南 寧 寨 旭 王 宇 陳 琦

藥物治療后腎癌EMT相關(guān)基因表達(dá)譜分析及對預(yù)后的影響

南 寧 寨 旭 王 宇 陳 琦

目的 通過對相關(guān)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析，探究EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)與腎癌的相關(guān)性。方法 對NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫中的若干數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)量分析、生存分析和相關(guān)性分析。結(jié)果 ①研究分析表明，Snai1等EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子在腎癌中存在明顯的高表達(dá)，而E-cadherin(CDH1)等則表現(xiàn)為明顯的低表達(dá)。②Twist1等的高表達(dá)會導(dǎo)致腎癌患者的總生存率和無疾病生存率明顯降低(P=0.0186;P<0.0015)。③VIM和SIP1在藥物治療后的腎癌患者中有明顯的高表達(dá)情況(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和TJP1在藥物治療后的腎癌患者中則表現(xiàn)為低表達(dá)(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)。④VIM和SIP1在腎癌患者中的表達(dá)情況呈正相關(guān)(P<0.0001，γ=0.573)；而其與OCLN呈負(fù)相關(guān)(P=0.0017，γ=-0.3316)。結(jié)論 通過對EMT指標(biāo)在腎癌患者中的表達(dá)相關(guān)性分析表明，EMT調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)與腎癌患者疾病的發(fā)展存在一定的相關(guān)性，并且對其藥物耐受和預(yù)后都有一定的影響。

腎癌；表達(dá)譜；EMT；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:548～552)

腎癌是常見的致死率位于前十的惡性腫瘤之一，其患者仍然在逐年增加[1]。約有30%的腎癌患者在診斷初期就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，且由于耐藥性的存在，轉(zhuǎn)移性腎癌患者5年生存率僅為5%[2]。雖然目前一些靶向治療藥物可以在一定程度上改善預(yù)后，但對于很多惡性腎癌仍然無法治愈[3]。所以鑒定驅(qū)動腎癌生長轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)事件對于發(fā)展最佳的治療策略是至關(guān)重要的。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程，與上皮細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明EMT在多種癌癥的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中起著舉足輕重的作用[5],其相關(guān)基因的表達(dá)還對于腫瘤的耐藥起著非常重要的作用[6]。有研究提示EMT相關(guān)的基因，如Twist的表達(dá)與腎癌的轉(zhuǎn)移以及耐藥有著密切的關(guān)系[7]。而完整的EMT信號網(wǎng)絡(luò)是由細(xì)胞外信號觸發(fā)，如轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)信號[8-9]，這些轉(zhuǎn)錄因子同腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以及腫瘤耐藥性的發(fā)展密切關(guān)聯(lián)[10]。目前仍沒有研究直接證明他們之間的聯(lián)系，故在本研究中我們探究了腎癌病例中相關(guān)EMT調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)情況，并分析了EMT調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)與腎癌耐藥的相關(guān)性及對腎癌預(yù)后及生存的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用到的材料均來自于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫，具體信息如下。

表1 研究中所用到的GES數(shù)據(jù)集

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)量分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對值進(jìn)行表達(dá)量的分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理。根據(jù)表達(dá)量處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類和差異分析。文中熱圖由HemI軟件制作，比較差異分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

1.2.2 生存分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對值及對應(yīng)樣本的總生存(OS)和無疾病生存(DFS)信息進(jìn)行生存分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理，并采用Kaplan-Meier分析方法進(jìn)行分析。

1.2.3 相關(guān)性分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標(biāo)基因的表達(dá)量的相對值進(jìn)行相關(guān)性分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理。(P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，γ<0表示負(fù)相關(guān)，γ>0表示正相關(guān))。

