR analysis

表1 研究使用的RT-PCR引物序列

A

1003-4331（2017）03-0014-02