朱永剛，王 磊，張景艷，王旭榮，崔東安，張 凱，張 康，王學智，楊志強，李建喜

(中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

主成分分析法與聚類分析法在胎衣不下奶牛血液生化研究中的應用

朱永剛，王 磊，張景艷，王旭榮，崔東安，張 凱，張 康，王學智，楊志強，李建喜

(中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050)

通過分析胎衣不下奶牛血液生化指標的變化特征，為奶牛胎衣不下早期診斷方法的建立提供依據(jù)。產(chǎn)犢后立即無菌采集47頭奶牛血液，其中25頭為胎衣正常排出奶牛，22頭為胎衣不下奶牛；血液生化分析儀檢測血清生化指標，主成分分析法與聚類分析法分析檢測結(jié)果。結(jié)果表明，16項血清生化指標被聚類成3個主成分，主成分聚類分析的結(jié)果與臨床采集樣品的分類結(jié)果一致；與胎衣正常排出奶牛相比，胎衣不下奶牛的血清中乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶水平顯著升高。表明，主成分分析和聚類分析可以有效地區(qū)別胎衣不下奶牛血清和胎衣正常排出奶牛血清，因此可以通過此方法對奶牛產(chǎn)后胎衣不下的發(fā)生進行提前診斷；還表明奶牛胎衣不下的發(fā)生不僅與蛋白質(zhì)代謝、離子代謝和肌肉代謝紊亂有關(guān)，而且肝臟和腎臟的機能損傷也可能導致胎衣不下。

奶牛胎衣不下；主成分分析；生化指標

奶牛胎衣不下(Retained fetal membranes，RFM)是奶牛產(chǎn)后最需要重視的疾病之一[1-2]，正常奶牛胎衣排出是在胎兒產(chǎn)出后12 h內(nèi)[3]。奶牛胎衣不下是指奶牛產(chǎn)犢后12 h內(nèi)胎衣未排出或者部分排出[4]。中國奶牛胎衣不下的發(fā)病率多為4%～11%[5-6]，炎熱地區(qū)可高達50%[7-9]。因胎衣不下常引起子宮內(nèi)膜炎、子宮蓄膿和子宮脫出等產(chǎn)科疾病，影響奶牛再孕及產(chǎn)奶。如果對患病奶牛治療不當或者治療不及時往往會導致奶?；既榉垦?，腐敗的胎衣和細菌感染經(jīng)子宮吸收后還可引起敗血癥，從而危及奶牛生命，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[10-11]。胎衣不下的病因復雜，影響因素較多，主要有激素、免疫、圍產(chǎn)期營養(yǎng)狀況、產(chǎn)后子宮收縮、雙胎、難產(chǎn)等[10,12-13]。雖然近年來對該病的發(fā)病原因進行大量研究，但是其發(fā)病的關(guān)鍵機制至今尚不清楚，直接影響臨床的防治效果。因此，全面了解奶牛胎衣不下的發(fā)生機制，采取有效的檢測方法，對胎衣不下的早期診斷和治療是非常重要的。血清中的一些酶類等代謝物質(zhì)由相應的器官和組織產(chǎn)生，這些酶類等代謝物質(zhì)的改變能夠反應機體因其病理變化產(chǎn)生相應的變化，通過對患病和健康奶牛的血清生化指標檢測并分析主要代謝物的改變，能夠判斷機體的器官或組織是否發(fā)生改變，從而達到輔助臨床診斷的目的。以往對胎衣不下的研究主要通過對血液中鈣、磷、葡萄糖等成分的分析，無法客觀、全面的從血液生化指標方面揭示奶牛胎衣不下的發(fā)病原因[14-16]。主成分分析和聚類分析是應用多元統(tǒng)計分析的原理，對多個變量進行研究的數(shù)學方法。主成分分析通過對眾多的觀測變量進行分析，找出較少的綜合變量類替代原來的變量信息，從而更好地去反映事物的本質(zhì)。聚類分析則是依據(jù)變量的性質(zhì)和特征的相似程度將彼此相近的樣本聚為一類，而差異較大的則分在不同的類[17-18]。本文旨在利用主成分分析和聚類分析法對胎衣不下奶牛的血清生化指標進行研究，尋找胎衣不下奶牛主要血清代謝物質(zhì)的變化，然后以這些血清物質(zhì)為指標，對產(chǎn)后胎衣不下牛和胎衣正常排出牛進行分類，為奶牛胎衣不下的發(fā)病機制以及預防和治療研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

