王勇強　吳林波　陳帆

[摘要] 目的 探討miR-10b在人肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響。 方法 搜集蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院46例肝癌組織作為觀察組，同期選取18例正常肝組織作為對照組，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）方法檢測受試者miR-10b的表達水平，分析miR-10b表達與肝癌組織病理特征之間的關系；利用脂質(zhì)體2000向肝癌細胞系HepG2轉染人工化學合成miR-10b模擬物（miR-10b mimics）、miR-10b抑制劑（miR-10b inhibitor），同時設置陰性對照組（NC+脂質(zhì)體2000），采用MTT實驗檢測HepG2肝癌細胞增殖能力，采用Transwell實驗及細胞劃痕實驗檢測HepG2肝癌細胞侵襲、遷移能力。 結果 肝癌組miR-10b水平較對照組明顯上調(diào)表達（P < 0.05），且肝癌轉移組miR-10b水平明顯高于未轉移組（P < 0.05）；miR-10b高表達組與低表達組患者性別、年齡、腫瘤分化程度、有無肝硬化以及腫瘤數(shù)量之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），肝癌患者miR-10b表達與肝癌是否轉移以及肝癌的美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期有關，且肝癌轉移患者miR-10b表達高于未轉移患者（P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表達高于Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05）；miR-10b過表達組HepG2細胞增殖能力明顯高于miR-10b抑制組，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞生長趨勢接近一致；miR-10b過表達組HepG2細胞侵襲、遷移能力較過表達陰性對照組均明顯增強，miR-10b抑制組HepG2細胞侵襲、遷移能力較抑制表達陰性對照組明顯減弱，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞侵襲、遷移能力基本一致。 結論 miR-10b在人肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織，抑制miR-10b表達可有效降低肝癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力。

[關鍵詞] miR-10b；肝癌；增殖；侵襲；轉移

[中圖分類號] R735.705 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（a）-0025-06

Effects of miR-10b on the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

WANG Yongqiang WU Linbo CHEN Fan▲

Department of Oncology， Urumqi General Hospital， Lanzhou Military Area Command， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830099， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-10b in human hepatocellular carcinoma and its effect on the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells. Methods Forty-six cases of hepatocellular carcinoma in Urumqi General Hospital， Lanzhou Military Area Command were collected as the observation group， and 18 cases of normal liver tissues were selected as the control group. The expression levels of miR-10b of the subjects were detected by quantitative Real-time PCR （qRT-PCR） method， the relationship between the expression of miR-10b and pathological features of tissue of hepatocellular carcinoma was analyzed； the artificial chemical synthesis miR - 10b mimics， miR-10b inhibitor were transfected into hepatocellular cell line HepG2 by lipofectamine 2000， and the negative control group （NC + lipofectamine 2000） was set. MTT assay was used to detect the proliferation capacity of HepG2 cells， and Transwell assay and cell scratch test were used to detect the invasion， migration capacity of HepG2 cells. Results The level of miR-10b in liver cancer group was significantly higher than that of control group （P < 0.05）， and the level of miR-10b in metastatic hepatocelluar carcinoma group was significantly higher than that of non-metastasis group （P < 0.05）； the differences of gender， age， tumor differentiation， liver cirrhosis or not， and cancer number between high expression of miR-10b group and low expression of miR-10b group were not statistically significant （P > 0.05）； the expression of miR-10b in patients with liver cancer was related to the transfer or not of liver cancer and the American Joint Committee on Cancer （AJCC） stage of liver cancer， and the expression of miR-10b in patients with metastatic hepatocelluar carcinoma was higher than that of non-metastasis patients （P < 0.05）， the expression of miR-10b in patients with Ⅲ-Ⅳ stage was higher than that of patients with Ⅰ-Ⅱ stage （P < 0.05）； the proliferation capability in excessive expression of miR-10b group was higher than that in miR-10b inhibition group， the growth tendency of HepG2 cells of excessive expression negative control group and suppression expression negative control group was almost the same； the invasion， migration capacity of HepG2 cells in excessive expression of miR-10b group was stronger than that of excessive expression negative control group， the invasion， migration capacity of HepG2 cells in miR-10b inhibition group was weaker than that of suppression expression negative control group， the invasion， migration capacity of excessive expression negative control group and suppression expression negative control group was almost the same. Conclusion The expression level of miR-10b in tissue of human hepatocellular carcinoma is significantly higher than that of normal hepatic tissue. The inhibition expression of miR-10b can effectively reduce the proliferation， invasion and migration capacity of hepatocellular carcinoma cells.

