蒼小鑫，趙小明，鐘潤濤，王文霞，尹 恒，朱靖博，丁 燕

(1.中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023； 2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧大連 116034；3.大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116026)

基于液滴技術(shù)的煙草細胞免疫應(yīng)激信號的檢測

蒼小鑫1,2，趙小明1，鐘潤濤3，王文霞1，尹 恒1，朱靖博2，丁 燕2

(1.中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023； 2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧大連 116034；3.大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116026)

基于液滴微流控芯片技術(shù)，用殼寡糖(chitosan oligosaccharide ，COS)處理懸浮培養(yǎng)的煙草細胞(BY-2 cell)，對煙草細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)激信號分子(H2O2和Ca2+)進行熒光檢測。用50 μg/mL的殼寡糖水溶液分別刺激裝載過氧化氫和鈣離子熒光探針的煙草細胞，在熒光顯微鏡下觀察到煙草細胞產(chǎn)生的熒光；以液滴微流控芯片為實驗平臺，研究發(fā)現(xiàn)水相流速為100 μL/h，油相流速為300 μL/h時，液滴尺寸為300 μm，適合煙草細胞的包裹，在該條件下將COS與熒光探針孵育后的細胞包裹在液滴中，在熒光顯微鏡下觀察到液滴中的熒光；后用熒光酶標(biāo)儀檢測96孔板和液滴承載的細胞的熒光強度，結(jié)果顯示1 h內(nèi)兩者的變化趨勢一致。試驗為液滴微流控芯片在植物免疫誘導(dǎo)劑和生物農(nóng)藥方面的研究提供了參考。

液滴微流控芯片；殼寡糖；煙草細胞；H2O2熒光探針；Ca2+熒光探針

植物病毒病的防治一直是世界范圍內(nèi)的一個難題[1]，其中煙草病毒病危害面積廣，經(jīng)濟損失大且難以防治[2]。雖然化學(xué)農(nóng)藥可以快速有效防治，保證高產(chǎn)，但是隨之而來的農(nóng)藥殘留高、環(huán)境污染嚴(yán)重和抗藥性增強等問題日益增多[3]，這些問題嚴(yán)重威脅到人類健康。

生物農(nóng)藥是指直接利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對農(nóng)業(yè)有害生物進行殺滅或抑制的制劑[4]。利用植物誘導(dǎo)抗性來開發(fā)各種生物農(nóng)藥是保護領(lǐng)域的研究熱點[5-6]。尋找高效植物激發(fā)子成為研發(fā)新型生物農(nóng)藥的重點，20世紀(jì)90年代，中國研究者開展了寡糖激發(fā)子生物農(nóng)藥的研發(fā)，篩選出較有成效的生物農(nóng)藥之一是殼寡糖[7-8]。

鈣離子是植物體內(nèi)的第二信使，鈣離子激發(fā)是植物抗性表達過程的早期反應(yīng)之一，植物能夠利用鈣離子濃度變化感受外界刺激。H2O2也是植物防御反應(yīng)的早期信號分子，是植物防御反應(yīng)的標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)植物體受病原菌侵害和逆境脅迫過程中，會爆發(fā)大量的H2O2，它可以穿過細胞膜直接進行信號傳遞。

ZHAO等[9]將煙草葉片裝載NO和H2O2熒光探針后，利用熒光顯微鏡并在激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為505～530 nm時檢測到煙草葉片產(chǎn)生的熒光信號，證實殼寡糖誘導(dǎo)煙草細胞抗病的能力。LU等[10]為證明殼寡糖對煙草花葉病毒的作用效果，將4～6葉期的煙草葉片裝載Ca2+探針，經(jīng)殼寡糖處理后，在熒光顯微鏡下觀察到葉片中產(chǎn)生的熒光，并對鈣離子濃度變化進行檢測。ZHANG等[11]利用熒光酶標(biāo)儀檢測裝載了NO、Ca2+、H2O2熒光探針的懸浮培養(yǎng)的煙草細胞，檢測不同濃度的殼寡糖處理后，煙草細胞中各種誘導(dǎo)因子的變化。

