段金旗，馬麗瓊，劉遠(yuǎn)林，任 煒，陳媛媛，李春巖

(1.張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河北張家口 075000；2.解放軍251醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050000)

·論 著·

TERT基因轉(zhuǎn)染BMSC血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響*

段金旗1，馬麗瓊2，劉遠(yuǎn)林1，任 煒1，陳媛媛1，李春巖3

(1.張家口學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河北張家口 075000；2.解放軍251醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050000)

目的 探討端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)對(duì)血管性癡呆大鼠記憶功能及海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響。方法 60只大鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、常規(guī)BMSC組(C組)和轉(zhuǎn)染BMSC組(D組)；采用Morris迷宮測(cè)試、RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 C組、D組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于B組；D組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于B組。與A組比較，B組、C組、D組腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) mRNA、TERT mRNA、突觸前區(qū)突觸素(SYP)mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低，A組大鼠突觸間隙排列清晰，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多；D組突觸間隙更為清晰，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和突出間隙排列結(jié)構(gòu)都接近于A組。結(jié)論 TERT轉(zhuǎn)染BMSC對(duì)血管性癡呆大鼠的治療作用明顯，其作用機(jī)制與促進(jìn)BDNF、TrkB表達(dá)、改善突觸的可塑性有關(guān)。

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；癡呆,血管性；記憶功能；突觸；可塑性

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是腦血管病所誘發(fā)的智力損害，目前VD已經(jīng)成為老年期癡呆的主要病因之一[1-2]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cell,BMSC)具有促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞分化能力，是一種理想的種子細(xì)胞[3]。有報(bào)道稱對(duì)腦缺血大鼠移植BMSC能夠促進(jìn)腦組織重塑和血管再生[4]；然而在移植BMSC過(guò)程中常發(fā)生BMSC衰老、凋亡以及增殖不穩(wěn)定情況，表現(xiàn)為突觸前區(qū)突觸素(synaptophysin,SYP)數(shù)量、密度顯著降低，這可能與端粒酶活性降低有關(guān)[5]。鑒于此，本研究將端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)轉(zhuǎn)染的BMSC移植至VD大鼠中，觀察大鼠的行為學(xué)及海馬CA1區(qū)SYP、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)其受體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)變化水平，旨在為VD的治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究成果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 本研究設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及操作均經(jīng)張家口學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。60只健康SD級(jí)成年雄性大鼠購(gòu)自河北北方學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量240～310 g，平均(278.5±13.7)g。所有大鼠均常規(guī)自由進(jìn)食進(jìn)水，喂養(yǎng)室溫20～22 ℃，空氣濕度50%，光照12 h后黑暗12 h晝夜交替，待飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑 Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；TERT、BMSC均購(gòu)自上海桑尼生物科技有限公司；BDNF、TrkB、SYP抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；H-7650透射電鏡購(gòu)自日本日立公司；Nucleofector Ⅱ細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀瑞士Lonza公司。

1.3 方法

1.3.1 VD大鼠模型的制備 60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為陰性對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、常規(guī)BMSC組(C組)和轉(zhuǎn)染BMSC組(D組)，每組各15只；其中陰性對(duì)照組不給于任何干預(yù)措施，VD大鼠模型制備方法：采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈(2-VO)法[6]：術(shù)前大鼠禁水4 h、禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛(注射劑量：0.5 mL/100 g)；待大鼠麻醉后置于操作臺(tái)上，取出頸部毛，常規(guī)消毒將于頸部正中做一約2～3 cm切口，皮下組織鈍性分離后將氣管充分暴露，用眼科鑷將氣管兩側(cè)頸總動(dòng)脈逐層分離并顯露，再采用3-0縫合線將雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，確認(rèn)結(jié)扎成功后縫合傷口，并涂抹萬(wàn)古霉素消毒。大鼠蘇醒后常規(guī)進(jìn)食進(jìn)水，檢測(cè)大鼠生命體征并觀察行為變化。術(shù)后第2天將存活的大鼠進(jìn)行Morris迷宮測(cè)試，大鼠平均逃避潛伏期大于2倍對(duì)照組大鼠平均逃避潛伏期判定為VD大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 TERT轉(zhuǎn)染BMSC 將BMSC接種于6孔板中，分為3組：對(duì)照組、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(plxsn)組，plxsn-TERT組，待細(xì)胞匯合率達(dá)到90%時(shí)，分別于每孔加入3 μg載體、Lipofectamine 2000 10 mL、LDMEM培養(yǎng)基3 mL，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行傳代(1∶10)，轉(zhuǎn)染48 h后加入G418(200 μg/mL)篩選。

1.3.3 BMSC細(xì)胞移植 A組和B組不注射任何藥物，常規(guī)喂養(yǎng)；常規(guī)BMSC組尾靜脈注射1 mL BMSC(濃度：4×106個(gè)/mL)，轉(zhuǎn)染BMSC組組尾靜脈注射1 mL TERT-BMSC(濃度：4×106個(gè)/mL)；注射后常規(guī)喂養(yǎng)6周。

