王元元，楊桂紅，楊 濤，唐書(shū)謙，伍津津△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.整形美容科；2.皮膚科，重慶 400042)

·論 著·

人表皮干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為汗腺樣上皮細(xì)胞的研究*

王元元1，楊桂紅2，楊 濤2，唐書(shū)謙2，伍津津2△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所：1.整形美容科；2.皮膚科，重慶 400042)

目的 探討體外人表皮干細(xì)胞向汗腺樣上皮分化的影響條件，并對(duì)誘導(dǎo)成的管腔樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。方法 將人表皮干細(xì)胞接種到復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)上和膠原凝膠中，加入不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，體外垂直震蕩培養(yǎng)，進(jìn)行三維培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化，采用HE染色、免疫熒光等手段觀察表皮干細(xì)胞定向分化為汗腺樣上皮的條件及形態(tài)、表型改變。結(jié)果 15～20 ng/mL的EGF可誘導(dǎo)組織工程真皮上的表皮干細(xì)胞向真皮內(nèi)生長(zhǎng)并可出現(xiàn)腺樣結(jié)構(gòu)。HE 染色該結(jié)構(gòu)，顯示為單層細(xì)胞連接為環(huán)狀，中間見(jiàn)明顯的腔隙，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性。利用CK19熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞團(tuán)中央有管腔結(jié)構(gòu)，同時(shí)此結(jié)構(gòu)表達(dá)CK18、癌胚抗原(CEA)。結(jié)論 體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞接種在組織工程真皮上，在一定濃度的EGF誘導(dǎo)條件下，能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，該管腔樣結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)上與在體汗腺分泌部細(xì)胞相似。

表皮干細(xì)胞；汗腺樣細(xì)胞；分化；表皮生長(zhǎng)因子

臨床上由于各種原因，如皮膚全層大面積燒傷、缺損和其他伴有汗腺發(fā)育和功能異常的疾病(如先天性外胚層發(fā)育不良等)，導(dǎo)致的汗腺結(jié)構(gòu)和功能缺失，排汗及體溫調(diào)節(jié)能力受限，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。盡管近年來(lái)組織工程化皮膚用于臨床治療，可以解決創(chuàng)面覆蓋的問(wèn)題，已取得了顯著效果，但迄今為止，還未研制出帶有皮膚附件(如汗腺、毛囊等) 的組織工程化皮膚，無(wú)法達(dá)到皮膚功能的重建[1]。表皮干細(xì)胞(ESC)是皮膚組織特異性干細(xì)胞，位于表皮基底層，在維持表皮更新，保持細(xì)胞恒定等方面起著重要作用。ESC具有多向分化潛能，體內(nèi)證實(shí)能夠向皮膚附屬器及表皮分化。若能在體外誘導(dǎo)ESC向汗腺分化，將為研究帶汗腺的組織工程皮膚提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本院自行研制的復(fù)方殼多糖組織工程真皮基質(zhì)凝膠是一種組織工程培養(yǎng)模型。利用此三維培養(yǎng)模型，本實(shí)驗(yàn)擬加入影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的因素，如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等，以促進(jìn)凝膠中的ESC向汗腺樣上皮分化。進(jìn)而尋找出ESC向汗腺樣上皮分化的合適培養(yǎng)條件，并對(duì)出現(xiàn)的管腔樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1 資料與方法

1.1 一般資料 包皮標(biāo)本取材于2009年5月至2010年4月在本院皮膚科醫(yī)學(xué)美容門(mén)診行包皮環(huán)切術(shù)的青年男性20例，平均年齡(23.56±2.43)歲，所有取材均取得患者同意并簽署知情同意書(shū)，本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審查(批號(hào)為20080312)。

1.2 主要試劑及儀器 K-SFM培養(yǎng)基，Ⅳ型膠原(美國(guó)Sigma公司)，中性分離酶(瑞士Roche公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)，杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基DMEM(美國(guó)Gibco公司)，EGF(美國(guó)Sigma公司)，殼多糖，兔抗人CEA抗體，鼠抗人CK18、19抗體，羊抗鼠IgG-FITC抗體(北京中杉公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 鼠尾膠原的制備 凍存300 g左右大白鼠鼠尾3根，于75%乙醇溶液中解凍1 h；去皮，D-Hanks液沖洗3遍，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于無(wú)菌的1%冰醋酸250 mL中，4 ℃保存48 h以上，其間反復(fù)振蕩；3 000 r/min離心1 h，取上清液；所得物位乳白色半透明黏稠液體，4 ℃貯存?zhèn)溆茫瑴y(cè)得濃度為20 mg/mL(濕質(zhì)量)。