2 結(jié)果

2.1 EMT相關(guān)指標(biāo)在腎癌患者中的表達(dá)分析

為了評估EMT與腎癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們選取了6個EMT相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，分別為Snai1、Twist1、vi mentin(VIM)、SIP1、E-cadherin(CDH1)和occludin (OCLN)，據(jù)以往的相關(guān)研究表明，其中Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在EMT的過程中表達(dá)量上調(diào)，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)在EMT的過程中表達(dá)量下調(diào)。據(jù)此，我們對研究數(shù)據(jù)集中的腎癌樣本和正常腎組織樣本的相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了表達(dá)譜的聚類分析，結(jié)果表明Snai1、Twist1、VIM和SIP1在腎癌樣本中均存在高表達(dá)，而E-cadherin和occludin在腎癌中均表現(xiàn)為低表達(dá)，這也與以往的類似研究結(jié)果相一致，表明EMT對于腎癌的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。

2.2 EMT相關(guān)指標(biāo)對腎癌患者生存及預(yù)后的影響

據(jù)以往的研究報(bào)道，EMT過程對于腎癌的發(fā)生發(fā)展以及腎癌患者的生存狀態(tài)具有重要作用。所以，為了進(jìn)一步探究EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)對腎癌患者的生存狀態(tài)的影響，我們對上述部分基因進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，在腎癌患者中，SANI1的高表達(dá)會導(dǎo)致腎癌患者的總生存率明顯降低(P<0.0001)，并且在腎癌患者中，SANI1的高表達(dá)也同樣會導(dǎo)致腎癌患者的無疾病生存率明顯降低(P=0.0071)。與此類似，我們也在同樣的數(shù)據(jù)集中對Twist1的高表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌患者的總生存率和無疾病生存率進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，Twist1的高表達(dá)同樣也會導(dǎo)致腎癌患者的總生存率和無疾病生存率明顯降低(P=0.0186;P<0.0015)(圖1)。

2.3 EMT相關(guān)指標(biāo)在藥物治療后腎癌患者中的表達(dá)分析

在上述的研究中，我們分析了EMT相關(guān)指標(biāo)在腎癌患者中的表達(dá)異常情況，以及部分基因的高表達(dá)對腎癌患者總生存率和無疾病生存率的影響。為了研究藥物治療后腎癌患者中EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況，我們在相關(guān)數(shù)據(jù)集中對部分上述高表達(dá)(VIM和SIP1)和低表達(dá)(CDH1和OCLN)的基因進(jìn)行了表達(dá)量的比較分析。結(jié)果表明，與在腎癌患者中的表達(dá)情況相似，VIM和SIP1在藥物治療后的腎癌患者中也有明顯的高表達(dá)情況(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和OCLN在藥物治療后的腎癌患者中則同樣表現(xiàn)為低表達(dá)(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)(圖2)。這一結(jié)果說明，EMT過程不僅對腎癌的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響，而且其在藥物治療后腎癌患者中也表現(xiàn)出同樣差異表達(dá)情況，暗示其在腎癌的耐藥性發(fā)展過程中也發(fā)揮著同樣重要的作用。

圖1 EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與腎癌患者生存狀態(tài)的分析

圖2 EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子在耐藥性腎癌患者中的表達(dá)差異比較

2.4 EMT相關(guān)指標(biāo)在腎癌患者中表達(dá)的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探究，EMT的相關(guān)基因的差異表達(dá)與腎癌耐藥發(fā)展的相關(guān)性，我們在耐藥性腎癌患者樣本中進(jìn)行了EMT的相關(guān)基因的表達(dá)的相關(guān)性分析。結(jié)果表明，VIM和SIP1在腎癌患者中的表達(dá)情況呈正相關(guān)(P<0.0001，γ=0.573)；而其與OCLN的相關(guān)性分析顯示呈負(fù)相關(guān)(P=0.0017，γ=-0.3316)(圖3)。這一結(jié)果進(jìn)一步說明，EMT的相關(guān)調(diào)節(jié)因子在耐藥性腎癌患者中的差異表達(dá)是有關(guān)聯(lián)的，而且這一關(guān)聯(lián)與腎癌耐藥性的發(fā)展也有著密切的關(guān)系，很可能EMT就是腎癌轉(zhuǎn)移乃至產(chǎn)生藥物耐受的關(guān)鍵性步驟，通過EMT來促進(jìn)腎癌的發(fā)展惡化，并影響患者的生存及預(yù)后。