1.4 觀察指標(biāo) (1)移植2個(gè)月后對(duì)4組大鼠采用Morris迷宮測(cè)試[7-9]：①定位航行測(cè)試，將大鼠分別從4個(gè)象限放入水中，記錄大鼠的逃避潛伏期；②空間探索測(cè)試：撤去平臺(tái)，記錄120 s內(nèi)大鼠在第一象限停留的時(shí)間。(2)將大鼠處死，快速切取大鼠海馬CA1區(qū)組織，采用Trizol法提取腦組織RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR法檢測(cè)組織中BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達(dá)水平。RT-PCR總反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA 3 μL，上下游引物0.5 μL。設(shè)置PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，總計(jì)30個(gè)循環(huán)；各引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。(3)采用蛋白免疫印跡檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)：取各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織200 g，加入1 mL蛋白酶抑制劑，提取總蛋白。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各蛋白，再將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上25 mA恒流過(guò)夜。分別加入BDNF、TrkB、SYP一抗室溫孵育2 h，再加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h，最后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的actin抗體，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，圖片掃描保存，計(jì)算目的蛋白相對(duì)含量，其中目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參actin蛋白灰度值。(4)切取海馬CA1區(qū)腦組織，常規(guī)固定、切片、染色后，用透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 A組大鼠均正常喂養(yǎng)，全部存活；B組有3只大鼠在行頸總動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)死亡，其余12只存活；C組有2只在頸總動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)死亡，2只因腹腔感染死亡，其余11只存活；D組1只在頸總動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)死亡，1只在注射TERT-BMSC后第2天不明原因死亡，其余13只存活；各組存活大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況良好。

表1 RT-PCR各引物序列及長(zhǎng)度

2.2 TERT mRNA表達(dá)及端粒酶活性與對(duì)照組和plxsn組比較 plxsn-TERT組TERT mRNA表達(dá)水平顯著升高，端粒酶活性也顯著上升，見(jiàn)圖1～2。

1：對(duì)照組；2：plxsn組；3：plxsn-TERT組。

圖1 各組TERT mRNA表達(dá)水平

1：對(duì)照組；2：plxsn組；3：plxsn-TERT組。

圖2 各組端粒酶活性

2.3 各組大鼠Morris迷宮測(cè)試結(jié)果比較 B組、C組、D組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于A組，第一象限停留時(shí)間顯著少于A組(P<0.05)；C組、D組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于B組，第一象限停留時(shí)間顯著少于B組(P<0.05)；D組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于C組，第一象限停留時(shí)間顯著少于C組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達(dá)水平 與A組比較，B組、C組、D組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA均顯著降低(P<0.05)，其中D組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA顯著高于B組、C組(P<0.05)，C組BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA又顯著高于正常值(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

表2 各組大鼠Morris迷宮測(cè)試結(jié)果比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達(dá)水平

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF mRNA、TrkB mRNA、SYP mRNA表達(dá)水平

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較；c：P<0.05，與C組比較。

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較 B組、C組、D組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，其中D組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平顯著高于B組、C組(P<0.05)，C組BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平又顯著高于B組(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

2.6 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸素觀察結(jié)果比較 A組大鼠突觸間隙排列清晰，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多；B組突觸間隙排列紊亂，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少；C組突觸間隙較模型組更加有序，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量有所增加；D組突觸間隙更為清晰，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和突出間隙排列結(jié)構(gòu)都接近于A組；見(jiàn)圖5。

1：A組；2：B組；3：C組；4：D組。

圖4 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF、TrkB、SYP蛋白表達(dá)水平

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。

圖5 光鏡下突觸素觀察結(jié)果(×400)

3 討 論

目前已證實(shí)骨髓內(nèi)含量大量干細(xì)胞，其中BMSC能夠定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等中胚層來(lái)源細(xì)胞[10]。BMSC取材簡(jiǎn)單、培養(yǎng)方便、具有弱免疫原性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是理想的干細(xì)胞。Park等[11]對(duì)缺血性腦損傷大鼠移植BMSC，結(jié)果顯示大鼠損傷腦組織血管重新生成，部分腦組織也得以重塑。但是BMSC存在分化能力容易喪失、過(guò)度老化、增值不穩(wěn)定等情況。Veronesi等[12]學(xué)者對(duì)BMSC的生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行研究，最終提出BMSC多種生物學(xué)功能均與端粒酶活性有關(guān)，特別是其神經(jīng)保護(hù)功能的效果與端粒酶活性呈明顯正相關(guān)。端粒酶是核糖核蛋白酶的一種，在調(diào)節(jié)染色體的復(fù)制中發(fā)揮重要作用[13-14]。本研究亦證實(shí)經(jīng)過(guò)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染能夠使BMSC獲得更高的端粒酶活性，這對(duì)于提高BMSC的增殖速度、預(yù)防BMSC過(guò)度衰老凋亡具有重要作用。Jiang等[15]也證實(shí)將慢病毒攜帶的VEGF轉(zhuǎn)染至BMSC，BMSC的新生血管的形成和自身的增殖能夠顯著增強(qiáng)。

