馮巧麗，盧成志，李超，王麗，宋立君

(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2天津市第一中心醫(yī)院)

去腎交感神經(jīng)術(shù)治療犬心肌梗死的效果及機制探討

馮巧麗1，2，盧成志2，李超2，王麗2，宋立君2

(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2天津市第一中心醫(yī)院)

目的 觀察去腎交感神經(jīng)術(shù)(RDN)治療犬心肌梗死(簡稱心梗)的效果，并探討其相關(guān)機制。方法 18只健康雜種犬隨機分為對照組、模型組、治療組，每組6只。模型組、治療組采用明膠海綿栓塞法建立前壁心梗模型；造模后1周，治療組行RDN手術(shù)，模型組只行腎動脈造影檢查。分別于造前及造模后4周檢測左心室射血分數(shù)(LVEF)、短軸縮短率(FS)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮末期壓(LVSP)及心率(HR)。造模后4周采用苦味酸比色法測定血肌酐。建模后4周處死動物，留取梗死周邊區(qū)組織(對照組取同一部位組織)，HE染色觀察心肌形態(tài)及結(jié)構(gòu)改變；同時檢測心肌組織AngⅡ、Ang1-7、ACE2 mRNA、MasR mRNA。建模后4周，留取實驗犬腎動脈組織，采用免疫組化染色觀察腎動脈酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)纖維形態(tài)及分布情況并進行定量分析。結(jié)果 模型組和治療組造模后4周LVEDP高于對照組，LVEF、FS、LVSP低于對照組(P均<0.05)；治療組LVEDP低于模型組，LVEF高于模型組(P均<0.05)。對照組、模型組和治療組血肌酐水平相比，P均>0.05。治療組較模型組梗死周邊區(qū)病理改變明顯減輕。模型組和治療組心肌組織中AngⅡ、Ang1-7水平及ACE2 mRNA、MasR mRNA相對表達量高于對照組，治療組AngⅡ、Ang1-7水平及ACE2 mRNA、MasR mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。治療組與模型組相比，TH陽性神經(jīng)纖維形態(tài)及分布趨于正常，且治療組TH陽性神經(jīng)纖維相對表達量低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 RDN治療犬心梗有效，可改善心功能，減輕心肌病理改變，作用可能與AngⅡ、Ang1-7、ACE2、MasR水平下調(diào)及ACE-AngⅡ-AT1R軸與ACE2-Ang1-7-MasR軸功能失衡改善有關(guān)。

去腎交感神經(jīng)術(shù)；心肌梗死；腎素-血管緊張素系統(tǒng)；血管緊張素；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2；線粒體組裝受體；動物實驗

盡管早期介入治療在很大程度上降低了急性心肌梗死(AMI)患者病死率，但約1/5的存活者亦可能進展為心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，AMI可激活循環(huán)及局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)。經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)-血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)-血管緊張素1型受體(AT1R)軸中最主要的活性物質(zhì)是AngⅡ，其與AT1R結(jié)合后可引起血管收縮、血壓升高、心肌細胞和血管平滑肌細胞增生等效應(yīng)，參與組織纖維化及心室重構(gòu)過程。研究[1，2]表明，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)-血管緊張素1～7(Ang1-7)-線粒體組裝受體(MasR)軸可拮抗經(jīng)典ACE-AngⅡ-AT1R軸的負面效應(yīng)而發(fā)揮心肌保護作用，且二者共同參與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。去腎交感神經(jīng)術(shù)(RDN)除能有效降壓外，亦可抑制左室重構(gòu)、降低去甲腎上腺素溢出率[3，4]，可用于惡性心律失常、心力衰竭、慢性腎功能不全等的治療[5～7]。最近一項研究[8]證實，RDN可有效降低心衰動物RAS活性并改善心功能，具體機制尚不明確。本研究觀察了RDN治療犬心肌梗死(后簡稱心梗)的效果，及對犬心肌局部RAS活性和ACE2-Ang1-7-MasR軸的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及心梗模型建立 健康成年雜種犬18只(天津春樂實驗動物中心提供)，雌性10只、雄性8只，體質(zhì)量15～17 kg。隨機分對照組、模型組和治療組各6只。對照組僅行冠狀動脈造影檢查，1周后行腎動脈造影檢查。模型組和治療組制作心梗模型：造模前12 h禁食，造模前6 h禁水；6%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜注麻醉，氣管插管，應(yīng)用GSM-Ⅱ麻醉呼吸機行機械通氣；在腹股溝區(qū)尋找股動脈，定位后進行穿刺然后置入6 F鞘管，肝素抗凝；經(jīng)冠狀動脈造影檢查明確前降支第一對角支遠端后，采用微導(dǎo)管注射明膠海綿法制作前壁心梗模型，10 min后再次造影檢查確認遠端血流中斷。模型組建模后1周行腎動脈造影檢查。模型組和治療組分別有1只犬于造模后1、3 d死亡。