全自動生化分析儀(BS-420，深圳邁瑞公司)；肌酐(CREA)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)測定試劑盒、總蛋白(TP) 測定試劑盒、白蛋白(ALB) 測定試劑盒、總膽紅素(T-Bil)測定試劑盒、直接膽紅素(D-Bil) 測定試劑盒、總膽固醇(TC) 測定試劑盒、甘油三酯(TG) 測定試劑盒、鈣(Ca)測定試劑盒、鎂(Mg) 測定試劑盒、磷(P) 測定試劑盒、肌酸激酶(CK)測定試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；高速低溫離心機為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗動物選擇

2016年2月-3月，于甘肅荷斯坦奶牛繁育示范中心按照年齡、胎次、產(chǎn)后體況評分和分娩日期相近為基本原則，選取47頭圍產(chǎn)期荷斯坦奶牛。

1.3 樣品采集與分組

47頭荷斯坦奶牛產(chǎn)犢后立刻通過頸靜脈無菌采血，每頭10 mL，放入一次性采血管內(nèi)，室溫靜置待血液完全凝固后放入離心機內(nèi)，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存，備用。產(chǎn)后經(jīng)獸醫(yī)診斷，47頭奶牛分為胎衣不下組(血清22份)和胎衣正常排出組(血清25份)。診斷標準為：奶牛產(chǎn)犢后12 h內(nèi)胎衣未排出或未完全排出視為胎衣不下。

1.4 奶牛主要臨床指標的觀察

觀察奶牛胎衣不下的發(fā)生率和子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率，記錄胎衣排出的時間、惡露排盡時間、首次發(fā)情時間、受孕時間等。

1.5 血清生化指標的檢測

參照測定試劑盒的使用方法，對血清中CREA、LDH、ALT、ALP、AST、γ-GT、TP、 ALB、 T-Bil、D-Bil、TC、TG、Ca、Mg、P、CK進行檢測，并計算球蛋白值(球蛋白=TP-ALB)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SAS9.2統(tǒng)計軟件進行分析。采用主成分分析和聚類分析法進行處理分析。通過SAS9.2 統(tǒng)計軟件對各項指標進行差異性檢測，其中數(shù)據(jù)均為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛主要臨床指標的觀察

由表1可知，胎衣正常排出組25頭奶牛分娩后惡露排出時間和顏色均正常，有24頭在產(chǎn)后90 d內(nèi)受孕，受孕率96%；胎衣不下組22頭奶牛有6頭在產(chǎn)后90 d內(nèi)受孕，有10頭發(fā)生明顯子宮炎癥。胎衣不下組的總受孕率為27%，與胎衣正常排出組相比，差異極顯著(P<0.01)。

表1 奶牛產(chǎn)后主要臨床指標

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note: * indicates significant difference (P<0.05);* * indicates extremely significant difference (P<0.01).The same as below.

2.2 血清生化指標檢測

2.2.1 血清生化指標檢測 由表2可知，與胎衣正常排出奶牛相比，胎衣不下奶牛血清中，LDH、AST、γ-GT和CK顯著升高(P<0.05)，其余各項指標均無顯著差異(P>0.05)。數(shù)據(jù)均為“平均數(shù)±標準差”。

2.2.2 基于主成分對血清生化指標檢測分析 由表3可知，對16項血清生化分析指標進行主成分分析，根據(jù)特征值大于1的原則，選取3個主成分，其特征值分別為10.013、1.443、1.301，基本上反映原來的變量信息。主成分變量Y1=0.229×ALB+0.298×Ga+0.297×TP+0.266×P+……；主成分變量Y1代表血清蛋白和離子水平的代謝指征，單獨說明變量的62.5%，Y2=0.556×CK+0.473×D-Bil -0.339 9×TC +……；主成分變量Y2代表肌肉和肝膽代謝指征，單獨說明變量的9.02%，Y3=0.553×ALP-0.395×D-Bil +……；主成分變量Y3代表肝腎代謝指征，單獨說明變量的8.13%。