1.3.2 復(fù)方殼多糖組織工程皮膚的制備及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 應(yīng)用酶消化法進(jìn)行人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，按照文獻(xiàn)所述方法獲得人表皮干細(xì)胞[2]。在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM；用1N 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4；在凝膠中加入成纖維細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)到105/mL；吸入24孔板培養(yǎng)板中，每孔1 mL，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，每孔輕輕加入1代表皮干細(xì)胞1 mL(濃度為8×105/mL)于凝膠上，最后再加入角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(KGM)，置37 ℃、5%CO2/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng)，每天換液1次；培養(yǎng)3 d后，用不銹鋼篩網(wǎng)支架抬高3 mm，行氣液界面培養(yǎng)，每日垂直振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2 cm；隔日添加下列因素：EGF 5、10、15、20 ng/mL，每組按3復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；培養(yǎng)16 d后，用4%多聚甲醛固定后行HE染色，觀察皮膚生長(zhǎng)情況，選取合適的濃度。

1.3.3 復(fù)方殼多糖組織工程凝膠的制備及鑒定 在冰浴條件下按比例混勻醋酸鼠尾膠原、殼多糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、彈性蛋白及濃縮DMEM；用1N 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4；在凝膠中加入1代表皮干細(xì)胞，細(xì)胞量同前；吸入24孔板培養(yǎng)板中，每孔1 mL，放入孵箱內(nèi)待形成凝膠后，再加入KGM，置37 ℃、5%CO2/95%空氣、90%以上濕度孵箱培養(yǎng)，每天換液1次；每日垂直振蕩，振蕩頻率為75次/分，振幅為2 cm；加入上述定向誘導(dǎo)分化條件篩選出的合適濃度。對(duì)復(fù)方殼多糖組織工程凝膠進(jìn)行如下鑒定：(1)按常規(guī)進(jìn)行 HE 染色；(2)免疫熒光觀察：將凝膠置于4%多聚甲醛中固定2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3次；加一抗工作液[CK19、CK18、癌胚抗原(CEA)]，濕盒內(nèi) 37℃孵箱內(nèi)放置30 min，PBS漂洗5 min×3次；加入熒光標(biāo)記的抗體羊抗鼠 IgG-FITC 1∶100，濕盒內(nèi) 37 ℃孵箱內(nèi)放置30 min，PBS漂洗5 min×3次；緩沖甘油封片；將制備的樣品放在激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，在倒置顯微鏡下尋找細(xì)胞后轉(zhuǎn)到激光光源進(jìn)行掃描；(3)透射電鏡掃描觀察。

2 結(jié) 果

2.1 組織工程皮膚定向誘導(dǎo)分化的條件 各組EGF作用于組織工程皮膚時(shí)，均可見(jiàn)皮膚熟化程度較高，表皮分化良好，表真皮結(jié)合較好，但5 ng/mL EGF未見(jiàn)明顯的表皮細(xì)胞向凝膠內(nèi)生長(zhǎng)；10 ng/mL EGF時(shí)表皮細(xì)胞向凝膠內(nèi)生長(zhǎng)，但未見(jiàn)明顯的管腺樣結(jié)構(gòu)。15 ng/mL及20 ng/mL EGF作用于組織工程皮膚時(shí)，可見(jiàn)表皮細(xì)胞向真皮基質(zhì)凝膠內(nèi)生長(zhǎng)，并出現(xiàn)管腺樣結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1。

A：EGF 5 ng/mL；B：EGF 10 ng/mL；C：EGF 15 ng/mL；D：EGF 20 ng/mL。

圖1 不同濃度的EGF作用于組織工程皮膚(×200)

2.2 管腔樣結(jié)構(gòu)的鑒定

2.2.1 組織學(xué)觀察 組織切片 HE 染色可見(jiàn)凝膠內(nèi)的細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)形成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔結(jié)構(gòu)的管壁由單層細(xì)胞構(gòu)成，中間可見(jiàn)較大腔隙，細(xì)胞質(zhì)紅染，部分細(xì)胞核位于基底部，顏色較深，部分細(xì)胞形態(tài)可見(jiàn)腔面窄、基底部大，排列有一定的極性，與汗腺分泌部管狀結(jié)構(gòu)相似，見(jiàn)圖2。