微流控技術(shù)是一種利用微流體力學(xué)，把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、培養(yǎng)、反應(yīng)、分離、檢測等操作單元高度集成[12]，用以實現(xiàn)各種生物或化學(xué)試驗的技術(shù)，具有高通量、高靈敏度、低試劑量消耗、無交叉污染、反應(yīng)速度快的優(yōu)點[13]。其中的液滴微流控技術(shù)以離散的微小液滴為流動主體，每一個形態(tài)穩(wěn)定的液滴均可視為獨立的微反應(yīng)器，減少了交叉污染，且便于操控，因此是單細胞分析[14]、分子生物學(xué)[15]、藥物分選[16-17]、材料合成[18-19]等領(lǐng)域的理想選擇。利用液滴微流控技術(shù)的上述優(yōu)勢，將植物細胞包裹到含有熒光探針和待考察的植物激發(fā)子的液滴中，檢測并比較不同種類待考察的植物激發(fā)子誘導(dǎo)植物細胞產(chǎn)生H2O2和Ca2+等植物抗性相關(guān)信號分子的能力[9-11,20]。

為研究將微流控液滴技術(shù)應(yīng)用于植物免疫誘導(dǎo)劑熒光信號檢測的可行性，本試驗摸索了使用微流控芯片生成包裹煙草細胞所需要的流體力學(xué)參數(shù)，并對經(jīng)殼寡糖刺激后的煙草細胞液滴進行熒光檢測，采用熒光酶標(biāo)儀在1 h內(nèi)對液滴中煙草細胞和96孔板中細胞的熒光變化趨勢進行對比，為基于液滴微流控芯片的植物免疫誘導(dǎo)劑和生物農(nóng)藥的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

KW-4A型勻膠機：美國Chemat公司；EH20A plus熱板：美國Lab Tech公司；URE-2000/35型紫外深度光刻機：中國科學(xué)院光電技術(shù)研究所；PDC-32G-2等離子體清洗器：美國Harrick公司；IX73熒光倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Image-Pro Plus圖片處理軟件：美國Media Cybernetics公司；TJ-2A注射泵：保定蘭格恒流泵有限公司；Gemini EM熒光酶標(biāo)儀：美國分子儀器公司；752N紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR21N離心機：日本日立公司。

液滴形成油：美國Biorad公司；Sylgard184聚二甲基硅氧烷：Polydimethylsiloxane，美國Dow Corning公司；SU-83035光刻膠：美國Micro Chem公司；乳酸乙酯：天津市光復(fù)精細化工研究所；異丙醇：天津博迪化工有限公司；濃H2SO4、H2O2：天津市科密歐；莧菜紅：上海Aladdin公司；三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷：美國sigma公司；FC-40油：美國Santa Cruz公司； KOH、KCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4：均為國產(chǎn)分析級純；過氧化氫熒光探針(H2DCF-DA)：美國Sigma公司；鈣離子熒光探針(Fluo-3AM)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；殼寡糖由大連中科格萊克生物科技有限公司制備，脫乙酰度>95%，聚合度2～10；BY-2煙草細胞：中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物與糖工程研究課題組提供。

1.2 PDMS液滴微流控芯片制備

芯片模板采用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕工藝加工[21]。SU-8玻璃模板的制作：在H2SO4-H2O2中清洗過的 70 mm×70 mm 玻璃基片以第一轉(zhuǎn)速為500 r/min，10 s；第二轉(zhuǎn)速為960 r/min，30 s 的速率旋涂SU-83035光刻膠，經(jīng)過加熱前烘后，利用曝光成像將掩膜上的圖案設(shè)計刻錄到光刻膠上，再將刻錄有圖案的光刻膠玻璃基片放在95 ℃的熱板上加熱烘烤，冷卻到25 ℃后，在乳酸乙酯中顯影，用異丙醇淋洗干凈，轉(zhuǎn)移至熱板180 ℃堅膜，冷卻至25 ℃；PDMS芯片澆注成型：將PDMS預(yù)聚液與固化劑按體積比10∶1混合均勻，倒入SU-8模板，利用真空泵抽走小氣泡，80 ℃固化成型后揭下，切割、打孔，與涂有PDMS的載玻片在等離子腔內(nèi)照射，取出，迅速封接，隨后在80 ℃烘箱加固封接。

