張亞楠，藺銀鼎，孟 林，毛培春，田小霞，郭 強

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097)

馬藺重金屬ATP酶基因HMA2的RNAi 載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化

張亞楠1,2，藺銀鼎1，孟 林2，毛培春2，田小霞2，郭 強2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097)

重金屬ATP酶基因HMA2介導(dǎo)的Cd長距離運輸對植物體內(nèi)Cd的分配及解毒起重要作用。然而，有關(guān)馬藺(Irislactea)體內(nèi)Cd長距離運輸?shù)姆肿訖C制仍不清楚。本研究以馬藺根中總RNA為模板，采用RT-PCR方法獲得了重金屬ATP酶基因片段，以中間載體pHANNIBAL和植物表達載體pART27為基礎(chǔ)，采用酶切和連接的方法，構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的含有IlHMA2基因片段反向重復(fù)序列的RNAi植物表達載體pARTG1G2，用凍融法將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，并轉(zhuǎn)入到馬藺幼苗體內(nèi)獲得了IlHMA2-RNAi轉(zhuǎn)化株系。這將為闡明IlHMA2介導(dǎo)的Cd長距離運輸在馬藺適應(yīng)重金屬鎘污染環(huán)境中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

馬藺；重金屬ATPase酶；鎘富集與耐受性；RNAi載體構(gòu)建

近年來我國重金屬污染事件頻發(fā)，受鎘(Cd)、砷(As)、鉛(Pb)、汞(Hg)、鋅(Zn)等重金屬污染的耕地面積達到總耕地面積的1/5，重金屬污染與防治已成為不容忽視的環(huán)境問題[1]。與其它重金屬元素相比，土壤中Cd2+極易被植物根系吸收，導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量的Cd2+，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，更為嚴重的是，Cd2+可通過食物鏈進入人體，對人類的健康構(gòu)成嚴重威脅[2-4]。因此，如何行之有效地控制和減輕重金屬對環(huán)境的污染和危害已成為一個亟待解決的問題。

植物修復(fù)技術(shù)是一項新興的能源節(jié)約型和生態(tài)友好型環(huán)境修復(fù)技術(shù)，即利用植物對重金屬的吸收能力，將土壤中的重金屬富集并轉(zhuǎn)運至植株地上部，以達到降低土壤中重金屬含量的目的[5-7]。馬藺(Irislactea)又名馬蓮，是鳶尾科鳶尾屬多年生宿根草本植物，廣泛分布于我國東北、西北和華北等地區(qū)，其根系發(fā)達、葉量豐富，對環(huán)境適應(yīng)性強、長勢旺盛、養(yǎng)護成本較低，是節(jié)水、抗旱、耐鹽堿的優(yōu)良觀賞地被植物。葉片翠綠柔軟耐踐踏，花淡雅美麗，在生態(tài)園林建設(shè)中具有良好的應(yīng)用前景[8-10]；尤其是在80 mg·L-1鎘處理42 d后，馬藺地上部Cd2+含量為529 μg·g-1(>100 μg·g-1，屬于鎘超富集植物)，占植株體內(nèi)Cd2+總含量的46%，而且植株仍處于旺盛生長狀態(tài)，并未出現(xiàn)中毒癥狀[11]，說明馬藺具有強大的Cd長距離運輸能力，能夠?qū)⒏滴盏拇罅緾d轉(zhuǎn)運至地上部，降低Cd對根系的毒害，從而使其對Cd表現(xiàn)出很強的耐受和富集能力，具備植物修復(fù)的潛力。研究表明，重金屬ATP酶 (heavy metal ATPase，HMA)廣泛存在于細菌、人及高等植物中，其在植物體內(nèi)主要參與重金屬Cu+、Ag+、Zn2+、Cd、Co2+與Pb2+轉(zhuǎn)運，其中HMA2/4在植物體內(nèi)Cd2+的長距離運輸中發(fā)揮著重要作用[12-15]。鑒于此，Guo等[10]從馬藺中克隆得到了重金屬ATP酶基因IlHMA2，但該基因在馬藺體內(nèi)Cd2+長距離運輸中的作用機制仍不清楚。

RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)是基因功能鑒定與基因表達調(diào)控研究常用的方法，已廣泛的應(yīng)用于水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)等多種作物中[16-17]。Hannon[18]在牽牛花(Pharbitisnil)轉(zhuǎn)基因的研究中首次發(fā)現(xiàn)共抑制沉默現(xiàn)象，并認為與甲基化作用有關(guān)。Fire等[19]在研究RNA干擾所需的結(jié)構(gòu)和傳遞條件的試驗中發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA誘導(dǎo)抑制同源性序列基因表達比任意一個單獨的正義鏈或反義鏈效果好。RNAi具有高效性、特異性和遺傳性，通過抑制靶基因的表達，獲得部分功能喪失的突變體，進而研究該基因與細胞發(fā)育、分化及功能間的關(guān)系[17]。RNAi通過導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA同源序列的雙鏈RNA進而阻斷體內(nèi)特定基因的表達，促使mRNA降解，進而誘發(fā)基因沉默以達到鑒定該基因功能的目的[13,15,19-21]，如Shimizu等[22]利用RNAi沉默了水稻矮縮病毒的一個病毒原質(zhì)基質(zhì)蛋白基因Pns12，結(jié)果獲得了病毒抗性的轉(zhuǎn)基因水稻；郭志鴻等[23]用RNAi干擾技術(shù)創(chuàng)造高直鏈淀粉馬鈴薯(Solanumtuberosum)材料；馬建等[24]應(yīng)用RNAi干擾技術(shù)創(chuàng)造低脂肪氧化酶活性大豆(Glycinemax)新種質(zhì)。本研究以馬藺IlHMA2基因為靶標(biāo)，采用酶切連接的方法，構(gòu)建具有反向重復(fù)序列的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的IlHMA2基因-RNAi植物表達載體，旨在為研究IlHMA2基因在馬藺體內(nèi)Cd長距離運輸中作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用植物材料為8周齡的野生馬藺幼苗，種子采自北京市農(nóng)林科學(xué)院小湯山草資源試驗基地；根癌農(nóng)桿菌GV3101、pHANNIBAL載體與pART27載體由北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心實驗室保存。

1.2 主要試劑

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒、TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒、PCR擴增試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、TA克隆、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD@19-T Simple載體、大腸桿菌菌株EscherichiacoliDH5α、限制性內(nèi)切酶及其DNA marker等試劑盒均購自寶生物工程有限公司，引物合成購自上海生物工程有限公司，其它生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 植物的培養(yǎng)

選取色澤光亮飽滿的馬藺種子放于燒杯中，加入5%次氯酸鈉溶液中消毒5 min后，再置于40 ℃的水浴鍋中浸泡56 h。之后將其均勻播撒在裝有營養(yǎng)土和細沙(體積比為2∶1)的小缽中，并放置入人工氣候箱培養(yǎng)(如同下述光照培養(yǎng)條件)。長至6周齡時，挑選長勢一致的幼苗將其沖洗干凈移入水培盒(長19 cm、寬13.5 cm、高7.5 cm)中，澆灌Hoagland營養(yǎng)液[0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，2 mmol·L-1KNO3，92 μmol·L-1H3BO3，0.5 mmol·L-1NH4H2PO4，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.1 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.5 mmol·L-1Fe-citrate，18 μmol·L-1MnC12·4H2O，0.25 mmol·L-1MgSO4·7H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O]繼續(xù)培養(yǎng)兩周，營養(yǎng)液每3 d更換一次。培養(yǎng)室光照培養(yǎng)16 h(晝)25 ℃/8 h(夜)18 ℃，光強約為600 μmol·(m2·s)-1，空氣相對濕度為50%～80%[9]。

1.4IlHMA2基因RNAi靶位片段的獲得

將培養(yǎng)至8周齡的馬藺幼苗移入含100 mg·L-1CdCl2·2.5H2O的營養(yǎng)液中，進行脅迫處理24 h后，剪其根部經(jīng)無菌水沖洗后，置于消毒濾紙上迅速吸干水分進行取樣，取樣量為200 mg，于液氮中充分研磨，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA，利用Prime Script RTase cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。首先通過酶切位點分析，根據(jù)RNAi目標(biāo)序列選取原則，確定siRNA序列，再通過Blast進行同源序列的對比，而后利用OligoEngine 2.0軟件對IlHMA2基因(GenBank登錄號：KY696282)的靶位區(qū)段進行篩選，并結(jié)合IlHMA2基因結(jié)構(gòu)特點，最終確定第1 261～1 682 bp處共422 bp為最佳靶片段，然后利用Primer 5.0軟件設(shè)計兩對特異性引物分別為P1和P2、P3和P4，分別在上下游引物處引入酶切位點(XhoⅠ和KpnⅠ、XbaⅠ與和ClaⅠ)以便連入載體pHANNIBAL。

P1:5′-CCCTCGAGTCTGTCCTATTGGCTGCC-3′;

P2:5′-GGGGTACCAGTGCTATCTCCAGTAAG-3′;

P3:5′-GCTCTAGATCTGTCCTATTGGCTGCC-3′;

P4:5′-CCATCGATAGTGCTATCTCCAGTAAG-3′.