圖3 EMT相關(guān)指標(biāo)在耐藥性腎癌患者中的表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

EMT過程的進(jìn)行由多個步驟組成，該過程的實(shí)現(xiàn)對于惡性腫瘤的多種惡化事件都具有促進(jìn)作用，包括腫瘤生成、腫瘤浸潤、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤的藥物耐受等。因此，一些包括表皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的調(diào)節(jié)因子均參與這一過程[11]。而且這些調(diào)節(jié)因子對于EMT的調(diào)控存在著不同的模式，這與EMT在惡性腫瘤的早期階段所存在的時間和空間上的異質(zhì)性有關(guān)[12]，因此，腫瘤EMT相關(guān)的調(diào)節(jié)因子的鑒定和研究是必要的。目前關(guān)于 EMT 的研究逐漸深入，其在腎癌中發(fā)揮的作用不斷地被發(fā)現(xiàn)，EMT 發(fā)生的分子機(jī)制也不斷地被揭示[13]。在該研究中，我們著重于6個已知的EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子在腎癌組織中表達(dá)的研究，這些調(diào)節(jié)因子對于腎癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移耐藥及預(yù)后生存都有著重要的作用，探究它們與腎癌的關(guān)系，對于腎癌的診斷和治療都具有重要的意義。

我們的研究分析表明，Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在腎癌患者中存在明顯的高表達(dá)，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)則表現(xiàn)為明顯的低表達(dá)，且這些基因的表達(dá)異常與腎癌患者的生存及預(yù)后有著密切的關(guān)系，這一結(jié)果也與以往的一些研究結(jié)果相一致?；诖?，我們又對耐藥性腎癌病例樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分EMT相關(guān)的基因在耐藥性腎癌患者中也表現(xiàn)出明顯的表達(dá)異常，該結(jié)果證明多因子調(diào)控的EMT過程，不僅對于腎癌的發(fā)生發(fā)展有著重要的促進(jìn)作用，而且對于腎癌的耐藥性也具有一定的作用。

最后，通過對EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子在腎癌患者中的相關(guān)性分析表明，EMT調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)性，某些促進(jìn)EMT進(jìn)程的調(diào)節(jié)因子會抑制某些促凋亡因子的表達(dá)，同時促進(jìn)某些促增殖因子的表達(dá)。隨后，我們比較分析了EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)對腎癌患者預(yù)后生存的影響。單一變量分析顯示，Twist和vimentin等EMT正向調(diào)控因子的高表達(dá)降低了腎癌患者的總的生存期，同時促進(jìn)了腎癌患者的治療后疾病的復(fù)發(fā)。盡管沒有研究表明Twist與腎癌患者預(yù)后相關(guān)，但是Twist作為一個重要的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達(dá)，從而使得E-cadherin所介導(dǎo)的細(xì)胞間連接缺失，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動轉(zhuǎn)移[14]。我們的研究分析結(jié)果同樣也與這一結(jié)論相一致，包括Twist在內(nèi)的部分EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子對于腎癌的轉(zhuǎn)移和惡化都存在促進(jìn)的作用。最終，我們提出部分EMT相關(guān)調(diào)節(jié)因子的高表達(dá)會導(dǎo)致腎癌患者總生存期降低，同時也會使得患者的無復(fù)發(fā)生存期降低。

通過對本研究結(jié)果的分析討論，我們評估了多種參與EMT過程的調(diào)節(jié)因子在腎癌中的重要性，同時也在一定程度上揭示了多因子調(diào)控的EMT過程與腎癌的發(fā)生發(fā)展以及腎癌患者的預(yù)后生存等存在著密切的聯(lián)系。這將為腎癌相關(guān)標(biāo)志物的選擇和腎癌患者的診斷治療提供一定理論基礎(chǔ)。

[1] Rosner I,Bratslavsky G,Pinto PA,et al.The clinical implications ofthe genetics of renal cell carcinoma〔J〕.Urol Oncol,2009,27(2):131-136.