1.3 莧菜紅液滴的制備及液滴大小的測定

試驗采用流動共聚焦[17]的PDMS芯片形成油包水的液滴(芯片結(jié)構(gòu)見圖1)，油相為液滴形成油，水相為飽和的莧菜紅水溶液。使用注射泵調(diào)節(jié)流體的速率(水相流速為100 μL/h，油相流速分別為200、300、400、500、600 μL/h；油相流速為600 μL/h，水相流速分別為500、400、300、200、100 μL/h)。在某一固定的水相和油相流速下，利用顯微鏡圖像處理軟件隨機拍攝10個視野，每個視野約10個液滴，測定這100個液滴的直徑并取平均值，獲得該流速下液滴的尺寸。

1.4 液滴制備前細胞的處理

取處于對數(shù)生長期的懸浮培養(yǎng)的BY-2細胞100 mL，先經(jīng)80目鎳絲網(wǎng)過濾，再將濾液經(jīng)300目鎳絲網(wǎng)過濾，所得濾液于50 mL離心管中，1 000 r/min、5 min，25 ℃條件下離心，離心后去除上清液余留2 mL，備用。

1.5 H2DCF-DA 探針的孵育及殼寡糖的誘導(dǎo)

取“1.4”中的BY-2懸浮細胞2 mL加入10 mL離心管中，然后加入1 μL 2 mmol/L H2DCF-DA熒光探針，室溫120 r/min黑暗孵育1 h后，加入3 mL新鮮的培養(yǎng)基，黑暗條件下，25 ℃、120 r/min孵育30 min，然后將細胞混勻后加入到6孔板中，每孔1 mL細胞懸液，用熒光顯微鏡觀測H2O2的產(chǎn)生情況(激發(fā)波長504 nm；發(fā)射波長529 nm)，以50 μg/mL質(zhì)量濃度殼寡糖處理孵育探針的細胞后，用熒光顯微觀察煙草細胞熒光產(chǎn)生情況。 1.6 H2O2信號分子液滴的制備及熒光強度的檢測

結(jié)合操作“1.3”液滴的生成和“1.5”探針的裝載及誘導(dǎo)，將過氧化氫探針孵育并受到殼寡糖預(yù)處理后的細胞微液滴在熒光顯微鏡下觀察，對其觀察到的熒光強弱的差別給予評價。將經(jīng)殼寡糖誘導(dǎo)后的孵育H2DCF-DA的煙草細胞和液滴中的細胞置于黑色96孔板中，利用熒光酶標(biāo)儀對其1 h內(nèi)的熒光強度變化進行測定并對比。

1.7 Fluo-3AM 探針的孵育及殼寡糖的誘導(dǎo)

鈣離子熒光探針的孵育及殼寡糖誘導(dǎo)試驗的具體操作同“1.5”。1.8 Ca2+信號分子液滴的制備及熒光強度的檢測

鈣離子信號分子液滴的制備及熒光強度檢測的具體操作同“1.6”。

2 結(jié)果與分析

2.1 液滴生成芯片設(shè)計

應(yīng)用帶有通道匯流結(jié)構(gòu)區(qū)域的微流控芯片以制備微液滴。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的煙草細胞其直徑為60～240 μm，考慮到懸浮培養(yǎng)的煙草細胞易于成團生長，較大的微流控通道寬度不易造成通道阻塞，因此將芯片的通道寬度設(shè)定為350 μm；液滴生成區(qū)域的通道寬度設(shè)定為250 μm；通道加工深度為120 μm(圖1)。油相注入到芯片后，細胞懸液被油相在十字型匯流縮口處被油相的剪切力夾斷，形成連續(xù)的液滴。

