李林豐，崔麗娟，劉 智，夏 勤，秦海銀，何 嬌

(遂寧市中心醫(yī)院病理科,四川遂寧 629000)

論著·臨床研究

細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子2在乙型肝炎相關(guān)性肝癌患者中的表達(dá)意義

李林豐，崔麗娟△，劉 智，夏 勤，秦海銀，何 嬌

(遂寧市中心醫(yī)院病理科,四川遂寧 629000)

目的 研究細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子2(cIAP2)在乙型肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝)和非乙肝相關(guān)性肝癌患者中表達(dá)的意義。方法 收集該院肝癌切除術(shù)患者的病例資料和組織標(biāo)本，分別利用免疫組織化學(xué)和Western blot方法檢測(cè)患者肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 在兩組患者中肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織中，cIAP2的表達(dá)量依次下降。但是，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2表達(dá)顯著低于肝癌癌灶和癌旁，而在乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2表達(dá)量與癌旁的cIAP2表達(dá)量無(wú)明顯差異，卻低于癌灶的cIAP2表達(dá)量。結(jié)論 cIAP2是引起乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，可作為乙肝相關(guān)性肝癌患者抑制肝癌發(fā)展和清除乙肝病毒潛在的治療靶點(diǎn)。

癌,肝細(xì)胞；肝炎病毒，乙型；細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子2

乙型肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝)病毒(hepatitis B virus，HBV)是肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[1]。經(jīng)手術(shù)治療后的乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)HBV仍持續(xù)復(fù)制，是肝癌治療耐受的主要因素[2]。細(xì)胞凋亡蛋白抑制因子2(cellular inhibitor of apoptosis proteins 2，cIAP2)具有內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡作用[3-4]。同時(shí)，cIAP2抑制劑能明顯降低乙肝模型小鼠血清中的HBV DNA水平[5-6]。這表明，促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡可以減少HBV的復(fù)制。而目前少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者和非乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者cIAP2的表達(dá)區(qū)別。因此，本研究通過(guò)比較乙肝和非乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者癌灶組織內(nèi)cIAP2的差異表達(dá)，為肝癌患者差異性治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年5月到2015年5月內(nèi)在本院進(jìn)行肝癌切除的組織標(biāo)本[包括肝癌癌灶、癌旁(癌灶邊緣2 cm)和遠(yuǎn)癌旁肝組織中(癌灶邊緣2～5 cm)]，乙肝和非乙肝相關(guān)性肝癌共23例。全部患者術(shù)前均是首次進(jìn)行肝癌切除術(shù)，未進(jìn)行放療和化療治療?；颊咝g(shù)前均進(jìn)行完善的影像學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)，術(shù)后均進(jìn)行病理學(xué)檢查確認(rèn)病灶為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。肝癌病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批。最終，本研究總共納入23例原發(fā)性肝癌患者，其中15例為乙肝相關(guān)性肝癌組，8例為非乙肝相關(guān)性肝癌組。

1.2 試劑 抗兔cIAP2抗體(ab32059)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司?？雇忙?actin抗體(BA2305)、山羊抗兔結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶二抗(BA1055)、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(AR0146)和哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒(AR0101)均購(gòu)自武漢博士德生物公司。超敏型ECL檢測(cè)試劑盒(KGP1126)購(gòu)自南京凱基公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-9001/PV-9002)和DAB顯色試劑盒(PV-9000)均購(gòu)自北京中衫金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè) 肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織中用多聚甲醛常規(guī)固定48 h后，進(jìn)行石蠟包埋，制作成3～5 μm石蠟切片。常規(guī)進(jìn)行脫蠟至水后進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。免疫組化染色嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，即進(jìn)行枸鹽酸煮沸法抗原修復(fù)和3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性后，

表1 患者一般情況的比較

5%牛血清蛋白封閉30 min，滴加抗兔cIAP2抗體(稀釋比例1∶200)并4 ℃過(guò)夜，然后滴加二抗(1∶2 000)，最后再用DAB顯色劑顯色之后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，透明、干燥、封片后顯微鏡下觀察。染色結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0(USA，Media Cybernetics)進(jìn)行分析，每張片子取5個(gè)點(diǎn)，最終取平均值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)的水平。