PCR擴增反應(yīng)體系：在50 μL PCR管中依次加入2×Gflex PCR Buffer (Mg2+，dNTP plus)25 μL、Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL、P1和P2(或P3和P4)各1 μL、cDNA 4 μL，加水補至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，并使用寶生物DNA膠回收試劑盒對其進行回收和純化。隨后利用寶生物Mighty TA-cloning Reagent Set試劑盒對回收得到的PCR純化產(chǎn)物3′平末端加A，而后立即將加A產(chǎn)物連接到pMD@19-T Simple載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，將其涂布于含有50 mg·L-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基37 ℃黑暗倒置培養(yǎng)，次日進行陽性克隆藍白斑篩選，將轉(zhuǎn)化后白斑菌株進行質(zhì)粒PCR鑒定確認陽性克隆后，編號送去測序。

1.5 RNAi表達載體構(gòu)建

用XhoⅠ與KpnⅠ雙酶切pMD@19-T Simple載體并回收正向小片段G1，與用同樣雙酶切的pHANNIBAL載體連接，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，獲得重組質(zhì)粒pHG1。然后，再用XbaⅠ與ClaⅠ雙酶切pMD@19-T Simple載體并回收反向小片段G2，與用同樣雙酶切的pHG1載體連接，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，獲得具有CaMV35S-G1-PDK intron-G2-OCS terminator發(fā)卡反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pHG1G2(圖1)。

用SacⅠ/SpeⅠ雙酶切表達載體pART27并回收大片段，與用同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pHG1G2連接，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，獲得具有片段G正反向重復(fù)序列的植物RNAi表達載體pARTG(圖2)。

1.6 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用凍融法將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1壯觀霉素和50 mg·L-1利福平)，28 ℃避光倒置培養(yǎng)，2～3 d后長出單菌落，用接種環(huán)挑取單菌落，接種于10 mL含50 mg·L-1卡那霉素、50 mg·L-1壯觀霉素和50 mg·L-1利福平的液體LB培養(yǎng)基中，振蕩過夜培養(yǎng)。而后提取質(zhì)粒，用特異引物P5和P6擴增內(nèi)含子intron基因片段，長度473 bp。

P5:5′-TATGACAAGTGATGTGTAAGACG-3′;

P6:5′-AATAAGAATGTTGATTGAAAAT-3′.

PCR擴增反應(yīng)體系：在50 μL PCR管中依次加入2×Gflex PCR Buffer (Mg2+，dNTP plus) 25 μL、Tks Gflex DNA Polymerase 1 μL、P5和P6各1 μL、質(zhì)粒2 μL，加水補至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。確認陽性克隆后，擴大培養(yǎng)保存在-80 ℃冰箱備用。

圖1 中間載體pHANNIBAL-G1G2的構(gòu)建圖

1.7 馬藺幼苗遺傳轉(zhuǎn)化

參考Ma等[25]的方法和Weeks等[26]，略有修改。具體如下：在上述Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)3周齡大小的馬藺幼苗，在其根莖結(jié)合點2～3 cm處去除地上部，然后用注射器針頭將攜帶pARTG1G2質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌液(OD=0.4～0.5)注射至傷口處，并用無菌脫脂棉輕輕包裹住傷口，置于黑暗中培養(yǎng)；期間，每隔45 min用其菌液打濕脫脂棉一次，使得其脫脂棉在3 h內(nèi)保持濕潤，4 d后去除脫脂棉；大約兩周后馬藺幼苗傷口處長出嫩葉，轉(zhuǎn)入至Hoagland營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)4周后即可用于檢測轉(zhuǎn)基因植株T0，共轉(zhuǎn)化300株幼苗。野生型株系(WT)采用上述方法用空載pART27根癌農(nóng)桿菌GV3101侵染。而后，使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒提取WT和T0植株葉片的總DNA，用特異引物P5和P6擴增內(nèi)含子intron基因片段，長度473 bp。PCR擴增反應(yīng)體系如上所述。

圖2表達載體pART27-G1G2構(gòu)建圖

2 結(jié)果與分析

2.1IlHMA2基因RNAi靶位片段的選擇及擴增

以馬藺根系總RNA cDNA為模板，用設(shè)計的特異性引物P1和P2、P3和P4分別進行PCR擴增，并對其PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在400 bp左右處有一條亮帶，且上下無雜帶，與目的片段的大小一致。將其進行膠回收純化后，連接到pMD@19-T Simple克隆載體上，并轉(zhuǎn)化到DH5α中。從轉(zhuǎn)化的平板上隨機挑取多個陽性克隆進行編號處理，從中任選3個質(zhì)粒進行提取，通過PCR檢測，顯示得到的擴增片段大小約在400 bp處(圖3)，送去測序得到的結(jié)果與克隆到的HMA2 cDNA片段比對同源性為100%，表明已成功克隆到目的靶位片段。