1.2 RDN手術(shù)方法 治療組造模后1周行RDN手術(shù)。犬全麻后固定于手術(shù)臺上，將消融電極板粘貼于實驗犬背部。股動脈定位后穿刺置入6 F鞘管，采用6FJR4.0造影導(dǎo)管行兩側(cè)腎動脈造影，經(jīng)動脈鞘將6 F冷鹽水消融導(dǎo)管送入腎動脈內(nèi)，應(yīng)用美國IBI公司的1500T射頻消融儀，設(shè)定消融時間90 s、溫度43 ℃、功率10 W，參照文獻[9]方法，由遠及近沿軸向旋轉(zhuǎn)消融4個位點。手術(shù)結(jié)束后，再次進行腎動脈造影檢查。

1.3 心功能觀察 分別于造模前及造模后4周行超聲心動圖檢查，探頭頻率2.5 MHz，記錄左心室射血分數(shù)(LVEF)、短軸縮短率(FS)，所有參數(shù)取3個連續(xù)心動周期的均值。分別于造模前及造模后4周行右側(cè)股動脈穿刺，將6F豬尾導(dǎo)管推送至左心室，行左心室造影。由Mac-Lab血流動力學(xué)檢測系統(tǒng)記錄犬心率(HR)、左心室舒張末期壓(LVEDP)、左心室收縮期壓(LVSP)等參數(shù)。

1.4 血肌酐檢測 于造模后4周，留取靜脈血，采用苦味酸比色法檢測血肌酐。

1.5 心肌組織病理觀察 造模后4周處死實驗犬，取各組犬左心室梗死周邊區(qū)組織(對照組取同一部位組織)于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片，做5 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、脫水、染色、封片等步驟，于顯微鏡下觀察心肌組織并拍照。

1.6 心肌組織中AngⅡ、Ang1-7、ACE2、MasR檢測 取各組犬左心室梗死周邊區(qū)心肌組織勻漿離心后取上清，ELISA法檢測心肌組織中的AngⅡ、Ang1-7。采用real-time PCR法檢測心肌組織中的ACE2、MasR mRNA，以GAPDH作為內(nèi)參。各基因擴增引物序列和產(chǎn)物長度見表1。

表1 ACE2、MasR、GAPDH基因引物序列及產(chǎn)物長度

1.7 腎動脈酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)纖維檢測 造模后4周，留取實驗犬腎動脈組織，制備石蠟切片，采用免疫組化染色觀察腎動脈中的TH陽性神經(jīng)纖維，參照試劑盒提供的步驟操作，所得圖像經(jīng)Image Pro Plus軟件處理后獲得積分光密度(IOD)，以IOD值表示TH陽性神經(jīng)相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組犬心功能指標(biāo)比較 與對照組相比，模型組和治療組造模后4周LVEDP升高，LVEF、FS、LVSP降低(P均<0.05)；治療組LVEDP低于模型組，LVEF高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 造模后4周各組犬心功能指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組犬血肌酐水平比較 造模后4周，對照組、模型組和治療組血肌酐水平分別為(56.00±19.12)、(62.20±12.79)、(64.80±20.40)μmol/L，三組相比，P均>0.05。