[2] Rini BI.Metastatic renal cell carcinoma:many treatment options,one patient〔J〕.J Clin Oncol,2009,27(19):3225-3234.

[3] Bellmunt J,Montagut C,Albiol S,et al.Present strategies in the treatment of metastatic renal cell carcinoma:an update on molecular targeting agents〔J〕.BJU Int,2007,99(2):274-280.

[4] 湯志杰,張茂娜,陳 莉.肝癌和肝纖維化發(fā)生EMT及相關(guān)信號通路的分子機(jī)制〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2014,29(1):113-116.

[5] 向姝霖,劉 芳,夏 紅,等.二烯丙基二硫下調(diào)β-catenin抑制人胃癌MGC803細(xì)胞EMT〔J〕.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2015,43(5):487-492.

[6] Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelialmesench- ymal transitions in development and disease〔J〕.Cell,2009,139(5):871-890.

[7] Harada K,Miyake H,Kusuda Y,et al.Expression of epithelial-mesenchymal transition markers in renal cell carcinoma:impact onprognostic outcomes in patients undergoing radical nephrectomy〔J〕.BJU Int,2012,110(11 Pt C):E1131-E1137.

[8] Harris AL.Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth〔J〕.Nat Rev Cancer,2002,2(1):38-47.

[9] Giatromanolaki A,Sivridis E，Koukourakis MI.The pathology of tumor stromatogenesis〔J〕.Cancer Biol Ther，2007，6(5):639-645.

[10] Liu WH,You N,Zhang N,et al.Interpretation of interlocking key issues of cancer stem cells in malignant solid tumors〔J〕.Cell Oncol,2012,35(6):397-409.

[11] Iwatsuki M,Mimori K,Yokobori T,et al.Epithelial-mesenchymal transition in cancer development and its clinical signifi cance〔J〕.Cancer Sci,2010,101(2):293-299.

[12] Voulgari A,Pintzas A.Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis:mechanisms,markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009,1796(2):75-90.

[13] Lentzsch S,Chatterjee M,Gries M,et al.PI3-K/AKT/FK- HR and MAPK signaling cascades are redundantly stimulated by a variety of cytokines and contribute independently to proliferation and survival of multiple myeloma cells〔J〕.Leukemia,2004,18(11):1883-1890.

[14] Wu ST,Sun GH,Hsu CY,et al.Tumor necrosis factor-ainduces epithelial-mesenchymal transition of renal cell carcinoma cells via a nuclear factor kappa B-independent mechanism〔J〕.Exp Biol Med,2011,236(9):1022-1029.

(編輯：甘 艷)

Analysis of EMT-related Gene Expression Profile and Prognosis of Renal Cell Carcinoma after Drug Treatment

NANNing，ZHAIXu，WANGYu，etal.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity，Xi'an,710004

Objective To study relevant database data analysis,and explore the correlation of the abnormal expression of EMT related factors and renal cell carcinoma.Methods Based on some data sets of GEO in the NCBI database,to perform express analysis,survival analysis and correlation analysis.Results ①The results showed that Snail1 and other EMT-related regulatory factors in renal cell carcinoma patients were significantly higher expression,while the E-cadherin(CDH1)and so the performance was significantly lower expression.②Twist1 and other high expression of renal cancer patients will lead to the overall survival and disease-free survival was significantly reduced(P=0.0186;P<0.0015).③VIM and SIP1 were significantly higher in patients with renal cancer after drug treatment(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021),while CDH1 and TJP1 showed low expression in renal cancer patients after drug treatment(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001).④There was a positive correlation between the expression of VIM and SIP1 in renal cell carcinoma(P<0.0001,γ=0.573)and negative correlation with OCLN(P=0.0017,γ=-0.3316).Conclusion The correlation analysis between the EMT index and the expression of RCC in RCC patients showed that the abnormal expression of EMT regulatory factor is correlated with the development of RCC and has certain influence on drug tolerance and prognosis.

Kidney cancer;Expression profile;EMT;Prognosis

710004 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院

陳 琦

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.008

R737.11

A

1001-5930(2017)04-0548-05

2016-11-09

2017-03-12)