陳香波 劉 楊 趙明水 涂淑萍

(1.上海市園林科學規(guī)劃研究院 上海 200232； 2. 上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心 上海 200232；3.江西農(nóng)業(yè)大學園林與藝術(shù)學院 南昌 330045； 4.浙江天目山國家級自然保護區(qū)管理局 杭州 311300)

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極度瀕危樹種羊角槭的種胚發(fā)育與休眠解除

陳香波1,2劉 楊1,3趙明水4涂淑萍3

(1.上海市園林科學規(guī)劃研究院 上海 200232； 2. 上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心 上海 200232；3.江西農(nóng)業(yè)大學園林與藝術(shù)學院 南昌 330045； 4.浙江天目山國家級自然保護區(qū)管理局 杭州 311300)

【目的】 揭示羊角槭的種胚發(fā)育與萌發(fā)抑制機制，獲得破除休眠、提高種子發(fā)芽率的有效方法，以提高種群繁育效率，擴大羊角槭種群數(shù)量以緩解目前極度瀕危的生存現(xiàn)狀。【方法】 連續(xù)3年調(diào)查統(tǒng)計浙江天目山自然保護區(qū)2株人工種植羊角槭種胚發(fā)育結(jié)實情況，通過白菜種子發(fā)芽試驗研究種子不同部位(外種皮、內(nèi)種皮、種胚)的萌發(fā)抑制作用，并通過不同處理(剝除外種皮、激素浸種與低溫沙藏)探索打破種子休眠促進萌發(fā)的方法?！窘Y(jié)果】 羊角槭種胚發(fā)育不良且存在單株個體間差異，3年平均飽滿種胚率僅9.73%～33.98%，飽滿種胚平均生活力52.22%，飽滿種胚率低于其他槭屬植物。羊角槭內(nèi)、外種皮與種胚均存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，外種皮與種胚提取物對于白菜種子的萌發(fā)抑制作用更強； 內(nèi)源ABA含量測試發(fā)現(xiàn)，種胚ABA含量最高，達1 818.58 ng·g-1，其次為外種皮1 053.34 ng·g-1、內(nèi)種皮859.05 ng·g-1，種子內(nèi)各組織的萌發(fā)抑制作用與內(nèi)源ABA含量直接相關(guān)； 采用不同處理方法(剝除外種皮、激素浸種與低溫沙藏)打破休眠試驗發(fā)現(xiàn)，未剝除種皮種子低溫沙藏及種子剝皮室溫沙藏均不能萌發(fā)，而剝?nèi)ネ夥N皮種子經(jīng)一定時間的低溫沙藏可打破胚休眠，使得種子萌發(fā)率提高到30%； 剝?nèi)ネ夥N皮種子進行不同激素(GA3，6-BA)、不同濃度與浸種時間處理，發(fā)現(xiàn)激素浸種時間對于羊角槭種子發(fā)芽率有極顯著影響(P<0.01)，浸種激素種類或濃度均對羊角槭種子發(fā)芽率影響不顯著(P>0.05)； 對剝除外種皮種子配合適當濃度的外源激素(GA3，6-BA)浸種處理再行低溫沙藏可提高羊角槭種子發(fā)芽率，其中以100 mg·L-1GA3或200 mg·L-16-BA 浸種12 h效果最好，種胚發(fā)芽率分別達到46.67%與43.33%，可作為羊角槭打破休眠促進萌發(fā)的適合方法推薦應(yīng)用?！窘Y(jié)論】 羊角槭種子敗育率高、空癟現(xiàn)象嚴重，這與花粉供應(yīng)限制有關(guān)，異株授粉作為自交補充有助于授粉成功、胚發(fā)育，在構(gòu)建保護群落時應(yīng)避免分散、零散的種植，減小個體間距、促進異交結(jié)實，以提高種群繁育效率； 羊角槭種子同時存在外種皮強迫休眠和胚休眠，內(nèi)源ABA 是種子萌發(fā)的主要抑制物質(zhì)； 通過剝除外種皮結(jié)合激素浸種、低溫沙藏能夠提高種子萌發(fā)率。該研究對于擴大羊角槭種群規(guī)模、實現(xiàn)這一極小種群樹種的種群恢復與可持續(xù)保育目標具有重要意義。

羊角槭； 種胚發(fā)育； 種子休眠； 種子萌發(fā)； 休眠解除

羊角槭(Aceryangjuechi)為槭樹科(Aceraceae)槭屬(Acer)落葉喬木， 20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)于浙江臨安天目山海拔750～900 m的亞熱帶常綠、落葉闊葉混交林中，當時野外僅殘存4株(方文培， 1981; 裘寶林， 1993)，為中國極度瀕危物種，國家二級保護植物(中國科學院植物研究所， 1987)。羊角槭系古老的殘遺種，與產(chǎn)自日本的日本羊角槭(Acermyabei)關(guān)系密切，對研究東亞植物區(qū)系的起源、演化以及古氣候、古地理變遷，具有重要價值。羊角槭樹形優(yōu)美、樹冠挺拔，翅果似羊角而得名，也是優(yōu)良的園林綠化樹種。