2.3 各組犬心肌組織病理變化 對照組心肌細胞大小一致，胞核、胞質(zhì)清晰，肌纖維排列規(guī)則；模型組梗死周邊區(qū)心肌細胞腫脹，大小不一，肌纖維排列紊亂；治療組與模型組相比上述病理改變明顯減輕(見圖1)。

注：A為對照組；B為模型組；C為治療組。

2.4 各組犬心肌組織中AngⅡ、Ang1-7水平及ACE2、MasR mRNA表達比較 模型組和治療組心肌組織中AngⅡ、Ang1-7水平及ACE2 mRNA、MasR mRNA相對表達量高于對照組，治療組AngⅡ、Ang1-7水平水平及ACE2 mRNA、MasR mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。詳見表3。

表3 各組犬心肌組織中AngⅡ、Ang1-7水平及ACE2、MasR mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.5 各組犬腎動脈TH陽性神經(jīng)形態(tài)、分布及定量 對照組TH陽性神經(jīng)纖維排列一致，形態(tài)正常；模型組部分神經(jīng)纖維粗大，排列紊亂；治療組與模型組相比，神經(jīng)纖維形態(tài)及分布趨于正常(見圖2)。對照組、模型組和治療組腎動脈TH陽性神經(jīng)纖維相對表達量分別為93.44±10.86、102.26±18.98、75.69±14.67，治療組TH陽性神經(jīng)纖維相對表達量低于模型組(P<0.05)，治療組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A為對照組；B為模型組；C為治療組。

3 討論

RDN術(shù)可去除分布在腎動脈外膜的交感神經(jīng)[10]，主要用于以交感神經(jīng)過度激活為主的疾病治療。研究表明RDN除可以顯著降低血壓外，還可以帶來降壓以外的獲益。已有臨床研究[6]證實，RDN治療心衰有效，其不僅能顯著改善患者的癥狀，且可提高心衰患者的運動耐力。本研究結(jié)果顯示，模型組和治療組造模后4周LVEDP高于對照組，LVEF、FS、LVSP低于對照組；治療組LVEDP低于模型組，LVEF高于模型組；治療組較模型組梗死周邊區(qū)病理改變明顯減輕，表明RDN治療心?？筛纳菩墓δ埽瑴p輕心肌病理改變。RDN手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥包括腎動脈狹窄、夾層、血流動力學(xué)變化及腎功能改變等。有學(xué)者[6]對心衰患者進行了6個月的隨訪，未出現(xiàn)RDN治療后出現(xiàn)低血壓及嚴(yán)重血流動力學(xué)紊亂事件。Hering等[7]證實RDN不會加重腎功能不全。本研究發(fā)現(xiàn)，心梗犬經(jīng)RDN治療后，TH陽性神經(jīng)纖維表達顯著降低，證實RDN操作的有效性，而LVSP及血肌酐無明顯變化，提示RDN術(shù)后短期內(nèi)不會影響心梗犬的血壓及腎功能。目前，RDN治療心衰的具體作用機制尚不明確。

全身幾乎所有的組織如心臟、血管、腎臟、腦等均具有獨立的RAS。心肌局部RAS作為體液調(diào)節(jié)機制中的重要組成部分，與心梗后心衰的發(fā)病有關(guān)。心衰時，交感神經(jīng)活性增加，腎臟血流灌注減少，導(dǎo)致RAS激活。其中經(jīng)典的ACE-AngⅡ-AT1R軸活性增強，通過刺激炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及促纖維化等作用參與心室重構(gòu)，為拮抗其不良作用，RAS中的ACE2-Ang1-7-MasR軸表達代償性增加以維持心功能[11]。在輕度心功能不全時，RAS活性增強，ACE2-Ang1-7-MasR軸激活并占優(yōu)勢以改善心功能，但隨著病程進展，心室重構(gòu)、左心擴張、心功能不斷惡化，ACE2-Ang1-7-MasR軸的代償機制已不足以彌補或抵抗ACE-AngⅡ-AT1R軸帶來的負面作用，ACE-AngⅡ-AT1R軸占主導(dǎo)將加重心室重構(gòu)及心功能惡化[11]。