A：×100；B：×400。

圖2 60 μm冰凍切片HE染色

A：抗-CK18陽(yáng)性；B：抗-CK18陽(yáng)性；C：抗CEA抗體陽(yáng)性。

圖3 CLSM掃描下免疫熒光觀察

2.2.2 免疫熒光觀察 ESC和汗腺細(xì)胞均表達(dá)的CK19，在CLSM掃描下，利用抗-CK19抗體觀察凝膠中細(xì)胞的形態(tài)。發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔結(jié)構(gòu)由單層細(xì)胞構(gòu)成的管壁和中央空腔組成，與汗腺分泌部的管狀結(jié)構(gòu)相似(圖3A)。管腔樣結(jié)構(gòu)抗-CK18(圖3B) 和抗-CEA (圖3C)免疫熒光染色均表達(dá)陽(yáng)性。

3 討 論

汗腺是皮膚重要的附屬器之一，汗腺發(fā)育起始于胚胎的第11周左右， 31周左右便停止發(fā)育[3]。ESC是汗腺發(fā)育的基礎(chǔ)，成人時(shí)大部分定位于毛囊隆突部。有學(xué)者提出的隆突激活假說(shuō)認(rèn)為，當(dāng)干細(xì)胞所處的微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，細(xì)胞外的某些信息便可以通過(guò)整合素等傳遞給干細(xì)胞，以觸發(fā)其跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活干細(xì)胞的分化多潛能性[4]。所以ESC存在向毛囊上皮細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞、表皮基底細(xì)胞、汗腺腺上皮細(xì)胞分化的4條可能途徑。更多的實(shí)驗(yàn)也證明了隆突激活假說(shuō)的正確性[5-9]。

ESC的增殖與分化受到干細(xì)胞“壁龕(Niche)”的調(diào)控。干細(xì)胞“壁龕”即干細(xì)胞所處的微環(huán)境，通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)兩種方式調(diào)控著干細(xì)胞的增殖與分化。本研究認(rèn)為，EGF是ESC維持自我更新和分化的基礎(chǔ)，不同濃度的EGF可能導(dǎo)致干細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)歸。一方面，低濃度的EGF在體外維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)中起著重要作用，是培養(yǎng)ESC必不可少的培養(yǎng)基添加物。目前常用的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基如KSFM、Epilife中EGF的濃度為5 ng/mL。另一方面，EGF亦能促使干細(xì)胞的分化。有研究表明，表皮細(xì)胞不僅能表達(dá)EGF，同時(shí)也能表達(dá)其受體，呈自分泌作用，在表皮的組織學(xué)結(jié)構(gòu)中，從表皮基底層到棘細(xì)胞層細(xì)胞均包含有表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體[10]，且EGF受體在表皮成層期方能檢出，并隨胚齡延展而表達(dá)增多，這樣就為采用EGF誘控干細(xì)胞分化提供了理論依據(jù)。從組織發(fā)育學(xué)的角度講，表皮及皮膚附屬器同源(外胚層) ，即皮膚附屬器由表皮增生并分化而成?？梢哉J(rèn)為汗腺的發(fā)生，實(shí)質(zhì)上是在胚胎發(fā)生期由某種或多種因素誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞定向分化為汗腺細(xì)胞的過(guò)程，表皮干細(xì)胞充當(dāng)著不斷完善汗腺組織的角色[11]。Shikiji 等[12]將含表皮干細(xì)胞的人角質(zhì)形成細(xì)胞，接種于成纖維細(xì)胞與膠原材料的復(fù)合物中，進(jìn)行三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高濃度EGF(大于15 ng/mL)能夠誘導(dǎo)人工真皮內(nèi)出現(xiàn)汗腺導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)。鄧辰亮等[13]用高濃度的EGF(50 ng/mL、100 ng/mL)對(duì)二維培養(yǎng)的人表皮細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)人表皮干細(xì)胞增殖能力明顯，并表達(dá)汗腺相對(duì)特異性的標(biāo)志NHE-1及NKCC-1。