近年來由于低溫凍害、植株衰退等原因，野生殘存的幾株羊角槭相繼死亡，生存形勢異常嚴峻。在國家林業(yè)局新近制定的《全國極小種群野生植物拯救保護工程規(guī)劃(2011—2015年)》中，羊角槭被明確列入一期拯救保護的120種極小種群植物名錄中，為9種野外數(shù)量不足10株的野生植物之一，屬極度瀕危、瀕于滅絕的物種，亟待加強保護。迄今，有關(guān)羊角槭的研究報道資料甚少, 僅有個別關(guān)于光合熒光特性以及基因組DNA 提取分析親緣關(guān)系方面的報道(鐘泰林等, 2009； 錢永生等, 2007； 李倩中等, 2010)，對其生態(tài)習性與生殖生物學方面缺乏系統(tǒng)了解，人工繁殖不夠成熟。

羊角槭天然更新能力弱，天目山自然保護區(qū)人工種植保留的15株已開花羊角槭樹下及周圍未發(fā)現(xiàn)1株更新幼苗。羊角槭種子敗育率高、空癟現(xiàn)象嚴重，發(fā)芽率極低(不及1%)，當?shù)亓謭鲭m經(jīng)多年的人工繁殖，保存至今也不過百株。以現(xiàn)有的繁殖方法，不僅不能有效擴大羊角槭種群、解除其極度瀕危的境地，更無法滿足園林應(yīng)用種苗需求，因此提高繁殖效率已成為當前羊角槭種質(zhì)保護所要面對的首要問題。

本研究通過對羊角槭種子不同部位(外種皮、內(nèi)種皮、胚)內(nèi)源萌發(fā)抑制測試研究羊角槭休眠的內(nèi)在機制，并采取不同措施(剝?nèi)ネ夥N皮、激素浸種)促進萌發(fā)試驗，探索破除羊角槭種子萌發(fā)抑制、提高種子發(fā)芽率的適合方法，為加快羊角槭種群繁育、擴大個體數(shù)量，緩解其極度瀕危的生存現(xiàn)狀探明出路。

1 材料與方法

1.1 羊角槭種胚發(fā)育統(tǒng)計

于2011年、2012年、2013年對天目山不同地點種植的2株羊角槭開花植株(記為A株與B株)分別采集種子，其中A株四周無遮擋、相對開闊，近旁緊鄰1株已開花結(jié)實羊角槭； B株處山凹處雜木林中，三面被高大樹木遮擋。2株均為1979年定植，樹齡均為37年。將采集的種子剝出種仁，分別統(tǒng)計含飽滿種胚、敗育種胚以及空癟的種子數(shù)量，計算不同發(fā)育狀況種胚比率。

1.2 種胚生活力測定

于果實成熟期采集浙江西天目山自然保護區(qū)內(nèi)人工種植的羊角槭大樹翅果，將果翅去除保留帶殼小堅果，置于陰涼干燥處陰干。按照ISTA(國際種子檢驗協(xié)會)種子檢驗規(guī)程，采用TTC染色法測定羊角槭種胚生活力(張志良， 1990； ISTA， 1996)。選取去除外種皮僅存內(nèi)種皮包裹形態(tài)完整種胚的飽滿種子30粒，分成3份，浸泡于溫水(30 ℃)中3 h，使種子充分吸水膨脹。剝?nèi)?nèi)種皮后放入50 mL小燒杯中，用0.5%的2，3，5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液在32 ℃恒溫箱中黑暗染色12 h后取出，清水沖洗，統(tǒng)計種胚生活力。

1.3 種子萌發(fā)抑制試驗

將羊角槭種子的外種皮、內(nèi)種皮、胚分離，取外種皮、內(nèi)種皮和胚各0.5 g在研缽分別研磨，研磨后放入150 mL錐形瓶中，分別加體積分數(shù)80%甲醇溶液100 mL，混合后放入4 ℃冰箱密閉浸提，每隔1 h震蕩1次，使充分浸提，60 h后取出過濾，得到醇提液。用此醇提液作為原液，將其稀釋為體積分數(shù)5%，10%， 20%，30%，40%不同濃度，同時取80%甲醇溶液作為原液，分別稀釋為體積分數(shù)5%，10%， 20%，30%，40%作為甲醇對照。用以上不同濃度甲醇提取液與甲醇溶液分別浸泡白菜(Brassicacampestris)種子3 h，每處理設(shè)3個重復，每重復100粒白菜種子。將浸泡好的白菜種子置于有濾紙的培養(yǎng)皿中，對應(yīng)加入一定量浸泡液使種子浸潤其中，于25 ℃恒溫全光照條件下培養(yǎng)，48 h后測定發(fā)芽率，以蒸餾水處理的白菜種子作為對照(吳小嫻等， 2008)。