[Key words] miR-10b； Hepatocellular carcinoma； Proliferation； Invasion； Migration

原發(fā)性肝癌（HCC）是全球范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)病率及病死率在世界范圍內(nèi)均呈現(xiàn)明顯上升趨勢[2]。HCC早期發(fā)病無明顯癥狀，大多數(shù)患者確診時已為癌癥進展期，其發(fā)病機制復雜，目前臨床上仍缺乏有效的治療性藥物。肝癌細胞的侵襲轉移是導致肝癌患者死亡的主要原因，探究肝癌細胞的侵襲轉移機制對于臨床治療肝癌具有重要意義。近年來，微小RNA研究為腫瘤靶向研究提供了新的研究方向，成為近年來腫瘤研究的新熱點。相關研究表明[3-4]，微小RNA成員miR-10b在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達，且對腫瘤細胞的侵襲及轉移具有促進作用。本研究旨在探討miR-10b在人肝癌組織中的表達水平及其對肝癌細胞侵襲和轉移的影響，試圖為臨床診斷及治療肝癌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 搜集2015年2月～2016年2月蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）46例肝癌患者所切除的肝癌組織作為觀察組，所有患者肝癌組織切除前均未接受放化療或者其他生物治療。肝癌發(fā)生轉移24例，其中肝內(nèi)轉移6例，肝門淋巴結轉移5例，門靜脈癌栓4例，血管侵犯5例，網(wǎng)膜侵犯3例，膈肌侵犯1例；未轉移22例。選取同期18例正常肝組織作為對照組，其中肝破裂15例，肝臟血管瘤7例，對照組肝組織均經(jīng)病理證實為無肝硬化及肝炎組織。所有標本均采用液氮速凍，并于-80℃保存。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，且臨床標本采集符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.1.2 細胞系 人肝癌細胞系HepG2（來自于我院肝膽外科實驗室）。

1.1.3 主要試劑與儀器 Trizol、DEPC、反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa公司，日本）；紫外分光光度計（Beckman公司，美國）；RT-PCR儀（ABI7700，美國ABI公司）；脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司，美國）；miR-10b mimics、miR-10b inhibitor、陰性對照NC（吉瑪公司，上海）；Matrigel（BD公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）；MTT試劑盒（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 Real-Time RT-PCR Trizol法分別提取肝臟組織總RNA，所提RNA經(jīng)OD測定，OD260/OD280比值均在1.8～2.0，代表所提RNA為高純度的RNA，沒有蛋白質(zhì)和DNA殘留。28 s和18 s兩條條帶亮度比值基本符合比值2∶1，說明RNA完整性好，無降解（圖1）。按照反轉錄試劑盒進行反轉錄。Real-Time RT-PCR所用引物由生物工程（上海）有限公司合成，序列如表1所示。Real-Time RT-PCR反應選用SYBR Prime Script RT-PCR Kit miRNA定量擴增體系進行，利用實時熒光定量PCR儀進行反應擴增。反應總體積10 μL：cDNA 1 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，引物0.4 μL，RNase H2O up to 10 μL。實時熒光定量PCR反應條件為：95℃預變性15 min，95℃ 15 s，55℃ 20 s，70℃ 30 s進行30個循環(huán)。以RNA U6為內(nèi)參，每個樣品均設置3個復孔，結果采用2-ΔΔCT方法處理，其中ΔΔCT=（CTmiRNA-10b-CTU6）觀察組-（CTmiRNA-10b-CTU6）對照組。

1.2.2 細胞轉染 將HepG2細胞分為4組，分別標記為miR-10b抑制組、抑制表達陰性對照組、miR-10b過表達組、過表達陰性對照組。HepG2細胞消化并計數(shù)，取3×105個肝癌細胞接種于制備好的平板上，過夜培養(yǎng)，鏡下觀察細胞密度達40%時即可進行轉染。利用脂質(zhì)體2000向miR-10b抑制組轉染miR-10b inhibitor，向抑制表達陰性對照組轉染anti-NC，向miR-10b過表達組轉染miR-10b mimics，向過表達陰性對照組轉染miR-NC。所有操作嚴格按照試劑操作說明書進行。