1.3.2 Western blot檢測(cè) 每100 mg的肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織中用哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白后，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按每個(gè)樣本50 μg的蛋白質(zhì)上樣，每孔均等質(zhì)量等體積加入上樣孔進(jìn)行SDS-PAGE電泳：100 V恒壓電泳90 min；濕轉(zhuǎn)至PVDF膜中，5% 牛血清蛋白室溫封閉90 min；加抗兔cIAP2抗體(1∶1 000)或抗兔β-actin抗體(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后，加山羊抗兔結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h。洗滌后，ECL試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光檢測(cè)。半定量分析：用Image Lab軟件掃描已扣除背景的目的條帶和相應(yīng)組別的β-actin條帶的灰度值，然后進(jìn)行比較，所得的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況及術(shù)后并發(fā)癥 乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組中，12例最終病理診斷為高分化HCC，3例診斷為中低分化HCC；6例術(shù)后病理切片提示微血管侵犯。非乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌組中，5例最終病理診斷為高分化HCC，3例診斷為中低分化HCC；2例病理切片提示微血管侵犯。兩組患者除HBV DNA水平存在差異之外，其余一般情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。兩組患者均無(wú)手術(shù)相關(guān)死亡病例，其中6例患者出現(xiàn)手術(shù)相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥(26.09%)，肺炎3例(13.04%)，調(diào)整抗生素后痊愈；斷面積液伴感染2例(8.70%)，行穿刺引流術(shù)后痊愈；膽漏1例(4.25%)，保守治療后好轉(zhuǎn)出院。

2.2 免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，在兩組患者中肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織中，cIAP2的表達(dá)量依次下降。但是，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2表達(dá)顯著低于肝癌癌灶和癌旁(P<0.05)，而在乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2表達(dá)量與癌旁的cIAP2表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，卻低于癌灶的cIAP2表達(dá)量(P<0.05)，見(jiàn)圖1。并且，在非乙肝相關(guān)性肝癌組中，遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達(dá)量顯著低于乙肝相關(guān)性肝癌組遠(yuǎn)癌旁肝組織的cIAP2蛋白表達(dá)量(P<0.05)，而兩組癌灶的cIAP2蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相似，見(jiàn)圖2。

A：遠(yuǎn)癌旁肝組織;B：癌旁組織;C：肝癌癌灶;D：兩組患者免疫組化的結(jié)果后得到的積分光密度累計(jì)值；1～3：非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織的cIAP2免疫組化染色的積分光密度累計(jì)值；4～6：乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織的cIAP2免疫組化染色的積分光密度累計(jì)值。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織內(nèi)cIAP2的蛋白表達(dá)

A:Western blotting法檢測(cè)分別檢查非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織；癌旁組織和癌組織(1～3)和乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織(4～6)的cIAP2蛋白表達(dá)；B：Image Lab軟件分別檢測(cè)非乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織，癌旁組織和癌組織(1～3)和乙肝相關(guān)性肝癌組中遠(yuǎn)癌旁肝組織、癌旁組織和癌組織(4～6)的cIAP2蛋白印記的灰度值。

圖2 Western blot檢測(cè)組織內(nèi)cIAP2的蛋白表達(dá)

2.3 相關(guān)性分析 對(duì)cIAP2在乙肝相關(guān)性和非乙肝性相關(guān)性肝癌癌灶、癌旁和遠(yuǎn)癌旁肝組織的表達(dá)量與術(shù)前臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：乙肝相關(guān)性肝癌組中Western blot檢測(cè)癌旁cIAP2水平與術(shù)前ALT水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.586，P=0.022)；非乙肝相關(guān)性肝癌組中免疫組化檢測(cè)癌灶cIAP2水平與術(shù)前IGG15呈正相關(guān)(r=0.632，P=0.007)。其余指標(biāo)與cIAP2水平無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明cIAP2與HBV載量可能是肝細(xì)胞向癌細(xì)胞惡變的主要因素之一。