1.4 種子內(nèi)源ABA含量測試

分別稱取一定量的外種皮、內(nèi)種皮與種胚用超細粉碎機研磨成干粉狀待測。采用UPLC-MS/MS測試羊角槭內(nèi)源ABA含量，該測試在北京林業(yè)大學公共分析測試中心完成。取約50 mg研磨好的植物樣品加入2 mL離心管中，加入0.5 mL提取液同時加入D6-ABA內(nèi)標，放入搖床搖30 min，然后加入1 mL的二氯甲烷，再繼續(xù)搖30 min，離心，取二氯甲烷相，氮吹儀吹干，加入0.1 mL的流動相初始液，進行UPLC-MS/MS檢測。檢測條件： Agilent 1260-AB Qtrap5500； 流動相： 乙腈∶0.1%的乙酸水，梯度洗脫0 min時，乙腈10%，到了5 min時，乙腈95%； 色譜柱： Agilent C18柱，1.8 μm，4.6 mm×50 mm； 質(zhì)譜： ESI源。

1.5 種子休眠解除處理

將陰干后種子在自來水中浸泡1周，去除漂浮上層種子，收集下層飽滿種子，進行處理。1)剝?nèi)ネ夥N皮處理： 用尖頭鑷子與手術(shù)刀片配合小心剝?nèi)ネ夥N皮，注意不傷害內(nèi)種皮，使內(nèi)種皮包裹種胚完整。2)外源激素處理(表1)： 將剝?nèi)ネ夥N皮的飽滿種子浸泡在不同濃度赤霉素GA3(50，100， 200 mg·L-1)或不同濃度細胞分裂素6-BA(50，100， 200 mg·L-1)溶液中，均分別處理12 h與24 h，期間每隔1 h震蕩搖動1次。

表1 種子外源激素處理Tab.1 Seed prosoaking with exogenous hormine

將上述種子于0.5‰KMnO4溶液中浸泡消毒10 min，自來水沖涮3次。與事先經(jīng)5‰KMnO4熏蒸消毒處理的濕沙相混合，置于0～5 ℃冰箱低溫層積。于2012年12月5日完成處理，10天觀察1次，至發(fā)現(xiàn)有內(nèi)種皮裂開、胚根伸出，開始有種子發(fā)芽始，每隔半月統(tǒng)計1次發(fā)芽率至不再出現(xiàn)種子發(fā)芽為止。及時將種胚裂開、胚根初伸長的解除休眠的種子播入萌發(fā)基質(zhì)中，萌發(fā)基質(zhì)為園土∶草炭∶珍珠巖=2∶2∶1(體積比)，使3種成分充分混合。發(fā)芽記錄以胚根突破種皮2 mm計為種子發(fā)芽[種子發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試飽滿種子總數(shù)×100]，每處理設(shè)3個重復，每重復10粒形態(tài)完整的飽滿種胚。以未剝?nèi)ネ夥N皮飽滿種子低溫沙藏為對照(CK-0)，剝?nèi)ネ夥N皮未進行激素處理種子分2份： 1份室溫沙藏(CK-N)，另1份進行低溫沙藏(CK-L)，沙藏及種子播種方法同上。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進行多因子方差分析(羅應(yīng)婷等， 2008)，對于差異顯著者，進一步用DPS統(tǒng)計軟件進行Duncan多重比較(唐啟義等， 2007)，字母法標記。做圖在Excel軟件下完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 種胚發(fā)育

對羊角槭植株不同年份采集的種子發(fā)育情況統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，羊角槭飽滿種胚率非常低，3年平均值僅33.98%(A株)或9.73%(B株)，而敗育、空粒所占比率較高，二者總和甚至超過總種子數(shù)的90%(B株)。種胚發(fā)育存在單株間差別，A株的飽滿種胚率(28.83%～39.34%)高于B株(4.92%～13.73%)，表明A株羊角槭結(jié)實優(yōu)于B株(圖1)。不同年份間種胚發(fā)育存在一定波動， 2011年為3年中結(jié)實最好的一年。與其他槭屬植物比較，羊角槭正常種胚率3年中最高僅39.34%，遠低于毛果槭(A.nikoense)92.50%、安徽槭(A.anhweiense)92.00%、橄欖槭(A.olivaceum)94.00%、昌化槭(A.changhuaense)91.50%和色木槭(A.mono)93.00%(石柏林等， 2006)，證實羊角槭種子敗育率高、空癟現(xiàn)象極為嚴重。