在本研究中，利用EGF誘導(dǎo)組織工程皮膚上的1代表皮干細(xì)胞，可見(jiàn)表皮細(xì)胞向真皮基質(zhì)凝膠內(nèi)生長(zhǎng)，出現(xiàn)的管腔樣結(jié)構(gòu)由一至兩層細(xì)胞構(gòu)成，中央有腔隙。將膠原凝膠中誘導(dǎo)的管腔樣結(jié)構(gòu)利用冰凍切片 HE 染色后觀察，該結(jié)構(gòu)由單層細(xì)胞構(gòu)成，胞核較大，偏向基底部，胞漿嗜酸性。細(xì)胞間的結(jié)合不緊密，沒(méi)有明顯的基底膜及肌上皮細(xì)胞，但與正常外泌汗腺分泌細(xì)胞HE染色有相似性。 免疫熒光利用ESC與腺上皮細(xì)胞共表達(dá)的細(xì)胞表面分子標(biāo)記CK19來(lái)染色凝膠中的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均有染色，其中可見(jiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán)形成管腔樣，同時(shí)構(gòu)成管腔樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞CK18 和 CEA染色均為陽(yáng)性表達(dá)。綜合HE染色、免疫熒光及透射電鏡結(jié)果分析，本研究認(rèn)為，所誘導(dǎo)的管腔樣結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞與汗腺腺上皮分泌部細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上有一定的相似性。

目前有大量證據(jù)表明了EGF在汗腺的發(fā)生及維持上的重要作用。Aybay等[14]報(bào)道了EGF在頂漿汗腺液中及外分泌汗腺液中的存在。Saga等[15]證實(shí)EGF分布在汗腺分泌部，發(fā)現(xiàn)在人發(fā)育及成熟的汗腺中高度表達(dá)EGF活性受體。研究者證實(shí)在外分泌汗腺的真皮導(dǎo)管中，EGF受體呈高水平表達(dá)[16]。產(chǎn)后應(yīng)用EGF治療X性連鎖無(wú)汗性外胚葉發(fā)育不良(XLHED)tabby鼠時(shí)，誘導(dǎo)出鼠爪部功能性汗腺的形成。反之，降低tabby鼠中EGFR的表達(dá)，則EGF誘導(dǎo)的上述功能性汗腺無(wú)法形成[17]。

從本研究的結(jié)果來(lái)看，低濃度的EGF(5～10 ng/mL)能夠使真皮凝膠上的表皮細(xì)胞分層良好，但未能促進(jìn)細(xì)胞向凝膠內(nèi)生長(zhǎng)；較高濃度的EGF(15～20 ng/mL)可以促進(jìn)表皮細(xì)胞向真皮基質(zhì)凝膠內(nèi)生長(zhǎng)，并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。該結(jié)果與有關(guān)研究有一致性[12]。但EGF是如何誘導(dǎo)干細(xì)胞出現(xiàn)分化并形成管腔樣結(jié)構(gòu)，具體機(jī)制仍然需要下一步的研究。

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Research on human epidermal stem cells differentiating into glandular epithelium-like cells in vitro*

WangYuanyuan1，YangGuihong2,YangTao2，TangShuqian2,WuJinjin2△

(1.DepartmentofPlasticandCosmeticSurgery;2.DepartmentofDermatology,DapingHospital,InstituteofFieldSurgeryResearch,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To investigate the influencing conditions of human epidermal stem cells(ESCs) differentiating into gland-like cells and to identify the induced tubular structure.Methods The ESCs were seeded onto compound polysaccharide shell dermal matrix and collagen gel,adding different concentrations of epidermal growth factor(EGF) and culturing by vertical shaking in vitro,the three dimensional culture and induced directional differentiation were performed.The means of HE staining,immunofluorescence and confocal laser scanning microscope were adopted to observe the conditions,morphology and phenotype change of ESCs directionally differentiating into glandular epithelium-like cells.Results 15-20 ng/mL EGF could induce ESCs in tissue-engineering dermis to grow into dermis and appear the gland-like structure.The HE staining in this structure showed its profile as a single layer with lacune in the middle compartment,eosinophilic cytoplasm,lightly stained.Under CLSM,by CK19 staining,the luminal structure in the middle of the cell mass was observed,while CK18 and CEA were expressed in this structure.Conclusion Under the induction of particular concentration of EGF,the in vitro cultured human ESCs seeded on the tissues engineering dermis could form into the tubular structure,which is similar to the in vivo sweat gland secretory cells in morphology and histology.

epidermal stem cell;glandular epithelium-like cell;differentiation;epidermal growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201244)。 作者簡(jiǎn)介：王元元(1981-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事表皮干細(xì)胞的研究?！?/p>

,E-mail：wjjjj@163.com。

R339.3+7

A

1671-8348(2017)10-1297-03

2016-10-18

2017-01-21)