1.2.3 MTT實驗 采用MTT實驗檢測轉染后HepG2肝癌細胞增殖能力，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，分別轉染24、48、72、96 h，采用酶聯(lián)免疫分析儀，于波長490 nm處測定各個孔樣本吸光度，以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.4 Transwell實驗 轉染HepG2細胞培養(yǎng)48 h后消化并計數(shù)，取1×105個細胞置于已滅菌1.5 mL EP管中，滴加200 μL空白培養(yǎng)基重懸細胞，按照Transwell小室試劑盒說明嚴格操作（侵襲實驗Transwell小室需鋪Matrigel膠，遷移實驗則不需要），常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，95%酒精固定，經(jīng)結晶紫溶液染色后，200×顯微鏡下，每個樣本隨機選取5個視野計數(shù)。

1.2.5 細胞劃痕實驗 轉染后HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，細胞密度達75%～80%時，用滅菌過的黃色槍頭垂直劃線，PBS洗去劃下細胞，加入空白培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h進行拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

利用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組與對照組中miR-10b表達水平比較

利用Real-Time RT-PCR方法，在內(nèi)參基因RNA U6 Ct值差異無統(tǒng)計學意義的情況下，采用2-ΔΔCT方法計算miR-10b相對表達量，以對照組中一個miR-10b表達水平設置為1，肝癌組miR-10b水平較對照組明顯上調(diào)表達（P < 0.05），且肝癌轉移組miR-10b水平較肝癌未轉移組明顯上調(diào)表達（P < 0.05）。見圖2。

2.2 miR-10b表達與肝癌病理特征關系

根據(jù)肝癌患者miR-10b表達水平中位數(shù)，將46例肝癌患者分為miR-10b高表達組與低表達組。結果表明，兩組患者性別、年齡、腫瘤分化程度、有無肝硬化以及腫瘤數(shù)量之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），肝癌患者miR-10b表達與肝癌是否轉移以及肝癌的美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期有關，且肝癌轉移患者miR-10b表達高于未轉移患者（P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表達高于Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05）。見表2。

2.3 轉染HepG2細胞后miR-10b表達水平

Real-Time RT-PCR結果可見，miR-10b過表達組miR-10b水平明顯高于過表達陰性對照組（P < 0.05），miR-10b抑制組miR-10b水平明顯低于抑制表達陰性對照組（P < 0.05），過表達陰性對照組miR-10b水平與抑制表達陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），轉染成功，可用于后續(xù)研究（圖3）。

2.4 miR-10b表達對肝癌細胞增殖能力影響

MTT增殖實驗結果可見，miR-10b過表達組HepG2細胞增殖能力明顯高于miR-10b抑制組，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞生長趨勢接近一致，HepG2細胞增殖能力介于miR-10b過表達組與miR-10b抑制組之間（圖4）。

2.5 miR-10b表達對肝癌細胞侵襲及遷移能力影響

Transwell侵襲實驗，肝癌細胞結晶紫染色后，200×顯微鏡下觀察結果顯示，miR-10b過表達組HepG2細胞侵襲能力較過表達陰性對照組明顯增強（P < 0.05），miR-10b抑制組HepG2細胞侵襲能力較抑制表達陰性對照組明顯減弱（P < 0.05），過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞侵襲能力基本一致（圖5）。

Transwell遷移實驗，肝癌細胞結晶紫染色后，200×顯微鏡下觀察結果，miR-10b過表達組HepG2細胞遷移能力較過表達陰性對照組明顯增強（P < 0.05），miR-10b抑制組HepG2細胞遷移能力較抑制表達陰性對照組明顯減弱（P < 0.05），過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞遷移能力基本一致（圖6）。

細胞劃痕實驗結果可見，miR-10b過表達組HepG2細胞遷移能力明顯增強，細胞培養(yǎng)72 h后，miR-10b過表達組HepG2細胞劃痕基本愈合，而過表達陰性對照組、miR-10b抑制組、抑制表達陰性對照組HepG2細胞劃痕均未愈合，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞愈合程度均高于miR-10b抑制組（圖7）。