圖1 羊角槭種胚發(fā)育情況Fig.1 Embryo development of Acer yangjuechi seeds

圖2 羊角槭種子結(jié)構(gòu)與發(fā)育Fig.2 Seed structure and development of Acer yangjuechiA．翅果； B. 堅果； C. 飽滿種子； D. 去內(nèi)種皮種胚； E. 示子葉折疊狀種胚； F. 發(fā)育完全種胚； G. 干縮敗育種胚； H. 透明狀子葉敗育種胚； I. 黑化變質(zhì)無生活力種胚； J. 子葉折疊異常無生活力種胚。A. Samara; B. Nut; C.Well-developed seed; D. Endotesta-removed embryo; E. Cotyledon-enfolded embryo; F. Well-developed embryo; G. Aborted embryo; H. Transparent aborted embryo; I. Black vitality-loss embryo; J. Abnormal cotyledon-enfolded embryo.

羊角槭種子于當年10月份成熟，兩翅夾角幾近水平(圖2A)，除翅后的小堅果形似貝殼，卵圓形至長卵圓形，棕黃色，先端有突起的短鈍尖頭，上下兩面凹凸不平，有溝狀網(wǎng)紋(圖2B)，種臍呈扁長卵形。外種皮木質(zhì)化、堅硬，內(nèi)種皮薄膜質(zhì)。子葉扁平，依伏式折疊(圖2C，D，E)。

羊角槭飽滿種胚形態(tài)橢圓形，幾乎占滿外種皮包裹空間(圖2F)，而中途敗育種子表現(xiàn)出種胚干縮停止發(fā)育或僅發(fā)育透明狀子葉，個別種子出現(xiàn)黑化現(xiàn)象(圖2G-J)。飽滿種胚雖形態(tài)完整，但并非一定具備萌發(fā)能力，需對飽滿種胚生活力進行檢測。TTC染色法檢驗結(jié)果顯示，不同年份羊角槭飽滿種胚生活力在50.00%～53.33%間，變異幅度不大，平均52.22%(圖3)。飽滿種胚不具備生活力，主要體現(xiàn)在種胚發(fā)育不良出現(xiàn)異常情況，如子葉黑化變質(zhì)(圖2I)、種胚發(fā)白子葉折疊異常(圖2J)等，這部分種子即使給予適合的萌發(fā)條件也難以正常萌發(fā)。

圖4 羊角槭種子各部位浸提液對白菜種子萌發(fā)的抑制作用Fig.4 Inhabitation effect of extractant from different seed tissues of Acer yangjuechi on cabbage seeds germination圖中的不同字母表示有顯著性差異(P<0.01)。大寫字母表示同一浸提液濃度中蒸餾水對照、甲醇對照、外種皮提取液、內(nèi)種皮提取液、胚提取液五者之間的顯著性差異比較； 小寫字母表示蒸餾水對照、甲醇對照、外種皮提取液、內(nèi)種皮提取液、胚提取液在不同浸提液濃度間的差異顯著性比較。Different letter means significant influence(P<0.01). Capital letter means significant level among CK of distilled water, CK of manthanol, extractant of testa, extractant of endotesta, and extractant of embryo at the same concentration. Small letter means significant level among the different concentration extractants including CK of distilled water, CK of manthanol, extractant of testa, extractant of endotesta, and extractant of embryo.

圖3 羊角槭種胚生活力Fig.3 Viable embryo rate of Acer yangjuechi

2.2 種子萌發(fā)抑制作用

羊角槭外種皮、內(nèi)種皮和種胚提取液對白菜種子萌發(fā)的抑制結(jié)果見圖4。種子各部分(外種皮、內(nèi)種皮、種胚)均存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，各濃度提取液較甲醇對照白菜種子發(fā)芽率均有所降低，濃度超過10%以上時，與甲醇對照間差異極顯著(P<0.01)。隨提取液濃度升高，白菜種子發(fā)芽率呈下降趨勢，對于白菜種子萌發(fā)的抑制作用增強，不同提取液濃度間差異達到極顯著水平(P<0.01)。濃度為30%的外種皮、種胚提取液已完全抑制白菜種子萌發(fā)，發(fā)芽率降為0，內(nèi)種皮提取液濃度達40%時仍有極個別白菜種子發(fā)芽(發(fā)芽率2%)，說明外種皮與種胚提取液對于白菜種子發(fā)芽抑制作用更強。