A.芯片掩膜 Photomask of chip；B.芯片示意圖 Schematic plot of chip

2.2 液滴大小的確定

對于通道寬度和高度已確定的芯片，可以通過調(diào)節(jié)油相和水相的流速來控制液滴的大小。以溶有莧菜紅染料的水相進行液滴生成模擬試驗，首先將莧菜紅水溶液流量固定為100 μL/h，調(diào)節(jié)油相流速，分別為600、500、400、300、200 μL/h；再將油相流量固定為600 μL/h，調(diào)節(jié)水相流速，分別為500、400、300、200、100 μL/h。利用顯微鏡成像處理系統(tǒng)對10個條件下液滴的大小進行測量，每個條件下測量10個液滴的直徑取平均值作為該條件下液滴的大小，制作出如圖2所示的統(tǒng)計圖。由于懸浮培養(yǎng)的煙草細胞易成團，通過測量單個形狀規(guī)則的煙草細胞的大小約為60 μm，而成團的煙草細胞可達到280～300 μm，因此本試驗需液滴大小為300 μm左右。通過圖2中的數(shù)據(jù)分析可以得出，當(dāng)水相為100 μL/h，油相為300 μL/h時，生成的液滴大小最適合BY-2煙草細胞的包裹。

2.3 殼寡糖誘導(dǎo)煙草細胞中H2O2的產(chǎn)生及熒光檢測

將H2DCF-DA探針孵育到BY-2煙草細胞中，并用50 μg/mL的殼寡糖水溶液進行誘導(dǎo)。前期的試驗已證明50 μg/mL的殼寡糖的誘導(dǎo)煙草植株抗病效果較好[9]，可以顯著激發(fā)植物細胞產(chǎn)生免疫信號分子。因此，本研究以50 μg/mL的殼寡糖處理煙草細胞時過氧化氫的產(chǎn)生情況為研究模型，考察細胞經(jīng)殼寡糖處理后產(chǎn)生的熒光情況，結(jié)果見圖3。

2.4 液滴中H2O2信號分子熒光的檢測

將BY-2細胞懸液經(jīng)過H2O2探針孵育并使用50 μg/mL殼寡糖誘導(dǎo)后，包裹于微液滴中，在熒光顯微鏡下進行觀測，結(jié)果見圖4。圖4顯示，微液滴包裹的細胞經(jīng)探針孵育并受到激發(fā)子的誘導(dǎo)作用后，其產(chǎn)生的H2O2與探針結(jié)合，在激發(fā)光源的作用下可以發(fā)射出明顯的熒光。

2.5 微液滴與96孔板中BY-2細胞受殼寡糖誘導(dǎo)后的熒光對比

將經(jīng)過50 μg/mL殼寡糖刺激后的BY-2細胞分別包裹于液滴并置于黑色96孔板中，利用熒光酶標(biāo)儀檢測各自熒光強度的變化趨勢。圖5顯示，1 h內(nèi)兩者的變化趨勢基本一致。

圖2 液滴大小與流速的關(guān)系

圖3 明場和熒光場下BY-2細胞產(chǎn)生熒光的情況

2.6 殼寡糖誘導(dǎo)煙草細胞中Ca2+的產(chǎn)生及熒光檢測

將Fluo-3AM探針孵育到BY-2煙草細胞中，并用50 μg/mL的殼寡糖水溶液進行誘導(dǎo)激發(fā)植物細胞產(chǎn)生鈣離子信號分子。結(jié)果如圖6所示，殼寡糖預(yù)處理后的裝載鈣離子熒光探針的煙草細胞在顯微鏡下可以觀察到熒光，而未經(jīng)殼寡糖處理的煙草細胞未觀察到熒光。