3 討論

HCC是起源于肝臟上皮細胞或者間葉組織的肝臟惡性腫瘤[5]，早期患者無特異性癥狀，中晚期則出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、乏力、腹脹、消瘦以及進行性肝腫大等癥狀[6-7]。目前關于HCC轉移的分子機制尚未完全清楚[8]，臨床上仍缺乏特異、敏感的HCC轉移標志物，尋找與HCC遷移密切相關的新型生物學標志物，對于探究HCC侵襲及遷移機制以及為臨床診斷、治療HCC提供新靶點都具有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類真核生物內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的單鏈RNA，長度21～25個核苷酸[9-10]。miRNA僅占人類基因組序列1%～3%，卻參與調(diào)控生物體30%以上基因編碼，在生物體胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、凋亡等方面都扮演著重要角色。相關研究表明[11]，超過50%的miRNA位于染色體易發(fā)生缺失、突變和移位的脆性區(qū)域，而這些區(qū)域與癌癥腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)為抑癌或者促癌基因，參與腫瘤多條信號通路的傳導，許多miRNA被證實參與人類乳腺癌[12]、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌等腫瘤的侵襲與凋亡。因此，miRNA研究為腫瘤靶向診斷及治療提供了新的研究方向，成為了目前腫瘤研究的新熱點。miR-10b是位于2p31.1的miRNA家族成員[13]，該區(qū)域為調(diào)控生物體增殖分化的重要調(diào)控區(qū)域，與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著密切聯(lián)系，因此，miR-10b極有可能參與腫瘤進展[14-16]。已報道研究表明[17-18]，miR-10b在乳腺癌、食管癌等腫瘤發(fā)展中起促進腫瘤細胞轉移及侵襲作用，但有關miR-10b在HCC中生物學功能研究較少，因此，本研究旨在探討miR-10b在人肝癌組織中的表達水平及其對肝癌細胞侵襲和遷移的影響。

本研究結果表明，肝癌組miR-10b水平較對照組明顯上調(diào)表達，且miR-10b表達與肝癌是否轉移以及肝癌AJCC分期有關，肝癌轉移患者miR-10b表達高于未轉移患者，AJCC Ⅲ～Ⅳ期患者miR-10b表達高于AJCC Ⅰ～Ⅱ期，提示miR-10b表達與肝癌轉移及進展有關；轉染HepG2細胞后，miR-10b過表達組miR-10b水平明顯高于過表達陰性對照組，miR-10b抑制組miR-10b水平明顯低于抑制表達陰性對照組，過表達陰性對照組miR-10b水平與抑制表達陰性對照組比較無明顯差異，說明miR-10b mimics轉染后，HepG2細胞中miR-10b明顯上調(diào)表達，而miR-10b inhibitor轉染后，HepG2細胞中miR-10b明顯下調(diào)表達，且anti-NC與miR-NC轉染后，HepG2細胞中miR-10b表達水平相一致，提示轉染成功，可進行下一步實驗研究；MTT實驗結果顯示，miR-10b過表達組HepG2細胞增殖能力明顯高于miR-10b抑制組，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞生長趨勢接近一致，HepG2細胞增殖能力介于miR-10b過表達組與miR-10b抑制組之間，提示miR-10b mimics明顯促進HepG2細胞增殖，而miR-10b inhibitor可顯著抑制HepG2細胞增殖；Transwell及細胞劃痕實驗結果顯示，miR-10b過表達組HepG2細胞侵襲、遷移能力較過表達陰性對照組均明顯增強，miR-10b抑制組HepG2細胞侵襲、遷移能力較抑制表達陰性對照組明顯減弱，過表達陰性對照組與抑制表達陰性對照組HepG2細胞侵襲、遷移能力基本一致，說明miR-10b mimics轉染后，HepG2細胞侵襲、遷移能力明顯增強，而miR-10b inhibitor轉染后，HepG2細胞侵襲、遷移能力明顯減弱，提示miR-10b表達與HepG2細胞侵襲、遷移密切相關，miR-10b過表達可促進HepG2細胞的增殖、侵襲及遷移，反之，抑制miR-10b表達可抑制HepG2細胞的增殖、侵襲及遷移。

綜上所述，本研究結果表明，miR-10b在人肝癌組織中的表達水平明顯高于正常肝組織，抑制miR-10b表達可有效降低肝癌細胞的侵襲、遷移及增殖能力，因此推測miR-10b可作為診斷HCC的一種新型腫瘤標志，具有很大的研究前景。

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（收稿日期：2016-08-06 本文編輯：張瑜杰）