2.3 種子內(nèi)源ABA含量

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法對羊角槭外種皮、內(nèi)種皮、種胚內(nèi)源ABA含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)羊角槭種子內(nèi)源ABA含量異常高，其中種胚ABA含量最高，達1 818.58 ng·g-1，其次為外種皮1 053.34 ng·g-1、內(nèi)種皮859.05 ng·g-1，與種子各部位浸提液對白菜種子萌發(fā)的抑制作用相吻合。對比同是槭屬植物的色木槭成熟種胚ABA含量216.44 ng·g-1(楊玲等， 2012)，羊角槭種子內(nèi)源ABA含量異常之高，由此可斷定ABA即是自然條件下羊角槭種胚抑制萌發(fā)的關(guān)鍵化學物質(zhì)。

2.4 種子休眠的解除

2.4.1 剝皮與低溫沙藏處理對羊角槭種子萌發(fā)的影響 羊角槭外種皮堅硬、木質(zhì)化，種皮與種胚均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)。以帶種皮飽滿種子低溫沙藏及種子剝皮室溫沙藏，種子無任何反應(yīng)、發(fā)芽率為0； 而剝?nèi)ネ夥N皮、內(nèi)種皮包裹完整的飽滿種胚進行低溫沙藏，發(fā)芽率30%，與前二者差異達極顯著水平(P<0.01)(圖5)。隨沙藏時間延長，種胚逐漸由處理前的干癟表面皺褶而變得吸脹飽滿，2個月后開始種皮稍有裂開，有胚根伸出(圖6A)。將解除休眠種子播入萌發(fā)基質(zhì)中，外界溫度10～25 ℃出土萌發(fā)，3天后子葉伸展(圖6B)，5周后獲得帶2片真葉、正常健壯的實生苗(圖6C)，種子發(fā)芽率30%(圖5)。自低溫沙藏處理76天始持續(xù)近2個月時間陸續(xù)有種子發(fā)芽，至處理后130天，種子萌發(fā)結(jié)束，歷時54天。羊角槭外種皮不僅對種子吸水有物理性限制作用(許小連等， 2012a)，對種子萌發(fā)抑制作用也非常明顯，帶外種皮種子種胚幾乎無法突破外種皮抑制而正常萌發(fā)。室溫放置剝?nèi)ネ夥N皮種子不能萌發(fā)，說明羊角槭具有胚休眠特性，胚內(nèi)含有萌發(fā)抑制物質(zhì)，必須要經(jīng)過一定時間的低溫沙藏層積解除休眠才能夠萌發(fā)。

圖6 羊角槭種子萌發(fā)Fig.6 Germination of Acer yangjuechi seedsA.胚根伸出、種胚萌發(fā)； B.子葉苗； C.具2片真葉萌發(fā)苗。A. Radicel stretching and embryo germination; B. Seedling with cotyledon; C. Seedling with two euphylla.

圖5 剝皮及低溫沙藏處理對羊角槭種子萌發(fā)的影響Fig.5 Effect of testa-removing and stratification on seed germination of Acer yangjuechi圖中不同大寫字母表示種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.01)。Different letters mean significant influence(P<0.01).

2.4.2 不同激素處理濃度及時間對羊角槭種子萌發(fā)的影響 剝?nèi)ネ夥N皮種子進行不同激素(GA3，6-BA)浸種，不同濃度(50，100，150 mg·L-1)、不同時間(12，24 h)浸種處理對于羊角槭種子發(fā)芽產(chǎn)生一定影響(表2)。較未剝皮對照，所有激素處理均能顯著提高羊角槭種子發(fā)芽率，種子發(fā)芽率為10%～46.67%，其中以100 mg·L-1GA3浸種處理12 h(A1B2C1)發(fā)芽率最高，達到46.67%，其次是200 mg·L-16-BA浸種處理12 h(A2B3C1)，種子發(fā)芽率43.33%； 發(fā)芽率為30%～40%的激素處理分別是200 mg·L-1GA3浸種處理12 h(A1B3C1)、24 h(A1B3C2)或50 mg·L-16-BA浸種處理12 h(A2B1C1)。以上處理種子發(fā)芽率均超過剝?nèi)ネ夥N皮未進行激素處理的種子發(fā)芽率，表明適當?shù)募に亟N處理可以提高羊角槭種子發(fā)芽率，可在剝?nèi)ネ夥N皮基礎(chǔ)上做到進一步的提升； 其他激素處理則未能達到提升種子萌發(fā)效果。對GA3與6-BA 2種激素處理發(fā)芽結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)： GA3激素處理，在低濃度50 mg·L-1時隨浸種時間的延長(12 h→24 h)，發(fā)芽率有所提高，但濃度提高到100 mg·L-1以上時，隨浸種時間的延長，種子發(fā)芽率反而下降； 相同的浸種時間，浸種12 h，最大種子發(fā)芽率出現(xiàn)在100 mg·L-1時，而處理24 h，GA3200 mg·L-1時種子發(fā)芽率最大。6-BA激素處理，所有濃度下較長時間浸種(24 h)總是不及短時間浸種(12 h)發(fā)芽率高， 200 mg·L-1濃度下處理12 h是所有6-BA激素浸種處理中發(fā)芽率最高的，為43.33%?？傮w比較，100 mg·L-1GA3或200 mg·L-16-BA浸種12 h能提高羊角槭種子發(fā)芽率至40%以上接近50%，占有生活力種子的比率分別為89.37%與82.97%，說明該方法實現(xiàn)了絕大多數(shù)飽滿且具生活力種子的休眠解除萌發(fā)。