2.7 液滴中Ca2+信號分子熒光的檢測

將BY-2細胞懸液經(jīng)過Ca2+探針孵育并使用50 μg/mL殼寡糖誘導(dǎo)后，包裹于微液滴中，在熒光顯微鏡下進行觀測，如圖7所示。經(jīng)過Ca2+探針孵育而未經(jīng)殼寡糖預(yù)處理的細胞在激發(fā)光源的激發(fā)下，沒有顯示出熒光；而經(jīng)Ca2+探針孵育并接受殼寡糖預(yù)處理后的細胞，在激發(fā)光源的作用下，發(fā)射出了熒光。結(jié)果顯示，微液滴包裹的細胞經(jīng)探針孵育并受到激發(fā)子的誘導(dǎo)作用后，其產(chǎn)生的Ca2+與探針結(jié)合，在激發(fā)光源的作用下可以發(fā)射出熒光。

A.未加入過氧化氫探針與殼寡糖的單細胞液滴 Fluorescence of cells in droplets (H2DCF-DA-/ oligosaccharide-)； B.加入過氧化氫探針而未加入殼寡糖的單細胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(H2DCF-DA+/oligosaccharide-)； C.加入過氧化氫探針和殼寡糖的單細胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(H2DCF-DA + / oligosaccharide +)

圖5 BY-2細胞經(jīng)殼寡糖刺激后在微液滴和96孔板中產(chǎn)生熒光的強度對比

2.8 微液滴與96孔板中BY-2細胞受殼寡糖誘導(dǎo)后的熒光對比

將經(jīng)過50 μg/mL殼寡糖刺激后的BY-2細胞分別包裹在液滴中和置于黑色96孔板中，利用熒光酶標(biāo)儀檢測各自熒光強度的變化趨勢。圖8顯示，1 h內(nèi)兩者的變化趨勢基本一致。

3 結(jié)論與展望

本研究探索利用微流控芯片液滴技術(shù)包裹植物細胞的條件，在細胞懸液流速為100 μL/h，油相流速為300 μL/h的條件下生成直徑為300 μm左右的液滴，成功得到包裹煙草細胞的微液滴。并用50 μg/mL殼寡糖水溶液誘導(dǎo)孵育H2DCF-DA和Fluo-3AM熒光探針的細胞發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)，利用熒光顯微鏡檢測得到細胞受激發(fā)產(chǎn)生的熒光，并將液滴中受殼寡糖誘導(dǎo)的細胞和96孔板中受相同處理的細胞熒光對比，發(fā)現(xiàn)微液滴中的BY-2細胞與96孔板中的細胞熒光強度變化趨勢相同，說明微液滴包裹植物細胞在熒光檢測的角度與傳統(tǒng)的孔板檢測結(jié)果具有一致性。

每一個液滴都是一個微小的環(huán)境，液滴內(nèi)的細胞可以和激發(fā)子快速均勻地混合，且能夠依次均勻地分布在孔板內(nèi)，而在96孔板的一個孔內(nèi)，以懸浮液存在的細胞會隨著時間延長而發(fā)生聚集的現(xiàn)象，使其在孔板內(nèi)分布不均勻，因此當(dāng)熒光酶標(biāo)儀的光束均勻地透過孔板時，由于液滴分布均勻，檢測光束均勻地照射孔中的細胞，而以細胞懸液形式存在的孔，因為細胞聚集成團，使檢測光束不能均勻完整地照射到所有細胞，因此液滴包裹的細胞的熒光會強于孔板內(nèi)只含有細胞的熒光強度，靈敏度更高。雖然存在檢測靈敏度的不同，但兩者的效應(yīng)機制相同，所以熒光變化的趨勢一致。由此可見，液滴微流控芯片可以用來做殼寡糖植物免疫誘導(dǎo)劑熒光檢測試驗，且相比96孔板具有更高的靈敏度，是一個更有優(yōu)勢的試驗分析載體。