圖3 IlHMA2基因片段的擴增產(chǎn)物

2.2 以IlHMA2基因為靶標(biāo)的RNAi載體構(gòu)建

通過酶切連接的方法，構(gòu)建了具有啟動子CaMV35S的IlHMA2反向重復(fù)序列的植物RNAi表達載體pARTG。根據(jù)構(gòu)建的pARTG載體上的限制性酶切位點分別對其進行酶切分析鑒定。經(jīng)XhoⅠ/KpnⅠ和KpnⅠ/ClaⅠ雙酶切后，在422和800 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖4，泳道1和泳道2)，分別與正向片段G1和PDK intron片段大小相符；經(jīng)XbaⅠ/ClaⅠ雙酶切后，在422 bp處也出現(xiàn)了目的條帶(圖4，泳道3)，與反向片段G2相符；經(jīng)XhoⅠ/ClaⅠ雙酶切后，在大約1 700 bp處出現(xiàn)特異條帶(圖4，泳道4)，與G1-PDK intron-G2片段大小相符；最后經(jīng)SacⅠ/SpeⅠ雙酶切后，在約4 500 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖4，泳道5)，與CaMV35S-G1-PDK intron-G2-OCS termina-tor片段大小相符。以上結(jié)果表明，IlHMA2基因RNAi植物表達載體IlHMA2-RNAi構(gòu)建成功。

圖4 馬藺HMA2-RNAi載體的雙酶切驗證

2.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及其IlHMA2-RNAi株系分子鑒定

用凍融法將重組質(zhì)粒pARTG1G2導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，挑取單克隆，隨后從這些陽性克隆編號中任選3個進行質(zhì)粒提取，通過特異引物P5和P6進行PCR擴增，凝膠泳檢測出473 bp目的片段，證實重組表達載體已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中(圖5)。

圖5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化陽性克隆PCR檢測

提取上述WT和T0葉片的總DNA，用intron基因特異引物對它們進行PCR擴增，擴增得到473 bp片段的僅有15株T0代株系，轉(zhuǎn)化率為5%(圖6)，這為后續(xù)驗證馬藺IlHMA2基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖6 馬藺IlHMA2-RNAi轉(zhuǎn)化株系的PCR檢測

3 討論與結(jié)論

在RNA干擾機制中，分為起始、效應(yīng)和信號擴增3個階段。通常只需少量siRNA就可以使得特定的基因發(fā)生沉默[27-29]。這種沉默效應(yīng)可在植物的胞間連絲與韌皮部進行擴散，通過嫁接將沉默效應(yīng)在砧木和接穗之間雙向傳遞，甚至在不同的物種個體間也可傳遞。RNA靶區(qū)的擴散是從起始siRNA同源區(qū)擴散向臨近的5′和3′端[30]。構(gòu)建高效表達載體是進行植物遺傳轉(zhuǎn)化的前提，必須在適當(dāng)?shù)拿盖形稽c連接上目的基因，而強啟動子下游插入反向重復(fù)片段是最有效的雙鏈RNA的表達載體構(gòu)件[32-33]。本研究中PCR擴增的HMA2 cDNA片段分別以正向和反向插入雙元植物表達載體，由強啟動子驅(qū)動，正反片段由內(nèi)含子intron序列隔開以維持載體的穩(wěn)定性；該系統(tǒng)在植物細胞中轉(zhuǎn)錄后可形成帶有一個30～50 bp環(huán)的ihpRNA，高水平轉(zhuǎn)錄形成雙鏈結(jié)構(gòu)引發(fā)RNAi，從而抑制HMA2的翻譯。沉默的效果遠遠高于反義的或共抑制結(jié)構(gòu)[33-34]。

選取目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)序列以及位置，載體結(jié)構(gòu)不同，得到的dsRNA所產(chǎn)生的效應(yīng)存在著顯著差異[33]。通常針對靶基因設(shè)計反向重復(fù)序列，構(gòu)建成含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈hpRNA或含內(nèi)含子的ihpRNA表達載體[35]，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，通讀反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄形成dsRNA，進而誘導(dǎo)RNAi的產(chǎn)生。Helliwell等[36]發(fā)現(xiàn)ihpRNA表達載體比hpRNA沉默效率高，且其發(fā)夾結(jié)構(gòu)臂序列的長度在100～1 200 bp，具有一定的可塑性；靶基因序列還應(yīng)在基因轉(zhuǎn)錄起始位點下游100個核苷酸以后，且GC含量在40%～52%內(nèi)[37]，這樣dsRNA才能夠高效、特異地發(fā)揮基因沉默作用[38-40]。本研究中構(gòu)建的RNAi載體的兩個反向重復(fù)序列臂間具有內(nèi)含子，且兩臂長度也在100～1 200 bp，選取的IlHMA2基因靶基因序列GC含量為42%。因此，理論上構(gòu)建的RNAi干擾載體能夠有效沉默IlHMA2基因。