方差分析表明，激素浸種時間(C因子)對于羊角槭種子發(fā)芽率有極顯著影響(P<0.01)，浸種激素種類與濃度對羊角槭種子發(fā)芽率影響未達顯著水平(P>0.05)，各處理交互作用對發(fā)芽率沒有顯著影響。浸種12 h與24 h平均發(fā)芽率分別為33.33%和20.56%，兩水平間差異達到極顯著水平，無論是GA3或6-BA激素，浸種12 h有利于羊角槭種子萌發(fā)。激素不同濃度處理間Duncan多重比較，同樣是GA3浸種處理， 200 mg·L-1濃度下平均發(fā)芽率最高(35%)，顯著高于100 mg·L-1濃度(平均發(fā)芽率28.33%)與50 mg·L-1濃度(平均發(fā)芽率16.67%)； 6-BA浸種處理，不同濃度間差異未達顯著(P>0.05)。

表2 不同激素處理對羊角槭種子萌發(fā)的影響①Tab. 2 Effect of different hormone-presoaking on seed germination of Acer yangjuechi

①同一列中不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示不同處理間差異極顯著(P<0.01)。Different capital letter means extremely significant difference among treatments(P<0.01), and small letter means significant difference among treatments(P<0.05).

3 討論

3.1 槭屬植物繁育系統(tǒng)與種胚發(fā)育

槭屬植物的種胚發(fā)育與其繁育系統(tǒng)密不可分。大多數(shù)槭屬植物花為雜性，雄花和兩性花同株，稀單性、雌雄異株(方文培， 1981)。為使繁殖成功最大化，在槭屬植物中特化出雌雄異型異熟的繁育機制，即種群中包括2種交配型(柱頭先熟、花粉先熟)，當一個交配型釋放花粉時，另一交配型植株的柱頭正處于成熟可授期， 而后對換角色。雌雄異型異熟被認為是有花植物為避免自交、提高2種交配型互交成功的一種進化策略(Gleeson,1982; Pendletonetal., 2000; Kimuraetal., 2003; Baietal., 2007)。另一種更加特化的二重雌雄異型異熟在槭屬植物中也較為普遍，其特點是具有2期雄花，2期雄花差別很大，雌雄功能按照雄—雌—雄順序依次表達，其交配系統(tǒng)更為復雜。

槭屬植物雌花都具有單性結(jié)實傾向，子房雖然能夠繼續(xù)膨大，但僅有部分胚可以正常發(fā)育，部分敗育(De Jong， 1976)。落果現(xiàn)象在槭樹科植物中普遍存在，貫穿于開花后至果實成熟的整個時期，一般來說，中途脫落的果實大都為非正常授粉受精的果實(Shibataetal., 2009)。對于具有二重雌雄異型異熟繁育機制的槭屬植物來說，種群密度、交配型數(shù)量與比例等決定授粉成功的諸多因素均會影響種子發(fā)育水平。在一定距離范圍內(nèi)，色木槭不同交配型個體數(shù)量越多則授粉成功幾率越高，正常發(fā)育種子所占比率也越大，而隨不同交配型個體間距離變大，未成熟種子掉落和空種子比率也將隨之增多。不同交配型間分配數(shù)量和距離直接影響著授粉成功與種子結(jié)實。除此以外，交配型間授粉成功概率也存在不同，雌性先熟較雄性先熟交配型植株有著更少的未成熟種子掉落，該交配型獲得了更高的傳粉效率，正常種子結(jié)實率也稍高(Shibataetal., 2009)。

據(jù)筆者對羊角槭開花生物學觀察，同一植株上同時存在兩性花與雄花，個別年份還觀察到2種形態(tài)的雄花(許小連等， 2012b)，單個植株存在相對分隔的兩性花期(雌性成熟)與雄花期(雄性成熟)，兩性花期集中在1～2天，略先于雄花期，兩者成熟數(shù)量極為不對等，大多數(shù)兩性花柱頭成熟處于可授粉期時該樹體則只有不及10%雄花處于成熟期，只能更多依賴群體內(nèi)其他單株開放雄花提供花粉(待發(fā)表)，因此推測受花粉限制授粉成功率低是羊角槭種胚發(fā)育率不高的最主要原因。A株與B株羊角槭種子育性的不同，很可能與A株近旁緊鄰1株同樣開花結(jié)實羊角槭有關(guān)，羊角槭部分自交可育，距離相近的植株，便于彼此相互授粉，促成異交結(jié)實利于繁殖成功。至于其繁育系統(tǒng)是否確切為二重雌雄異型異熟性別分化系統(tǒng)還需不同年份跟蹤做進一步研究。