ACE2是一種新近發(fā)現(xiàn)的ACE的同源物，可降解AngⅡ,產(chǎn)生具有擴張血管、抗增殖及抗炎等心肌保護作用的產(chǎn)物Ang1-7。Ang1-7是AngⅡ的生理拮抗劑，主要通過作用于MasR而拮抗AngⅡ所導(dǎo)致的負面效應(yīng)。已有大量研究闡述了ACE2-Ang1-7-MasR軸在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病及進展中的重要作用。實驗表明心梗及心衰患者血清中可溶性ACE2水平[12]、心肌組織中ACE2基因及蛋白表達水平均增加[11]，以拮抗ACE-AngⅡ-AT1R軸活性增強導(dǎo)致的負面效應(yīng)。研究[13～15]還發(fā)現(xiàn)外源性予以AT1R拮抗劑、ACE2或Ang1-7后可通過下調(diào)ACE、AngⅡ水平及上調(diào)Ang1-7水平而減輕心肌纖維化、抑制心肌病理性肥厚、改善心功能。高表達的Ang1-7可刺激心梗后血管再生、糾正RAS兩軸平衡紊亂、抑制炎癥因子產(chǎn)生而減輕心室重構(gòu)、增強心功能[16～17]；亦可通過作用于MasR有效抑制AT1R-NADPH酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而改善糖尿病大鼠的頸動脈血流[18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)ACE2基因表達水平與LVEDD呈顯著性正相關(guān)，與心功能呈負相關(guān)，表明ACE2-Ang1-7-MasR軸活性可能在心室擴張、心功能惡化時增強，隨著心功能改善而降低。

本研究發(fā)現(xiàn)心梗犬心功能下降，心肌組織中AngⅡ、ACE2水平和Ang1-7 mRNA、MasR mRNA相對表達量明顯升高，而RDN手術(shù)治療后AngⅡ、ACE2水平和Ang1-7 mRNA、MasR mRNA相對表達量降低，腎動脈TH陽性神經(jīng)纖維形態(tài)及分布趨于正常、表達增高，抑制了心梗后代償性ACE2-Ang1-7-MasR軸的活性。推測RDN可通過抑制心梗后RAS的不良激活，降低AngⅡ水平，抑制心肌重構(gòu)及心室擴張，提高心功能，進而使在心功能惡化時升高的ACE2、Ang1-7和MasR等指標(biāo)水平回落。這與Liang等[20]的研究結(jié)果一致。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認為，RDN治療犬心梗有效，可改善心功能，減輕心肌病理改變，作用可能與AngⅡ、Ang1-7、ACE2、MasR水平下調(diào)及ACE-AngⅡ-AT1R軸與ACE2-Ang1-7-MasR軸功能失衡改善有關(guān)。RDN有望作為治療心梗甚至心衰的新技術(shù)。然而，RAS在心血管疾病中的調(diào)控機制尚未完全明確，且本研究存在樣本量小、觀察時間短、檢測指標(biāo)不夠完善等不足，RDN手術(shù)的長期安全性及遠期療效尚需進一步研究證實。

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天津市衛(wèi)生局科技基金項目(2014KY11)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(14JCYBJC26100)；天津市衛(wèi)生計生委科技基金(15KG131)。

盧成志(E-mail: lucz8@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.011

R542.2

A

1002-266X(2017)15-0041-04

2016-10-18)