根據(jù)上述的3個主成分對上述采集血清的生化分析指標進行聚類分析，采用類平均的聚類方法。圖1為聚類分析的水平樹狀圖，其中OB1～OB22為胎衣不下奶牛血清，OB23～OB47為胎衣正常排出奶牛血清，從水平樹狀圖中可以將所有觀測樣本分為3大類：OB1～OB5、OB7～OB22為一大類；OB23、OB25～OB47為一大類。OB6、OB24為單獨一類。

將OB6、OB24數(shù)據(jù)除去后，用主成分分析法對檢測的16項血清生化指標進行聚類分析，所得結(jié)果基本與采樣分類結(jié)果一致。其中OB6、OB24獨立成為1類。

表2 血清生化指標統(tǒng)計

表3 奶牛血清生化指標主成分矩陣特征值、貢獻率、累計貢獻率

圖1 聚類分析水平樹狀圖

3 討 論

3.1 主成分的聚類分析

主成分分析是醫(yī)學、生物學、育種學、經(jīng)濟學上常用的一種多元統(tǒng)計分析方法。它是根據(jù)性狀間的相關(guān)性，找出能反應主要信息的少數(shù)幾個相互獨立的綜合性狀，主要應用于樣品分類及排序、簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，尋找綜合因子等方面[19-21]。聚類分析則是一種分類學與多元分析相結(jié)合的多元統(tǒng)計分析方法，它是將分類的對象全部置于一個多維空間中，按照它們空間關(guān)系的疏密程度進行分類。聚類分析的目的是依據(jù)樣品間的相似性或者指標間的相關(guān)性對樣品或指標進行歸類[22-24]。影響胎衣不下的血清生化指標有很多，在正常分析中，難以做到對所有的指標進行選擇[14-16]。在此種情況下，可以考慮在多個指標中選擇有代表性的1個或幾個性狀直接進行選擇，或者制定少數(shù)幾個性狀的綜合指數(shù)進行選擇。因此本試驗將主成分分析和聚類分析法引入奶牛胎衣不下血清生化指標的分析是一個嘗試，應用此方法對產(chǎn)后奶牛血液成分變化的原因進行研究，通過將血清樣本的16項生化指標經(jīng)過主成分分析轉(zhuǎn)化為3項能夠代表原來樣本的綜合性生物學指標，分別是血清蛋白和離子水平的代謝指征、肌肉和肝膽代謝指征和肝腎代謝指征。這與一些報道[14,25-31]中胎衣不下與血清中離子水平失衡、子宮平滑肌收縮乏力和圍產(chǎn)期代謝水平紊亂具有相關(guān)性的結(jié)果一致。本試驗采用主成分分析法和聚類分析法來分析所檢測的血清生化指標是否能夠有效反映產(chǎn)后奶牛胎衣的排出狀態(tài)，結(jié)果表明與臨床采樣分類方法一致，基本能夠區(qū)別胎衣不下奶牛和胎衣正常排出奶牛的血清，故該方法能夠作為產(chǎn)后提前診斷胎衣不下的方法。但是在聚類分析過程中，沒有將觀測樣本OB6、OB24的數(shù)據(jù)分離開，而是單獨聚為一類，原因可能是這兩頭試驗牛同時感染其他疾病，使血清中一些指標有較大的改變，從而影響最終的分類。如OB6中乳酸脫氫酶為1 288 U/L，明顯高于同組平均值630 U/L；OB24中谷草轉(zhuǎn)氨酶為188 μ/L，明顯高于同組平均值63 μ/L。