3.2 槭屬植物種子休眠原因與解除

槭屬植物種子具有休眠特性，需進行一定階段的低溫(5 ℃)潮濕冷藏以打破休眠促進萌發(fā)(Pinfieldetal.,1985)。槭屬植物的種子休眠分胚休眠與外種皮強迫休眠2種形式。胚休眠的內(nèi)因在于含有ABA等萌發(fā)抑制物質(zhì)阻礙了種子萌發(fā)，通過低溫潮濕冷藏可降低種子內(nèi)部游離ABA含量以打破休眠(Pinfieldetal., 1990)； 而對于外種皮強迫休眠類型，剝除種皮的種子在適合溫度光照條件下即可萌發(fā)，元寶槭(A.truncatum)即屬此類(孫秀琴等， 1991)。歐亞槭(A.pseudoplatanus)是槭屬中1個特例，完整帶外種皮種子需放入潮濕低溫(5 ℃)條件下數(shù)周得以萌發(fā)，若去除外種皮，僅有約50%種胚萌發(fā)而另一半種胚仍需經(jīng)低溫(5 ℃)濕藏一段時間萌發(fā)(Webbetal., 1969； Pinfieldetal., 1990)，歐亞槭既有胚休眠又兼具外種皮強迫休眠，其種子萌發(fā)抑制物質(zhì)， 除了胚中內(nèi)源ABA之外，還有中性復合物存在，種皮主要是阻礙胚內(nèi)萌發(fā)抑制物質(zhì)的對外溶解從而導致胚的被迫休眠(Webbetal.,1972)。從本研究結(jié)果看，羊角槭內(nèi)、外種皮以及胚內(nèi)均存在萌發(fā)抑制物質(zhì)，萌發(fā)抑制物質(zhì)被證明是高含量的內(nèi)源ABA，尤以種胚內(nèi)含量最高、抑制作用最強，其次為外種皮，說明內(nèi)源ABA 是羊角槭種子萌發(fā)的主要抑制物質(zhì)。羊角槭有著類似歐亞槭既有外種皮強迫休眠也具胚休眠的特征，但羊角槭的外種皮抑制作用不僅是機械阻礙種胚內(nèi)抑制物質(zhì)溶解，它本身就具有萌發(fā)抑制物質(zhì)存在，帶種皮種子即使低溫沙藏也不能萌發(fā)，而剝?nèi)ネ夥N皮種子100%都存在胚休眠，需要一定時間的低溫沙藏以打破胚休眠，而不像歐亞槭近一半種胚不存在胚休眠，可即時萌發(fā)。

打破胚休眠，低溫濕沙儲藏對大多數(shù)槭屬植物是適用的，較常溫儲藏，種子發(fā)芽率顯著提高且發(fā)芽時間提前(石柏林等， 2006)。赤霉素浸種有助于減少三角槭(A.buergerianum)低溫層積所需時間，但對發(fā)芽率增進效應(yīng)不明顯(肖志成等， 2008)； 激動素處理歐亞槭種子可以誘導未低溫濕藏種子萌發(fā)(Pinfieldetal., 1990)。不同處理打破槭屬植物種子休眠萌發(fā)都與其內(nèi)源ABA含量降低有著直接關(guān)系。具體到促進萌發(fā)的形態(tài)功能表現(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)細胞分裂素類激素(激動素)主要是刺激誘導胚根突出向地性生長，而赤霉素GA3則是靠加速子葉伸展而起作用(Pinfieldetal., 1990)。種子打破休眠的過程實際就是萌發(fā)促進因子(細胞分裂素、赤霉素)與萌發(fā)抑制物質(zhì)(ABA等)間相互“較量”的過程，就羊角槭而言，剝?nèi)ネ夥N皮種子避除了外種皮的抑制干擾，而種胚休眠的解除除了需要低溫濕沙儲藏外，促進萌發(fā)激素類的應(yīng)用無疑是有增進萌發(fā)的作用，較清水浸種處理，適合濃度的赤霉素或6-BA浸種都提升了種子萌發(fā)率，但對種子發(fā)芽時間提前作用不大。