目前，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種技術(shù)較為完善且有效的轉(zhuǎn)基因方法。但由于單子葉植物不是根癌農(nóng)桿菌的天然宿主，因此阻礙了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化研究方面的應(yīng)用。隨著人們對農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化機理、影響因素不斷探索與研究，使得根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法被逐步應(yīng)用于單子葉植物中，尤其是禾本科作物[41-42]。選擇合適的農(nóng)桿菌菌株與高效的表達載體是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中至關(guān)重要的因素。而對于不同的外植體其細胞生長狀態(tài)、生活時期、生理代謝及基因表達都存在一定程度上的差異，因而不同生理狀態(tài)下的細胞對農(nóng)桿菌的敏感性及農(nóng)桿菌對該受體植物的感染性都不同。本研究，借鑒Ma等[25]和Weeks等[26]的RNAi農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，用農(nóng)桿菌侵染馬藺幼苗的根莖結(jié)合位點傷口處，以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到了馬藺IlHMA2-RNAi轉(zhuǎn)化株系，說明選擇適合的RNAi轉(zhuǎn)化的方法，可有效地提高農(nóng)桿菌侵染單子葉植物的轉(zhuǎn)化效率。以上這些結(jié)果，將為解析IlHMA2介導(dǎo)的Cd長距離運輸在馬藺適應(yīng)鎘污染環(huán)境中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

Construction of RNAi expression vector of heavy metal ATPases geneHMA2 and genetic transformation inIrislactea

Zhang Ya-nan1,2, Lin Yin-ding1, Meng Li2, Mao Pei-chun2, Tian Xiao-xia2, Guo Qiang2

(1.Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2.Beijing Research and Development Center for Grasses and Environment, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097, China)

Heavy metal ATPasesHMA2 mediated Cd long-distance transport plays important roles in the distribution and detoxification of Cd2+in plants. However, the molecular mechanism underlying Cd2+long-distance transport inIrislactearemains unknown. Total RNA was extracted from the roots ofI.lacteato obtain a fragment ofIlHMA2 by RT-PCR. Then RNAi expression vector pARTG1G2 with inverted repeats ofHMA2 driven by the promoter CaMV35S was constructed based on the intermediate vector pHANNIBAL and the plant expression vector pART27 by restriction enzyme digestion and ligation. Moreover, the recombinant plasmid was transformed into agrobacterium GV3101 by freezing and thawing method, and then was transformed intoI.lacteato obtainIlHMA2-RNAi lines. This would be a good basis for clarifying theIlHMA2 mediated Cd2+long distance transport in the adaptation ofI.lacteato Cd2+contaminated environments.

Irislactea; heavy metal ATPases; Cadmium accumulation and tolerance; RNAi vector construction

Lin Yin-ding E-mail:sxnd_lyd@sohu.com Guo Qiang E-mail:guoqiang@grass-env.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0571

張亞楠,藺銀鼎,孟林,毛培春,田小霞,郭強.馬藺重金屬ATP酶基因HMA2的RNAi載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化.草業(yè)科學(xué),2017,34(5)：988-996.

Zhang Y N,Lin Y D,Meng L,Mao P C,Tian X X,Guo Q.Construction of RNAi expression vector of heavy metal ATPases geneHMA2 and genetic transformation inIrislactea.Pratacultural Science，2017,34(5)：988-996.

2016-11-15 接受日期：2017-01-17

北京市自然科學(xué)基金(6152008)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20140103、KJCX20170110)

張亞楠(1990-)，女，山西晉城人，在讀碩士生，主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail:972388289@qq.com

藺銀鼎(1955-)，男，山西臨汾人，教授，博士，主要從事園林生態(tài)與景觀規(guī)劃設(shè)計研究。E-mail:sxnd_lyd@sohu.com共同通信作者：郭強(1981-)，男，甘肅天水人，助理研究員，博士，主要從事草類植物逆境生理與基因工程研究。E-mail:guoqiang@grass-env.com

Q943.2

A

1001-0629(2017)05-0988-09