微液滴包裹植物細胞進行熒光檢測，為植物免疫應(yīng)激信號分子的檢測提供了一個全新的方法，也為煙草等植物細胞的研究提供了一個具有優(yōu)勢的平臺。但本技術(shù)現(xiàn)階段還缺少完善的商品化儀器設(shè)備，構(gòu)建微液滴分析平臺需要較多的人力和物力投入，需要具有微液滴專業(yè)知識的人員進行平臺的構(gòu)建，這限制本技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展和市場化的不斷推進，基于液滴技術(shù)的植物細胞免疫應(yīng)激信號檢測技術(shù)必將迅速發(fā)展，推動植物單細胞分析領(lǐng)域的研究進步。

圖6 明場和熒光場下BY-2細胞產(chǎn)生熒光的情況

A.加入鈣離子探針而未加入殼寡糖的單細胞液滴 Fluorescence of cells in droplets (Fluo-3AM+/oligosaccharide-)； B.加入鈣離子探針和殼寡糖的單細胞液滴 Fluorescence of cells in droplets(Fluo-3AM+/oligosaccharide+)

圖8 BY-2細胞經(jīng)殼寡糖刺激后在微液滴和96孔板中產(chǎn)生熒光的強度對比

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(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Detection of Immunological Stress Signal for BY-2 Cell Based on Droplet Microfluidic

CANG Xiaoxin1,2, ZHAO Xiaoming1,ZHONG Runtao3, WANG Wenxia1, YIN Heng1, ZHU Jingbo2and DING Yan2

(1.Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academic of Sciences, Dalian Liaoning 116023, China; 2.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian Liaoning 116034, China; 3.School of Environmental Science and Engineering, Dalian Maritime University, Dalian Liaoning 116026, China )

Based on droplet microfluidics technology, we detected immunological stress singling molecules (H2O2and Ca2+) secreted by BY-2 cells under simulation of chitosan oligosaccharide (COS) in the paper.BY-2 cells labeled with H2DCF-DA and Fluo-3AM were stimulated by 50 μg/mL COS solution, and fluorescence was detected.We optimized our parameters for this droplet microfluidics platform and could achieve ideal encapsulation of BY-2 cells at an aqueous phase flow rate of 100 μL/h, an oil phase flow rate of 300 μL/h, and a droplet diameter of 300 μm.Under the optimized conditions, COS and fluorescence-labeled BY-2 cells encapsulated in droplets and fluorescence was observed.Then the fluorescence intensity of droplet-encapsulated BY-2 cells were measured by microplate reader and the unencapsulated cells in 96-well plate were taken as the control group.The results indicated that within 1 h, the trend of the intensity changed similarly, and this could provide the guidance for microfluidics-based research in plant immune inducer and biopesticides.

Droplet microfluidic; Chitosan oligosaccharide; BY-2 cell; H2DCF-DA; Fluo-3AM

CANG Xiaoxin, female, master student.Research area:plant protection.E-mail:iceycang@foxmail.com

ZHAO Xiaoming, male, research fellow, doctoral supervisor.Research area:plant sugar biology.E-mail: zhaoxm@dicp.ac.cn

日期：2017-05-22

2016-12-20

2017-01-10

國家自然科學(xué)基金(31370391)；中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計劃(STS計劃)(KFJ-SW-STS-143)。

蒼小鑫，女，碩士研究生，從事液滴微流控芯片的研究。E-mail:iceycang@foxmail.com

趙小明，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事植物糖生物學(xué)的研究。E-mail: zhaoxm@dicp.ac.cn 丁 燕，女，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的研究。E-mail:dingyan_515@hotmail.com

S-3

A

1004-1389(2017)05-0759-08

DING Yan, female, lecturer, master supervisor.Research area:chemistry of natural product.E-mail:dingyan_515@hotmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.030.html

Received 2016-12-20 Returned 2017-01-10

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31370391); Program of Science and Technology Service Network Initiative(No.KFJ-SW-STS-143).