本研究對(duì)VD大鼠注射TERT轉(zhuǎn)染的BMSC，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染BMSC組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于常規(guī)BMSC組，第一象限停留時(shí)間顯著少于常規(guī)BMSC組，說(shuō)明相比較于普通BMSC替代治療，TERT轉(zhuǎn)染的BMSC治療VD后大鼠學(xué)習(xí)、記憶能夠改善更為明顯。Baranova等[16]證實(shí)BMSC能夠抑制興奮性氨基酸所產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用，使突觸傳遞功能重新恢復(fù)，從而改善因神經(jīng)元損傷所引起的學(xué)習(xí)、記憶功能損害。Kishi等[17]證實(shí)BNDF是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的主要營(yíng)養(yǎng)因子，敲除BNDF基因后大鼠發(fā)生VD的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。BNDF發(fā)揮相應(yīng)的作用有賴于與其特異性受體TrkB結(jié)合；Yasutake等[18]報(bào)道BNDF首先在組織中合成，然后順軸突運(yùn)輸至突觸間隙，并與間隙中受體TrkB結(jié)合，從而參與神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、分化，并對(duì)損傷的神經(jīng)元有恢復(fù)作用。本研究亦證實(shí)轉(zhuǎn)染BMSC組BDNF、TrkB表達(dá)水平顯著高于常規(guī)BMSC組，提示轉(zhuǎn)染BMSC對(duì)神經(jīng)元的修復(fù)作用與增強(qiáng)BDNF、TrkB表達(dá)有關(guān)。

Schroeter等[19]稱通過(guò)觀察突觸結(jié)構(gòu)的變化能夠反映出突觸結(jié)構(gòu)的可塑性。SYN是神經(jīng)元突觸前的特異性生物學(xué)標(biāo)志物，能夠促進(jìn)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，還能調(diào)節(jié)突觸傳遞效能；而突觸素是反映突觸數(shù)量、密度和分布的指標(biāo)之一[20]。本研究顯示轉(zhuǎn)染BMSC組SYN表達(dá)水平顯著高于常規(guī)BMSC組，電鏡下觀察轉(zhuǎn)染BMSC組突觸間隙更為清晰，SYN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和突出間隙排列結(jié)構(gòu)都接近于陰性對(duì)照組，說(shuō)明移植轉(zhuǎn)染BMSC能夠透過(guò)血腦屏障，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)和產(chǎn)生新生軸突和樹(shù)突，證實(shí)轉(zhuǎn)染BMSC能顯著改善VD動(dòng)大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性，這亦是治療VD的生物學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，相比于普通BMSC替代治療，TERT轉(zhuǎn)染BMSC對(duì)血管性癡呆大鼠的治療作用明顯，其作用機(jī)制與促進(jìn)BDNF、TrkB表達(dá)、改善突觸的可塑性有關(guān)。然而神經(jīng)元損傷修復(fù)的作用機(jī)制是個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括各種酶、鈣離子通道以及NMDAR1的磷酸化過(guò)程等，因此對(duì)其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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Effect of TERT gene transfected BMSC on memory function and hippocampal CA1 region synaptic plasticity in vascular dementia rat*

DuanJinqi1,MaLiqiong2,LiuYuanlin1,RenWei1,ChenYuanyuan1，LiChunyan3

(1.MedicalCollegeofZhangjiakouUniversity，Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.DepartmentofIntensiveCareMedicine,251HospitalofPLA，Zhangjiakou,Hebei075000,China;3.DepartmentofNeurology,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China)

Objective To explore the effect of telomerase reverse transcriptase(TERT) gene transfected bone marrow stem cell(BMSC)on the memory function and hippocampal CA1 region synaptic plasticity in vascular dementia rat.Methods A total of 60 rats were randomly divided into the negative control group(group A),model group(group B),conventional BMSC group(group C) and transfected BMSC group(group D).The related indicators in each group were detected by using the Morris maze test,RT-PCR and Western blot respectively.Results The escape latency period in the group C and group D was significantly longer than that in the group B,which in the group D was significantly longer than that in the group C.Compared with the group A,the expressions of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)mRNA,TERT mRNA,SYP mRNA and protein in the group B,group C and group D were significantly decreased.The synaptic cleft arrange in group A was clear with more SYN positive cells.The synaptic cleft in the group D was clearer,and the number of SYN positive cells was close to that in group A.Conclusion TERT transfected BMSC has obvious therapeutic effect on vascular dementia rats and its mechanism may be related to the promotion of BDNF,TrkB expression and the improvement of synaptic plasticity.

telomerase reverse transcriptase;bone marrow stromal stem cells;dementia,vascular;memory function;synaptic;plasticity

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171210)。 作者簡(jiǎn)介： 段金旗(1975-)，副教授，本科，主要從事急救醫(yī)學(xué)教學(xué)工作。

R743.9

A

1671-8348(2017)10-1300-04

2016-10-26

2017-01-21)