3.2 胎衣不下對奶牛血清生化指標的影響

機體體內(nèi)代謝是一個穩(wěn)態(tài)過程，檢測血液中一些指標的變化能夠更好地了解疾病的發(fā)生轉(zhuǎn)歸過程，從而達到預防、治療疾病的目的。乳酸脫氫酶是糖代謝中催化丙酮酸向酵解方向的終產(chǎn)物乳酸轉(zhuǎn)化的酶，動物在分娩應激時，首先保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心肌和子宮肌等重要器官的供氧，其他組織在缺氧的情況下采取無氧酵解方式供能，胎衣不下奶牛由于胎衣未排出，子宮肌繼續(xù)收縮，無氧酵解狀態(tài)延長，因此胎衣不下奶牛血液中乳酸脫氫酶含量較胎衣正常排出奶牛高。Peter等[32]研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下奶牛血清中乳酸脫氫酶活性較正常牛高，這與本試驗結(jié)果一致，表明胎衣不下可能與血清中乳酸脫氫酶升高有關(guān)。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶是反應肝臟潛在損傷的重要酶類[33]。韓銀華[34]進行奶牛肝功能與生產(chǎn)性能、繁殖性能的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，與健康牛相比，肝功能異常奶牛的胎衣不下發(fā)病率較高。本試驗結(jié)果基本與之相似，胎衣不下奶牛谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷氨酰氨轉(zhuǎn)肽酶活性較胎衣正常排出奶牛的顯著提高，表明胎衣不下可能與谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰氨轉(zhuǎn)肽酶活性異常升高有關(guān)。

肌酸激酶(CK)又稱為肌酸磷酸激酶(CPK)，其主要功能是催化肌酸與ATP之間高能磷酸鍵的可逆性轉(zhuǎn)移，是肌肉收縮能量的來源，正常情況下血液中的肌酸含量較少，一旦出現(xiàn)肌肉收縮強度提高，血液中肌酸含量將大幅度升高[35-36]。本試驗中，胎衣不下奶牛肌酸激酶活性較胎衣正常排出奶牛的活性低，說明胎衣不下的發(fā)生與肌肉收縮強度較低有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，主成分分析法和聚類分析法對血液生化指標表現(xiàn)出很好的降維和聚類效果，并且通過主成分分析方法和聚類分析方法對所選取的奶牛血液生化指標進行分析，其結(jié)果能夠很好的反映奶牛的胎衣排出情況。另外，血清生化指標分析的結(jié)果表明，胎衣不下的發(fā)生不僅僅與蛋白質(zhì)代謝、離子代謝和肌肉代謝紊亂有關(guān)，還可能與肝腎功能損傷和離子代謝紊亂有密切聯(lián)系。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Application of Analysis of Principal Component and Cluster in Blood Biochemical of Cows with Retained Fetal Membranes

ZHU Yonggang,WANG Lei,ZHANG Jingyan, WANG Xurong,CUI Dongan, ZHANG Kai, ZHANG Kang, WANG Xuezhi, YANG Zhiqiang and LI Jianxi

(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Engineering &Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou 730050,China)

This study aims to study the characteristics changes in blood biochemical indexes in cows with retained fetal membranes, so as to establish diagnostic methods for cows with retained fetal membranes. Forty-seven serums were collected after calving, of which twenty-five were cows without retained fetal membranes and twenty-two were cows with retained fetal membranes. The serums were detected by blood biochemical analyzer, then used principal component analysis to analyze the results. The result shows that:sixteen serum biochemical index were clustered into three principal components, according to the three main ingredients of cluster analysis of principal component , classification results consistent with clinical samples, the method could be used to do early diagnosis of cows with retained fetal membranes.The levels of lactate dehydrogenase, aspertate aminotransferase, glutamine transferase, creatine kinase were significantly difference in the cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes . Based on principal component and cluster analysis,the results of the serum biochemical indicators showed that this method could diagnose cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes efficiently. So this method could be uses to early diagnose cows with retained fetal after calving . This result also showed that retained fetal membranes was not only associated with disorders of protein metabolism, ion metabolism and muscle metabolism, but also associated with the damage of liver and kidney.

Retained fetal membranes; Principal component analysis; Biochemical indicators

ZHU Yonggang, male,master student.Research area:prevention and control of animal disease.E-mail:40829330@qq.com

LI jianxi,male,research fellow,doctoral supervisor. Research area: Chinese veterinarian medicine and immunology. E-mail: lzjianxil@163.com

日期：2017-05-22

2016-07-26

2016-09-30

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303040)；國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-37-06)。

朱永剛，男，碩士研究生，研究方向為動物疫病防控相關(guān)研究。E-mail:40829330@qq.com

李建喜，男，研究員，博士生導師，研究方向為中獸醫(yī)藥學與免疫學。 E-mail:lzjianxil@163.com

S852.65

A

1004-1389(2017)05-0685-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.012.html

Received 2016-07-26 Returned 2016-09-30

Foundation item Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.201303040); Dairy Industry Technology and Systems Projects(No. CARS-37-06).