3 討 論

cIAPs家族包括cIAP1和cIAP2等，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[7]。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)cIAPs的高表達(dá)，cIAP1和cIAP2通過(guò)抵抗腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TRAIL)的作用來(lái)抑制癌細(xì)胞的凋亡[8-9]。cIAP1和cIAP2還可以通過(guò)抑制caspase家族的活化抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。Wu等[11]的研究認(rèn)為，用cIAPs的拮抗劑作用于結(jié)腸癌細(xì)胞后可以觀察到caspase-8激活并誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Weber等[12]研究證實(shí)，用cIAPs的拮抗劑作用于黑色素瘤細(xì)胞后，可以觀察到caspase-8和NF-κB的激活并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此，cIAPs通過(guò)抑制caspase-8和NF-κB的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本次研究中，兩組患者肝癌癌灶和癌旁都發(fā)現(xiàn)高水平的cIAP2的表達(dá)，這與先前報(bào)道的結(jié)果相類(lèi)似。肝癌細(xì)胞由于基因組和遺傳的不穩(wěn)定性造成的無(wú)性增值的惡性組織，程序性凋亡被抑制，故而肝癌病灶中抑制腫瘤細(xì)胞凋亡蛋白cIAP2呈高表達(dá)。

本研究在癌灶組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2蛋白表達(dá)量于非乙肝相關(guān)性肝癌組相比無(wú)明顯差異，但是在遠(yuǎn)癌旁肝組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2的表達(dá)量較非乙肝相關(guān)性肝癌組的遠(yuǎn)癌旁肝組織明顯增高。這說(shuō)明感染HBV和不曾感染HBV患者發(fā)病因素的不同也會(huì)影響肝癌的發(fā)展和進(jìn)展，也說(shuō)明cIAP2可能是HBV誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的機(jī)制之一。Ebert等[5]研究表明cIAP2在HBV感染模型小鼠中下調(diào)TNF-α的表達(dá)，并抑制肝細(xì)胞的凋亡以及是導(dǎo)致抗病毒耐藥的原因之一。在敲除cIAP1和cIAP2的小鼠中，HBV復(fù)制均被抑制，但是只有完全敲除cIAP2的小鼠中HBV復(fù)制才可能被明顯抑制[5]。同時(shí)，有研究還發(fā)現(xiàn)用特異性cIAP2抑制劑作用于HBV感染小鼠時(shí)，肝內(nèi)及血清中HBV表面抗原迅速下降，并且HBV核心抗原明顯被抑制[6]，這說(shuō)明抑制cIAP2的表達(dá)能清除體內(nèi)HBV。因此，cIAP2是HBV感染促進(jìn)正常肝組織向肝癌發(fā)展的重要機(jī)制之一，本研究中在遠(yuǎn)癌旁肝組織中，乙肝相關(guān)性肝癌組的cIAP2的表達(dá)量較非乙肝相關(guān)性肝癌組的遠(yuǎn)癌旁肝組織明顯增高的結(jié)果也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。

綜上所述，cIAP2誘導(dǎo)乙肝相關(guān)性肝癌發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一。因此，cIAP2可作為乙肝相關(guān)性肝癌患者抑制肝癌發(fā)展和清除HBV的治療潛在靶點(diǎn)。

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Expression significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 in patients with hepatitis B related HCC

LiLinfeng,CuiLijuan△,LiuZhi,XiaQin,QinHaiyin,HeJiao

(DepartmentofPathology,SuiningMunicipalCentralHospital,Suining,Sichuan629000,China)

Objective To investigate the significance of cellular inhibitor of apoptosis proteins 2 (cIAP2) expression in the patients with hepatitis B and non- hepatitis B related hepatocellular carcinoma (HCC).Methods The medical record data and tissue samples in the patients with HCC resection operation were collected.Expression of cIAP2 in HCC cancer lesion,adjacent tissues and cancer-distant tissues was detected by immunohistochemical staining and Western blotting.Results In the cancer lesion,paracancerous tissues and cancer-distant tissues of the two groups,the cIAP2 expression amount was decreased in turn.But in the non-hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression in the cancer- distant tissues was significantly lower than that in the HCC cancer lesion and paracancerous tissues,while in the hepatitis B related HCC group,the cIAP2 expression amounts had no significant difference between the caner-distant tissues and paracancerous tissues,while lower than that in the cancer lesion.Conclusion cIAP2 is one of important mechanisms causing hepatic B related HCC and can serve as a therapeutic target point for inhibiting HCC development and eliminating hepatitis B virus.

carcinoma,hepatocellular;hepatitis virus,type B;cellular inhibitor of apoptosis proteins 2

李林豐(1982-)，主管技師，主要從事器官疾病病理診斷及肝臟疾病病理機(jī)制研究。△

，E-mail:llf0166@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.016

R735.7

A

1671-8348(2017)10-1349-03

2016-11-20

2017-01-31)