4 結(jié)論

羊角槭種子敗育率高、空癟現(xiàn)象嚴重，與花粉供應(yīng)限制有關(guān)，異株授粉作為自交補充有助于授粉成功、胚發(fā)育，因此在實施羊角槭種群保護時應(yīng)考慮盡量縮短個體間距，避免現(xiàn)有天目山保護區(qū)內(nèi)人工種植羊角槭多呈分散、零散的種植，促進異交結(jié)實，劃出一定區(qū)域建立羊角槭適生群落實施就地保護，提高種群繁育效率。

羊角槭同時存在外種皮強迫休眠和胚休眠，內(nèi)源ABA 是種子萌發(fā)的主要抑制物質(zhì)； 通過剝除外種皮結(jié)合激素浸種、低溫沙藏能夠提高種子萌發(fā)率。通過低溫濕沙儲藏配合一定濃度激素應(yīng)用可使羊角槭種子萌發(fā)率達到46.67%，使得萌發(fā)種胚占到飽滿種胚的接近50%，這與飽滿種胚中52.22%是帶有生活力種胚相比，數(shù)值非常接近，說明大多數(shù)(89.37%)有生活力種子實現(xiàn)了打破休眠萌發(fā)，這對于極度瀕危樹種的種苗繁育有著極為重要的意義。進一步配合實施種苗培育工程，擴大羊角槭種群達到一定規(guī)模，將有望實現(xiàn)羊角槭這一極小種群瀕危植物種群恢復與保育的長遠目標。

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(責任編輯 徐 紅)

Embryo Development and Dormancy Releasing ofAceryangjuechi, the Extremely Endangered Plant

Chen Xiangbo1,2Liu Yang1,3Zhao Mingshui4Tu Shuping3

(1.ShanghaiAcademyofLandscapeArchitectureScienceandPlanningShanghai200232; 2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofLandscapingonChallengingUrbanSitesShanghai200232; 3.CollegeofLandscapeArchitectureandArt,JiangxiAgriculturalUniversityNanchang330045; 4.ManagementOfficeofTianmushanNationalNatureReserveHangzhou311300)

【Objective】The study was to reveal the seed dormancy mechanism ofAceryangjuechiand to obtain the effective dormancy-releasing method of improving seed germination, so as to improve the breeding efficiency, expand population size to mitigate the situation of being extremely endangered. 【Method】Seed development of two different individuals growing in National Nature Reserve of Tianmu Mountain, Zhejiang province, was tested in 3 successive years. Through cabbage seeds germination test, the germination inhabitation of testa, endotesta and embryo was conducted. The techniques for seed dormancy releasing were studied by treatment of hormone-presoaking or stratification of testa-removed seeds at 5 ℃. 【Result】Embryo ofAceryangjuechiwas poorly developed and differs between the two individuals. The average percentage of well-developed seeds ranged from 9.73% to 33.98% and the average rate of viable seeds was 52.22%. Compared with otherAcerplants, the lower percentage of well-developed seeds confirmed its high infertility rate. The methanol extractant from testa and embryo had the higher inhabitation effect on germination than that from endotesta which have a high correlation with the content of endogenous ABA. The content of endogenous ABA in embryo was the highest one, reaching 1 818.58 ng·g-1, followed by those in testa with a value of 1 053.34 ng·g-1and endotesta with a value of 859.05 ng·g-1. The complete seeds moist-stored at 5 ℃ and testa-removed seeds at room temperature can not germinate while the testa-removed seeds germinated and the germination rate increased significantly to 30%. And the treatment of presoaking seeds with 100 mg·L-1GA3or 200 mg·L-16-BA for 12 hours promoted seed germination rate reaching to 46.67% and 43.33% respectively. The duration of seeds-presoaking with hormone had a significant influence on germination rate of seeds(P<0.01)while hormone type and concentration didn’t present significant influence(P>0.05).【Conclusion】Seeds ofAceryangjuechioften has a high rate of infertility and become empty seeds, this is associated with limitation pollen supply. Outcrossing as a supplement to self-pollination favors pollination success and embryo development. Stands of the species should be planted in small tree-tree distance to promote outcrossing which leads to successful reproduction. Both forced dormancy by testa and embryo dormancy are existing in the seeds ofA.yangjuechi. The main inhibitor of seed-germination is the endogenous ABA. Low temperature sand stratification of testa-removed seeds combined with hormone-presoaking could improve germination rate. It is recommended as the method for seed dormancy-releasing. The study is of significant implication to population enlargement and sustainable conservation ofAceryangjuechi.

Aceryangjuechi; embryo development; seed dormancy; seed germination; dormancy releasing

10.11707/j.1001-7488.20170408

2016-05-05；

2016-11-09。

上海市綠化與市容管理局辰山植物園專項“幾種瀕危植物致瀕機制與種質(zhì)資源保護研究”(G102406)。

S723.1+3

A

1001-7488(2017)04-0065-09